公开/公告号CN104685360A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-06-03
原文格式PDF
申请/专利权人 比奥德希克斯股份有限公司;全球免疫股份有限公司;
申请/专利号CN201380043182.4
申请日2013-03-15
分类号
代理机构北京市柳沈律师事务所;
代理人闵丹
地址 美国科罗拉多州
入库时间 2023-12-18 09:08:58
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-02-13
授权
授权
2015-07-22
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/68 申请日:20130315
实质审查的生效
2015-06-03
公开
公开
对相关申请的交叉参考
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2012年6月26日提交的61/664,308 号美国临时专利申请和2012年6月26日提交的61/664,329号美国临时专利 申请的优先权的权益。美国临时专利申请号61/664,308和美国临时专利申请 号61/664,329各自的全部公开内容在此引入作为参考。
关于合作研究协议的声明
本发明由2012年2月22日生效的合作研究协议的双方或代表双方完 成。合作研究协议的双方是Biodesix，Inc.和GlobeImmune，Inc。
对序列表的参考
本申请含有一份通过EFS-Web电子提交的作为文本文档的序列表。 该命名为"12-621-PRO_ST25"的文本文档的字节数为19KB，录制于2013年 3月15日。该文本文档中包含的信息在此依据37 CFR§1.52(e)(5)全文引入 作为参考。
发明领域
本发明大致涉及引导癌症患者治疗方法的领域。更具体的，在一方面， 本发明涉及一种在治疗之前预测患者是否是可能从施用产生免疫应答的疗 法(例如，作为细胞免疫疗法试剂)中受益的一类患者中的一员的方法，所述 治疗单独使用或者配合标准抗癌药物和/或用于治疗癌症的其它治疗方案使 用。还公开了鉴定那些不太可能从产生免疫应答的疗法和/或使用产生免疫 应答的疗法配合标准化疗药物中受益的一类患者的方法。本公开的方法使用 从所述患者的血液来源的样品获得的质谱数据、经配置作为对所述质谱数据 进行操作的分类器的计算机、和包括来自其他癌症患者的分类标签谱的训练 集。
发明背景
癌症是一大类各种疾病的统称，其均涉及未受调控的细胞生长。在癌 症中，细胞不受控制地分裂和生长，形成恶性肿瘤，并侵入身体临近部分。 癌症还可能通过淋巴系统或血液扩散至身体更远的部分。根据美国国家癌症 研究所(NCI)跟踪的这些统计数据，在2012年美国估计新增癌症病例数为 1,638,910(不包括非黑素瘤皮肤癌)，而在美国每年死于癌症的数字估计为 577,190(http://cancer.gov/cancertopics/cancerlibrary/what-is-cancer)。存在对癌 症进行管理和治疗的选择。其主要包括手术(例如，肿瘤外科手术)、化疗、 放疗、靶向癌症治疗(例如，小分子药物或特异性靶向肿瘤生长和发展中涉 及的分子的单克隆抗体疗法)、和姑息治疗，或其中的一些组合(本文一起称 为“抗癌治疗”)。
额外的癌症治疗方法包括诱导、增强或抑制免疫应答的治疗策略，统 称为“免疫疗法”或“免疫治疗”(本文通常也会一般地称为“产生免疫应答的疗 法”)。最近，免疫疗法在晚期或转移性实体肿瘤治疗中已变得更相关。用于 癌症的免疫疗法通常是为了增强或刺激患者自身的免疫反应，以更好地控制 或消除癌细胞，并可能另外支持其他治疗如化疗、手术、放疗和靶向癌症疗 法的使用。这种用于肿瘤的免疫疗法的一些例子包括： (1)(Dendreon)，其中刺激树突状细胞以激活对抗原的细胞毒性 反应，用于晚期去势难治性前列腺癌；(2)T细胞过继转移以激活对癌症的细 胞毒性反应；(3)通过引入病毒来基因工程化T细胞，所述病毒引入经设计 能识别肿瘤抗原的T细胞受体；(4)Algenpantucel-L，一种包括被转染表达小 鼠α1,3-半乳糖基转移酶的具有潜在抗肿瘤活性的辐射同种异体胰腺癌细胞 的癌症疫苗；(5)基于病毒载体的免疫疗法；和(6)基于酵母的免疫治疗。
基于酵母的免疫治疗也被称为(GlobeImmune，Inc.， Louisville，Colorado)技术，通常指的是胞外(在其表面)、胞内(在内部或细胞 溶胶中)或胞外和胞内同时表达一种或多种异源靶抗原的酵母载体。基于酵 母的免疫治疗技术已有大致描述(参见，例如，美国专利号5,830,463)。一些 基于酵母的免疫治疗组合物及其制备和一般应用的方法，也详细描述于例如 美国专利号5,830,463，美国专利号7,083,787，美国专利号7,736,642，Stubbs 等人，Nat.Med.7:625-629(2001)，Lu等人，Cancer Research 64:5084-5088(2004)，以及Bernstein等人，Vaccine 2008Jan 24；26(4):509-21， 其各自全文引入作为参考。基于酵母的癌症免疫治疗描述于例如美国专利号 7,465,454，美国专利号7,563,447，美国专利号8,067,559，美国专利号 8,153,136，美国专利公开号2009-0098154，以及PCT公开号WO 07/133835， 其各自全文引入作为参考。
与其它免疫疗法相比，基于酵母的免疫治疗具有一种独特的能力，其 能诱导针对靶抗原的先天性免疫应答和大范围的适应性免疫应答，包括依赖 CD4的TH17和TH1 T细胞应答和抗原特异性CD8+T细胞应答，其包括细 胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，而均不需要使用外源性佐剂、细胞因子或其 它免疫刺激分子，这些物质有很多具有毒性问题。此外，基于酵母的免疫治 疗组合物抑制调节性T细胞(Treg)数和/或功能，从而增强效应T细胞应答， 后者通常可能受例如肿瘤存在的抑制。此外，与通过产生抗体应答进行免疫 的免疫治疗组合物相比，由基于酵母的免疫疗法引发的抗原特异性、广谱性、 和有效的细胞免疫应答被认为在靶向肿瘤细胞时特别有效，即使面对的可能 是抑制性的环境。由于这种类型的免疫疗法利用抗原呈递细胞的天然能力呈 现相关的免疫原，没有必要知道靶抗原的CTL表位或II类MHC表位的确 切身份来产生有效的基于酵母的免疫治疗，也不需要分离患者的任何免疫细 胞来产生免疫治疗。事实上，在一个基于酵母的免疫治疗组合物中可以靶向 多个CD4+和CD8+T细胞表位，所以使用算法和复杂的公式来确定假定的T 细胞表位或T细胞受体就被淘汰了。
已开发了一系列基于酵母的免疫治疗产品来针对由患者肿瘤表达的 突变Ras蛋白刺激免疫应答，包括GlobeImmune，Inc.目前处于临床研发的 被称为“GI-4000”的产品候选物。“Ras”这个名字是指一个发现 于细胞内，包括人类细胞的相关蛋白质家族。所有Ras蛋白家族成员属于一 类称为小GTP酶的蛋白质，其与细胞中传输信号(细胞信号转导)有关。在美 国每年大约有180,000新癌症病例中发现Ras突变，所属肿瘤的类型包括胰 腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、子宫内膜癌和卵巢癌、以及黑 色素瘤和多发性骨髓瘤。研究表明，Ras突变肿瘤对常规化疗和靶向药物的 应答通常低于正常Ras肿瘤。对于某些癌症，如NSCLC、结直肠癌，针对 表皮生长因子受体或EGFR的疗法已经改善了临床结果。然而，在结直肠癌 中尽管使用了EGFR靶向疗法，肿瘤中Ras突变的存在仍然关联不良预后。 同样的，其他研究已经表明，与那些接受同样的治疗时生存率改善的Ras正 常的患者相比，Ras突变结直肠肿瘤患者不能从另一种EGFR靶向剂——西 妥昔单抗治疗中受益。结果，Ras突变患者有更少的有效治疗选择。包含Ras 突变细胞的靶向减少可能导致罹患多种由于突变Ras在肿瘤生长中的作用 而导致的人类癌症的患者临床结果改善。然而，目前没有可用的靶向突变 Ras治疗的晚期临床试验。
免疫治疗领域的进展缓慢，但最近的临床成功对这种癌症治疗方法的 潜力给了大力支持。然而，在本领域有必要定义在治疗之前能识别将从免疫 治疗中获得对癌症的临床益处的患者和识别临床应答者和非应答者的生物 标志物。免疫疗法标志物的例子包括CD54表达和白介素12p70生产，但是 它们尚未被完全确认。还使用了几种细胞免疫标志物分析(细胞因子流式细 胞术、MHC四聚体、以及酶联免疫吸附测定(ELISPOT))。值得注意的是， 预测免疫疗法收益的分析需要是标准化的，以产生可复制的和可比较的结 果。这在本领域尚未完成。
在本领域，对于在治疗前判断给定的癌症患者是否可能从单独施用或 配合其它抗癌药物治疗施用的产生免疫应答的疗法中受益，或者相反的，对 于该治疗是否不太可能对给定癌症患者有益处的实用的、有效的检测存在需 求。本发明满足了这一需求。
与预测癌症患者从一些类型的药物中受益的能力有关的进一步有用 的现有技术包括美国专利号7,736,905，7,858,390；7,858,389，7,867,775， 8,024,282；7,906,342和7,879,620，以及2012年1月24日提交的未决的美 国专利申请系列号13/356,730和2011年2月22日提交的美国专利申请系列 号12/932,295，其作为美国2011/0208433公开，所有这些均归属于Biodesix， Inc。‘905专利和2011年2月22日提交的美国专利申请系列号12/932,295 在此引入作为参考。除其它方面，‘905专利描述了用于判断NSCLC癌症患 者是否可能从表皮生长因子受体(EGFR)靶向药物中受益的基于质谱的检测。 该检测在其商业版本作为“VeriStrat”而为人所知；在以下讨论中对“VeriStrat” 的参考将被理解为参考‘905专利中描述的检测。
发明简述
本发明大致涉及引导癌症患者治疗方法的领域。在一方面，对癌症患 者的这种治疗是对于癌症的免疫治疗，且在一方面，该治疗是基于酵母的癌 症免疫治疗，且在另一方面，该治疗是针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的 免疫治疗(即，其中至少一些肿瘤对于突变Ras蛋白是阳性的，通常通过检 测ras核苷酸序列突变来检测)。在一方面，该治疗是针对突变Ras阳性的胰 腺癌的基于酵母的免疫治疗。
更具体的，在一方面，本发明涉及一种在治疗启动之前预测患者是否 是可能从施用基于酵母的免疫应答生成型治疗(例如，作为细胞免疫疗法试 剂)中受益的一类患者中的一员的方法，所述治疗单独使用或者配合标准抗 癌药物治疗和/或用于治疗癌症的其它治疗方案。还公开了鉴定那些不太可 能应答基于酵母的免疫治疗和/或在标准化疗试剂中添加免疫治疗的一类患 者的方法。还公开了鉴定较少可能或者不可能应答基于酵母的免疫治疗，和 /或在标准化疗试剂和/或癌症的其它治疗(例如，手术切除)中添加免疫治疗 的患者的方法。
在另一方面，本发明涉及一种在治疗启动之前预测患者是否是可能从 施用针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗(例如，作为细胞免疫疗 法试剂)中受益的一类患者中的一员的方法，所述治疗单独使用或者配合标 准抗癌药物治疗和/或用于治疗癌症的其它治疗方案。还公开了鉴定较少可 能或者不可能应答针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗，和/或在 标准化疗试剂和/或癌症的其它治疗(例如，手术切除)中添加针对突变Ras阳 性癌症的基于酵母的免疫治疗的患者的方法。在一方面，突变Ras阳性癌症 是胰腺癌。作为一个例子，本文件描述了一种预测胰腺癌患者是否可能从施 用靶向突变Ras的基于酵母的免疫治疗(例如，作为GI-4000为人所知的一系 列产品，本文中有更详细描述)联合施用吉西他滨中受益的方法。
本公开内容的方法使用从所述患者的血液来源的样品获得的质谱数 据、经配置作为对所述质谱数据进行操作的分类器的计算机、和包括来自其 他癌症患者的分类标签谱的训练集。
申请人发现了一种在治疗之前预测患者是否是可能或不可能从施用 基于酵母的免疫应答生成型治疗(例如，作为细胞免疫疗法试剂)中受益的一 类患者中的一员的方法，所述治疗单独使用或者联合其它抗癌治疗使用。该 方法是基于血液来源的样品的质谱。血液来源的样品(例如，血清、血浆)的 使用是重要的，因为其通过对免疫系统的循环标记物进行考察而增加了检测 对免疫治疗总体敏感性的可能。此外，该方法可通过对血液来源的样品进行 简单的质谱检测而快速实施，而不必对患者样品进行复杂耗时的分析或从患 者中获得肿瘤样品。值得注意的是，申请人已经从获得样品的预处理中演示 了其检测的有效性。从而，该检测的现实应用中使用来自患者的预处理的样 品并预测患者是否可能，或不可能从基于酵母的免疫应答生成型治疗中受 益。
本公开的方法表现为实用的、有效的检测的形式，其可以在质谱仪(例 如，MALDI TOF设备)和经配置作为分类器起作用的通用计算机的帮助下实 现。
在一方面，一种预测癌症患者是否可能从单独施用或配合其它抗癌治 疗施用的基于酵母的免疫应答生成型治疗中受益的方法被描述为包括以下 步骤：
(a)获得患者血液来源的样品；
(b)对该样品进行质谱测定并从该样品获得质谱；
(c)在程序计算机中，对该质谱执行一个或多个预定义的预处理步骤， 在执行预处理步骤之后，在预定义的m/z范围内获取所述质谱中所选特征的 累积强度值，并将累积强度值与包括来自其他癌症患者的分类标签谱的训练 集进行比较并从而将质谱用分类标签进行分类。分类标签预测患者是否可能 或不可能从单独进行或配合其它抗癌治疗进行的免疫应答生成型治疗中受 益。例如，分类标签可采用“慢”或”快”的形式，“慢”表示患者可能受益且癌 症复发或疾病发展的时间相对较慢，而“快”可以表示患者不太可能受益且癌 症复发或疾病发展的时间相对较短。当然，可以使用其它相当的分类标签， 例如“有益”、“无益”、“好”、“差”等等。
在一方面，一种预测癌症患者是否可能从施用单独进行或配合其它抗 癌治疗进行的针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗中受益的方法 被描述为包括以下步骤：
(a)获得要单独或联合其它抗癌治疗的针对突变Ras阳性癌症的基于 酵母的免疫治疗的患者血液来源的样品；
(b)对该样品进行质谱测定并从该样品获得质谱；
(c)在程序计算机中，对该质谱执行一个或多个预定义的预处理步骤， 在执行预处理步骤之后，在预定义的m/z范围内获取所述质谱中所选特征的 累积强度值，在其进行针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗之前将 所述累积强度值与包含来自其他癌症患者的分类标签谱的训练集进行比较， 并从而将质谱用分类标签进行分类。分类标签预测患者是否可能或不可能从 单独进行或配合其它抗癌治疗进行的针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的 免疫治疗中受益。例如，分类标签可采用“慢”或”快”的形式，“慢”表示患者 可能受益且癌症复发或疾病发展的时间相对较慢，而“快”可以表示患者不太 可能受益且癌症复发或疾病发展的时间相对较短。同上，可以使用其它相当 的分类标签，例如“有益”、“无益”、“好”、“差”等等。在本发明的一个具 体实施方式中，进行该测试的癌症患者是胰腺癌患者。在这个实施方式中， 针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗可以表现为GI-4000(如下详述) 或等价物的形式。在一方面，针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗 协同吉西他滨或等价物对患者进行治疗。在本发明这一实施方式的一个方 面，突变Ras阳性癌症可包括但不限于胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结 肠直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑色素瘤和多发性骨髓瘤。
在一方面，在前文或本文其它部分描述的上述任一预测方法被认为可 用于其他癌症患者，包括例如，但不限于，非小细胞肺癌(NSCLC)患者和结 肠直肠癌(CRC)患者，其单独使用或作为其它标准抗癌剂的辅助使用，因为 在本公开中对于分类有用的质谱特征被认为除了其它方面之外还与细胞炎 症反应调节有关，且对很大范围的肿瘤类型都有预测作用，如2011年2月 22日提交的美国专利申请系列号12/932,295和之前引用的Biodesix，Inc的 专利中所阐述的那样。
在前文或本文其它部分描述的方法中使用的训练集优选采用来自其 他癌症患者的分类标签谱的形式，所述患者从单独施用或联合其它抗癌治疗 使用的免疫应答生成型治疗中受益或未受益。分类中使用的患者的谱中的特 征(m/z范围)可从形成训练集的患者的质谱分析中考察和选择。我们推测， 在从与预测NSCLC患者从表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-Is)中受益完全 不同的环境中开发的美国专利号7,736,905中使用的和本文表3和4中所列 举的一种或多种特征对本方法的使用是一个合适的特征集，因为他们可以关 联宿主对肿瘤的免疫学和炎性应答(参见美国专利申请公开2011/0208433)。 (用于分类的准确特征值可以例如根据在谱预处理过程中进行的谱对齐(偏移) 而不同于‘905专利和表1-4中所列的列表，因为样品类型实质上不同。)与‘905 专利(来自应答或不应答EGFR靶向药物的NSCLC患者的谱)中使用的训练 集不同，本方法中使用的训练集使用来自从单独施用或联合其它抗癌治疗使 用的免疫应答生成型治疗中受益和未受益的患者样品谱。应当注意，本申请 的样品类型不同于‘905专利中描述的血清和血浆。然而，如下述解释，在谱 中有其他特征可被用于对形成本文给出的训练集示例的谱的考察的分类。
在本公开的另一方面，一种治疗癌症患者的方法被描述为包括以下步 骤：根据前文或本文其它部分描述的任一预测方法进行测试，如果对谱的分 类标签表明患者可能从基于酵母的免疫应答生成型治疗中受益，即对该患者 单独施用或联合另一种抗癌剂施用基于酵母的免疫应答生成型治疗。
在一方面，在基于酵母的癌症免疫治疗之前、同时或之后对患者另外 用一种或多种额外的抗癌治疗。在一个实施方式中，该额外的抗癌治疗包括 但不限于化疗、放疗、靶向癌症治疗(例如，小分子药物或特异性靶向肿瘤 生长和发展中涉及的分子的单克隆抗体疗法)、和姑息治疗，或其任意组合。
在本公开的另一方面，描述了一种用基于酵母的癌症免疫疗法治疗癌 症患者的方法，包括如下步骤：对癌症患者施用基于酵母的癌症免疫治疗， 所述癌症患者是根据前文或本文其它部分描述的任何一种预测方法的测试 筛选的，其中对谱的分类标签表明该患者可能从基于酵母的癌症免疫治疗中 受益。在一方面，该患者在基于酵母的癌症免疫治疗之前、同时或之后被另 外进行一种或多种额外的抗癌治疗。在一个实施方式中，该额外的抗癌治疗 包括但不限于手术(例如，手术切除肿瘤)、化疗、放疗、靶向癌症治疗(例如、 小分子药物或特异性靶向肿瘤生长和发展中涉及的分子的单克隆抗体疗 法)、和姑息治疗，或其任意组合。
在本公开的另一方面，描述了一种用针对突变Ras阳性癌症的基于酵 母的免疫疗法治疗癌症患者的方法，包括如下步骤：根据前文或本文其它部 分描述的任何一种预测方法进行测试，如果对谱的分类标签表明患者可能从 针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗中受益，则施用针对突变Ras 阳性癌症的基于酵母的免疫治疗。在本发明的这一方面，该患者罹患癌症， 其中至少一部分来自该患者的肿瘤细胞中被鉴定有突变Ras。在一方面，在 进行针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗之前、同时或之后，该患 者被另外进行一种或多种额外的抗癌治疗。在一个实施方式中，针对突变 Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗是一系列称为GI-4000或等价物的基于 酵母的免疫治疗产品中的一种产品。在本发明这一实施方式的一个方面，突 变Ras阳性癌症可包括但不限于胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠 癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑色素瘤和多发性骨髓瘤。在一方面，该癌症是 胰腺癌。在一个实施方式中，额外的抗癌治疗包括但不限于手术(例如，手 术切除肿瘤)、化疗、放疗、靶向癌症治疗(例如，小分子药物或特异性靶向 肿瘤生长和发展中涉及的分子的单克隆抗体疗法)、和姑息治疗，或其任意 组合。在一方面，针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗协同吉西他 滨或等价物对患者进行治疗。在一个实施方式中，患者是胰腺癌患者，该治 疗包括一系列称为GI-4000或等价物的基于酵母的免疫治疗产品中的一种产 品(如下详述)，其单独施用或联合吉西他滨或等价物施用。在一方面，癌症 患者的肿瘤在用基于酵母的免疫治疗组合物治疗之前已被手术切除。
在本公开的另一方面，描述了一种用基于酵母的癌症免疫疗法治疗癌 症患者的方法，包括如下步骤：对癌症患者施用针对突变Ras阳性癌症的基 于酵母的癌症免疫治疗，所述癌症患者是根据前文或本文其它部分描述的任 何一种预测方法的测试筛选的，其中对谱的分类标签表明该患者可能从针对 突变Ras阳性癌症的基于酵母的癌症免疫治疗中受益。在本发明的这一方 面，该患者罹患癌症，其中来自该患者的肿瘤细胞中被鉴定有突变Ras。在 一方面，在进行针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗之前、同时或 之后，该患者被另外进行一种或多种额外的抗癌治疗。在一个实施方式中， 该针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗是一系列称为GI-4000或等 价物的基于酵母的免疫治疗产品中的一种产品。在本发明这一实施方式的一 个方面，突变Ras阳性癌症可包括但不限于胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、 结肠直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑色素瘤和多发性骨髓瘤。在一方面， 该癌症是胰腺癌。在一个实施方式中，额外的抗癌治疗包括但不限于手术(例 如，手术切除肿瘤)、化疗、放疗、靶向癌症治疗(例如，小分子药物或特异 性靶向肿瘤生长和发展中涉及的分子的单克隆抗体疗法)、和姑息治疗，或 其任意组合。在一方面，针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗协同 吉西他滨或等价物对患者进行治疗。在一个实施方式中，患者是胰腺癌患者， 治疗包括一系列称为GI-4000或等价物的基于酵母的免疫治疗产品中的一种 产品，其单独施用或联合吉西他滨或等价物施用。在一方面，癌症患者的肿 瘤在用基于酵母的免疫治疗组合物治疗之前已被手术切除。
在使用基于酵母的免疫治疗来治疗癌症患者的方法的任何一个方面， 该基于酵母的免疫治疗可包括但不限于一种完整的、热失活的重组酵母，其 已经表达至少一种与患者的肿瘤相关的或由其表达的癌症抗原。在一方面， 该酵母可以是来自一个属的酵母，包括但不限于，酵母属(Saccharomyces)。 在一方面，该酵母可以是来自一个种的酵母，包括但不限于，酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。
在另一方面，公开了一种预测癌症患者是否有可能从施用单独或与另 一种抗癌剂联合的基于酵母的免疫应答生成型治疗中受益的系统。该系统包 括从来自癌症患者的血液来源的样品产生质谱的质谱仪。该系统还包括储存 有来自其他癌症患者的分类标签谱的训练集的机器可读的存储器。该训练集 包括来自多个未从单独或与另一种抗癌剂联合施用的基于酵母的免疫应答 生成型治疗中受益的患者的分类标签谱，和来自多个从单独或与另一种抗癌 剂联合使用的细胞免疫治疗中受益的患者的分类标签谱。该系统进一步包括 配置为对所述质谱数据进行操作并使用训练集对质谱进行分类、为质谱产生 分类标签的计算机系统，其中分类标签被用于预测患者是否可能从施用单独 或与另一种抗癌剂联合施用的基于酵母的免疫应答生成型治疗中受益。
在另一方面，公开了一种预测癌症患者是否有可能从施用单独或与另 一种抗癌治疗联合施用的基于酵母的癌症免疫治疗中受益的系统。该系统包 括从来自癌症患者的血液来源的样品产生质谱的质谱仪。该系统还包括储存 有来自其他癌症患者的分类标签谱的训练集的机器可读的存储器。该训练集 包括来自多个未从单独或与另一种抗癌治疗联合施用的基于酵母的癌症免 疫治疗中受益的患者的分类标签谱，和来自多个从单独或与另一种抗癌治疗 联合施用的基于酵母的癌症免疫治疗中受益的患者的分类标签谱。该系统进 一步包括配置为对所述质谱数据进行操作并使用训练集对质谱进行分类、为 质谱产生分类标签的计算机系统，其中分类标签被用于预测患者是否可能从 施用单独或与另一种抗癌剂联合施用的基于酵母的癌症免疫治疗中受益。
在另一方面，公开了一种预测癌症患者是否有可能从施用单独或与另 一种抗癌治疗联合使用的针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗中 受益的系统。该系统包括从来自癌症患者的血液来源的样品产生质谱的质谱 仪。该系统还包括储存有来自其他癌症患者的分类标签谱的训练集的机器可 读的存储器。该训练集包括来自多个未从单独或与另一种抗癌治疗联合使用 的针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗中受益的患者的分类标签 谱，和来自多个从单独或与另一种抗癌治疗联合使用的针对突变Ras阳性癌 症的基于酵母的免疫治疗中受益的患者的分类标签谱。该系统进一步包括配 置为对所述质谱数据进行操作并使用训练集对质谱进行分类、为质谱产生分 类标签的计算机系统，其中分类标签被用于预测患者是否可能从施用单独或 与另一种抗癌治疗联合使用的针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治 疗中受益。在一方面，针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗是被称 为GI-4000的系列产品中的一种产品。在一方面，突变Ras阳性癌症选自胰 腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑色素 瘤和多发性骨髓瘤。在一方面，该癌症是胰腺癌。
附图简述
以下详述部分将参考附图，其通过实例的方式提供而并非限制，其中：
图1是显示胰腺癌二期临床实验设计的示意图，其中使用靶向突变 Ras阳性癌症的GlobeImmune的基于酵母的免疫治疗产品系列，称为 GI-4000。
图2A和2B是用Kaplan-Meier绘图显示的无复发生存率(RFS)和总存 活数(OS)，其说明了本公开的质谱方法鉴定那些很可能在胰腺癌治疗中从 GI-4000和吉西他滨的组合受益的患者的鉴定能力。
图3A-3F是在K最近邻分类算法中使用不同K值时，用Kaplan-Meier 绘图成对显示的患者的RFS和OS，所述患者是GI-4000和吉西他滨的胰腺 癌治疗研究中治疗组和对照组的患者。在图3A-3B中，K值为1，在图3C 和3D中，K值为3，在3E和3F中，K值为5。这些图显示了在治疗组中(患 者用吉西他滨和GI-4000两者治疗)，申请人的分类器区分受益和未受益患 者的能力，以及更进一步区分出治疗组中一些患者比对照组中一些患者表现 更差的能力。因此，这些图显示了申请人的质谱方法既预测可能从产生免疫 应答的疗法进行的治疗中受益的那些患者，也预测不可能从产生免疫应答的 疗法进行的治疗中受益的那些患者的能力。
图4A-4H是GI-4000和吉西他滨研究中一组RFS和OS的 Kaplan-Meier图，是用对血液来源的样品以150,000次射击(shots)进行 “DeepMALDI”质谱方法获得的谱的基础上的分类器定义的，其中采用本文 所述和美国临时专利申请61/652,394(2012年5月29日提交，其内容在此引 入作为参考)中描述的技术。图4A-4B、4C-4D、4E-4F和4G-4H各自分别代 表来自四个不同分类器的RFS和OS图，其基于用于分类的质谱的不同峰的 集合。
图5是对胰腺癌/GI-4000和吉西他滨研究中使用的分类器校验 (classifier validation)进行交叉验证过程的流程图。
图6是RFS“快”和”慢”组之间即时事件比(Hazard ratio)的分布图，所 述RFS来自图3E-3F的“稀释并发射(dilute-and-shoot)”分类器的交叉验证分 析。
图7A是GI-4000和吉西他滨研究的交叉验证分析的测试组中，"快" 和"慢"组中值RFS的分布图。图7B是GI-4000和吉西他滨研究的交叉验证 分析的测试组中，"快"和"慢"组之间中值差别的分布图。两个图都使用图 3E-3F的“稀释并发射”分类器。
图8是在图3E-3F的“稀释并发射”分类器的交叉验证分析中，对照组 (Control Arm)和测试集合(Test Set)的"快"和"慢"组中值分布图。
图9是在图3E-3F的“稀释并发射”分类器的交叉验证分析中，“慢” 组的对照组和测试集合的中值差别分布图。
图10A是在图3E-3F的“稀释并发射”分类器的交叉验证分析中使用不 同K值时，对照组的慢/快分类比例分布图。图10B是在K-最近邻分类器中 使用不同K值时，测试集合的即时事件比图。
图11是检测方法的流程图，所述方法预测癌症患者从单独或联合其 它抗癌剂使用的产生免疫应答的疗法中受益或不受益。
图12是系统示意图，所述系统对血液来源的患者样品进行检测并预 测患者是否可从单独或与另一种抗癌剂联合使用的免疫应答生成型治疗中 受益。
图13A-13L是一套在GI-4000和吉西他滨研究中RFS和OS的 Kaplan-Meier图，由基于从使用500,000发射数(shots)的DeepMALDI方法获 得的谱的分类器定义，其中使用2012年5月29日提交的未决的美国临时专 利申请系列号61/652,394中的技术，其内容在此引入作为参考。图13A-13B， 13C-13D，13E-13F，13G-13H，13I-13J，和13K-13L分别代表来自6个不同 分类器的RFS和OS图，其基于用来分类的质谱的不同的峰或特征的集合。
图14是来自使用150,000发射数的DeepMALDI方法获得的谱所开发 的图4A-4H的分类器的交叉验证分析的RFS的“快”和“慢”组的分布图。
图15是来自使用500,000发射数的DeepMALDI方法获得的谱所开发 的图13A-13L的分类器的交叉验证分析的RFS的“快”和“慢”组的即时 事件比分布图。
图16A-16C是对选定的质量/电荷范围(m/z比7,000-8,000)内同一样品 的3个MALDI质谱的描述，显示了随着增加的发射数，可检测峰内容的增 加。图16A的谱来自2,000发射数，图16B的谱来自100,000发射数，图16C 的谱来自500,000发射数。注意来自我们的方法的图16B和16C的谱是如何 揭示了丰富的样品谱信息，其在图16A的谱中不存在，图16A的谱基本表 现为噪音。
图16D和16E是显示从我们的DeepMALDI方法中获得的谱的巨大的 动态范围的进一步的质谱实例。在图16D中，一部分m/z范围为7140-7890 Da的谱以放大的方式显示在图16D的插图中，显示了在约500,000发射数 下获得的丰富的谱信息，所述谱以Y轴放大的方式在插图中显示，以显示 在m/z 9520左右的区域内额外的谱信息和峰，其在DeepMALDI方法中显示， 但是在典型的～1,000发射数的谱中不可见。
图17A是含有384个矩阵排列的样品点或“点”的MALDI-TOF靶 板的平面图。这些点由列数1...24和行数A...P确定，例如，左上方的点 被确定为A1。图17B是单一样品点P1的放大图，其被显示分为一个5X5 的直角坐标网，其具有X/Y位置坐标和位于点中心的原点(0,0)。直角坐标网 和位置坐标被用于自动光栅扫描方法以从如本文详述的点获得来自100,000 或更多发射数的谱。
图18是储存在图17A的MALDI板的单一点中的生物样品/基质混合 物的图。理想的，在该点中包含一个统一的、同质的结晶样品，如图18所 示。
图19是对用于从图18的点获得100,000或更多发射数的一种可能的 光栅扫描模式的描述。该点用光栅扫描多次，例如，25次。图19中显示的 每个符号集(三角、方块、X等)描述了一组个体的、离散的X/Y位置，其中 该点在单一光栅扫描中被扫描(发射)。在每个位置处，该点可进行多个发射 数，例如，700或800发射数。
图20是显示图19的光栅扫描模式对图18的样品点叠加的图。
图21是来自MALDI-TOF设备用户界面的截图，显示了对来自每个 位置/光栅800激光发射数的累加谱进行加和的命令，例如，在图17B或20 的光栅扫描中。
图22是一个样品点的一部分图像，显示样品/基质混合物未以空间均 匀方式结晶的区域。
图23是来自MALDI-TOF设备用户界面的截图，显示由设备中的照 相机捕捉的一部分点的图像，以及为了对这些点进行自动光栅扫描而对一组 点进行的选择。
图24是来自MALDI-TOF设备用户界面的另一幅截图，显示了各种 工具，它们用于谱的评价、谱的累加、和激光移动以不同方式穿过一个点而 发射。
图25是在数据采集中用于接受或拒绝瞬态谱的评价页面的截图。
图26是显示用于消除背景峰的排除列表的截图。
发明详述、工作实施例和实验结果
本文描述了用于免疫应答生成疗法的预测性测试、相关的分类器和系 统，以及对由这些测试、分类器和系统鉴定的患者的治疗。
特别的，本文描述了用于在治疗之前预测癌症患者是否有可能或不可 能从单独施用或联合其它抗癌治疗施用的基于酵母的免疫应答生成型治疗 中受益的方法。还描述了用于在治疗之前预测癌症患者是否有可能或不可能 从针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗中受益(例如，本文描述的 GI-4000)的方法，包括但不限于，胰腺癌。本发明的方法基于治疗前获得的 血液来源的样品(例如，血清或血浆)的质谱，以及基于由质谱揭示的样品中 的蛋白质组学签名(signature)的分类。血液来源的样品的使用是重要的，因 为其通过对免疫系统的循环标记物进行考察而增加了检测对免疫治疗总体 敏感性的可能。此外，该方法可通过对血液来源的样品进行简单的质谱检测 而快速实施，而不必对患者样品进行复杂耗时的分析或从患者中获得肿瘤样 品。该测试的用处在于，如果患者被预测可能受益，则可以对患者将获得改 善的表现抱有一些信心而继续治疗；而如果患者被提前预测他们不可能受 益，则可以指导患者进行该患者有可能受益的其它治疗，或可以考虑其它治 疗选择。
本文还描述了用单独或与另一种抗癌剂联合使用的基于酵母的免疫 应答生成疗法治疗患者癌症的方法，其中首先已经通过根据前文或本文其它 部分描述的任何一种预测方法的方法或测试选择患者为可能从免疫应答生 成型治疗癌症中受益(例如，该方法或测试中产生的对谱的分类标签表明患 者有可能从免疫应答生成型治疗癌症中受益)。
本文还描述了用单独或与另一种抗癌剂联合使用的针对突变Ras阳 性癌症的基于酵母的免疫治疗(例如，本文描述的GI-4000)治疗患者癌症的 方法，其中首先已经通过根据前文或本文其它部分描述的任何一种预测方法 的方法或测试选择患者为可能从针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫 治疗中受益(例如，该方法或测试中产生的对谱的分类标签表明患者有可能 从针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗中受益)。在本发明的这些 治疗方法的任意一种中，所述方法包括向患有表达癌症抗原的受试者施用基 于酵母的免疫应答生成型治疗(其可包括但不限于针对突变Ras阳性癌症的 基于酵母的免疫治疗)的步骤，所述受试者已通过根据如本文描述的发明的 任何一种预测方法进行的测试被鉴定或选择为可能从施用组合物中受益。
描述GI-4000-02的工作实施例：对GI-4000和吉西他滨的胰腺癌二期临床实验
GI-4000-02是一种在R0或R1切除的胰腺癌患者中GI-4000加吉西他 滨或安慰剂加吉西他滨的全登记(fully-enroll)2b期随机、双盲、安慰剂对 照、多中心、辅助性临床实验(参见图1)。R0切除定义为手术切缘不存在显 微残留疾病。R1切除定义为手术切缘存在显微残留疾病。R0和R1患者具 有不同的期望生存率，R0患者平均生存得更久。在本临床试验中，在筛选 过程中从每个受试者获得肿瘤组织样品，且对肿瘤评价了Ras突变的存在。 如果受试者具有产品相关突变，则施用与在受试者的肿瘤中的具体Ras突变 匹配的GI-4000基于酵母的免疫治疗产品(GI-4000系列如下详述)。
研究群体包括在美国和5个国际中心登记的176名具有Ras突变的切 除胰腺癌受试者。在切除后，将受试者根据切除状态按预期分为2组，R1 和R0组都按照1:1比例随机分配至两个治疗组接受40个Y.U.的 GI-4000(“Y.U.”是“酵母单位”或“酵母细胞等价物；1个Y.U.＝1千万酵母细 胞)加吉西他滨或安慰剂加吉西他滨。登记了39名R1受试者，其中19名分 配至GI-4000加吉西他滨组，20名分配至安慰剂加吉西他滨组。登记了137 名R0受试者，其中69名分配至GI-4000加吉西他滨组，68名分配至安慰 剂加吉西他滨组。对40个Y.U.剂量的GI-4000按照4支分离的10Y.U.皮下 注射给药，每条胳膊和每条大腿各一支。在切除手术和吉西他滨治疗开始之 间，对受试者给予3个每周剂量的GI-4000或安慰剂。所有受试者都给药多 达6个月的吉西他滨周期，始于切除后6-8周。每个吉西他滨周期后给予每 月剂量的GI-4000或安慰剂，以与每月的吉西他滨治疗的预定中断同步。 GI-4000或安慰剂的每月给药持续至受试者退出研究、经历疾病复发或死亡。 评价了一些疾病特异性基线特征，包括下述已显示对结果有影响的预后因 素：(a)淋巴结状态由胰腺癌细胞显微证据的存在或不存在定义。阳性结被认 为是差的预后指示物；(b)体力状态，其包括反应患者整体健康的五个等级尺 度(0，1，2，3，4)，其中0是最好的状态，4是最差的；(c)CA19-9，其是 一种胰腺癌细胞的血液生物标志物，作为肿瘤负担的衡量物。较高的CA19-9 水平与较差的临床结果有关；(d)肿瘤体积(厘米)，较大的体积通常与较差的 临床结果有关；和(e)肿瘤阶段，范围从I期至IV期，其定义基于包括原发 瘤大小、局部入侵程度、区域淋巴结参与程度和癌症自原发瘤向全身扩散程 度的标准化评分系统。
本临床试验的主要终点是无复发存活。第二终点包括总存活数、免疫 应答和疾病负担的生物标志物，例如CA19-9。迄今为止，GI-4000联合辅助 吉西他滨已经表现出对Ras突变阳性的R1胰腺癌受试者的存活率临床有 意义的效果，包括:(a)中值OS有2.6个月的改善(17.2个月对14.6个月)；18％ 的相对改善；(b)对GI-4000免疫应答者中值OS有5.0个月的改善(19.6个月 对14.6个月)；34％的相对改善；(c)一年存活率有16％的优势(72％vs.56％)； 30％的相对改善；和(d)中值RFS有1个月的改善(GI-4000/吉西他滨9.6个 月vs.8.5个月)；13％的相对优势。此外，GI-4000在R1受试者中具有免疫 原性并良好耐受：(a)GI-4000/gem方案中的7/15(47％)vs.安慰剂/gem方案中 的1/12(8％)具有Ras突变特异性T细胞应答；和(b)GI-4000至今被良好耐受 而未出现严重的新毒性的迹象。在开发本发明的预测性质谱方法中观察到额 外的结果，如下详述。
预测性质谱方法
对本公开的质谱方法的一个实例结合上述胰腺癌GI-4000+吉西他 滨二期临床试验中的样品的研究进行如下详述。与接受吉西他滨和安慰剂的 那些患者相比，接受了GI-4000+吉西他滨组合的一些患者，但不是全部， 经历了RFS和OS的实质性的改善。开发了一种分类器用于在治疗前预测一 名患者是否是有可能受益的一类患者中的一员(在下述讨论中称为“慢”)，或 相反的不可能受益(在下述讨论中称为“快”)。图2A和2B是蛋白质组学签名 阳性患者的无复发生存率(RFS)和总存活数(OS)的Kaplan-Meier图，表明他 们可能从GI-4000联合吉西他滨中受益。图2A显示了对具有延迟复发("慢 ")蛋白质组学签名的受试者的治疗组(GI-4000vs.安慰剂)的RFS，而图2B 对具有延迟复发蛋白质组学签名的受试者的治疗组的OS。这些图显示了本 公开的质谱方法鉴定在胰腺癌治疗中可能从组合的GI-4000和吉西他滨中受 益的患者的能力。显示我们的方法鉴定在治疗组中从GI-4000和吉西他滨的 组合中受益或不受益的患者的能力的我们研究中进一步的Kaplan-Meier图 将配合下图3和4进行讨论。
在我们的研究中，适于产生质谱的样品可来自GI-4000-02中登记的 90名患者，如上详述。样品来自血液，在这一具体案例中来自血浆，其通 过预先的基于密度的分离方法从完整血液获得。完整血液(在肝素钠玻璃管 中)在GlobeImmune实验室从临床试验位置通过过夜的室温运输接受，并在 收集30个小时内处理。为了分离外周血单个核细胞(PBMCs)，将血液用 Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(D-PBS；Gibco/InVitrogen目录号14190-250)约1:1 稀释，在LeucosepTM管(Greiner)中的Ficoll-Hypaque梯度上分层并在室温 1000x g下离心10分钟。在从梯度中收获细胞前，吸走用D-PBS 1:1稀释的 血浆并在-80℃下冷冻。在用于本发明的质谱方法之前，将样品解冻、分装 并随后在使用前再冷冻一次。
使用标准的稀释并发射(DNS)方法和“DeepMALDI”方法从样品中生 成质谱，所述方法描述于未决的2012年5月29日提交的美国临时申请系列 号61/652,394，在此引入作为参考，并在下文中进一步详述。
我们对稀释并发射谱进行了如美国专利号7,736,905和之前引用的 Biodesix，Inc.的专利文献中所描述的VeriStrat检测，但是发现该分类器未产 生有用的信息。鉴定了几个VeriStrat差的样品，在任一治疗组中的VeriStrat 好和差患者之间未发现显著差异。
从而，需要定义一种具有新训练集的新分类器。我们推测VeriStrat 特征可能有用，因为我们相信这些与患者针对癌症存在的免疫和炎性应答有 关(参见美国专利申请公开2011/0208433)。事实上，已发现只要正确定义分 类器训练集并改变谱预处理流程，如下所述，VeriStrat测试(参见下表3和 4)中使用的谱的质谱特征即可被用于胰腺癌研究中的分类。对分类器设计和 训练集的这一发现将在以下部分中描述。
分类器设计
设计能将患者分为对GI-4000治疗具有更好和更差的预后的分类器的 起点是定义更好和更差的无复发生存率(RFS)患者的训练集。基于RFS次数 的分布，决定将快速复发("快")的患者定义为那些在276天之前复发的患者， 将缓慢复发("慢")的患者定义为在500天前没有复发事件的患者。这样给出 了一个训练集，其中有20名患者在"快"组，14名患者在"慢"组，9名患者具 有中间的RFS次数(注：事实上在276天之前有21名出现RFS事件的患者， 但是这些患者之一的谱在开始本项目的时候遗失了，因此该名患者在一开始 没有包括在"稀释并发射"和150,000发射数的DeepMALDI分析的训练集之 内，而仅仅用在分类器应用到整个患者群时。对于500,000发射数的 DeepMALDI分析，该患者被包括在训练集中，一名复发时间长的患者被排 除在外，因为确认在治疗中该患者的血浆样品已被取走。)通过取不同的截 止点来定义"慢"和"快"组，或通过至死亡的快速和缓慢的时间来定义它们， 也将可能产生类似的结果。
已经定义了"快"和"慢"组的训练集之后，使用美国专利No.7,736,905 的方法预处理要被比较的质谱，包括背景剪除、部分离子流标准化和谱对齐。 对稀释并发射谱和DeepMALDI谱预处理的细节不相同，虽然大致程序相似。 首先估计背景并从谱中减去。将谱标准化至部分离子流。用于计算部分离子 流的区域可以多种方法选择，只要其能排除谱中的最强和最可变峰。在下文 给出结果的稀释并发射分类器例子中，用于部分离子流计算和标准化的区域 是3kDa-11.4kDa、13kDa-15kDa和16.1kDa-30kDa，但是也可进行其它选择。 例如对基于500,000发射数的DeepMALDI谱的分类器，用于部分离子流标 准化的区域是4.9kDa-6.54kDa、12kDa-13.5kDa和18kDa-27kDa。估计了谱 中的噪音。一旦在谱中检测到峰，则使用一系列对齐点将谱进行对齐。一系 列对齐点可以通过选择在与大部分待对齐的谱共同的谱中检测到的峰的子 集来编辑，或可从之前经验中已知存在于大部分谱的峰中提前选择。在下述 稀释并发射分类器的情况中，根据之前的经验选择了以下对齐点。这些是在 下述m/z位置的峰：6434.5，6632.1，11686.9，12864.8，15131.1，15871.5 和28102.5。值得注意的是，如果使用从样品中获得质谱数据的DeepMALDI 方法(参见下文解释)，谱中的其他特征也可被用于部分离子流标准化和谱对 齐，可使用更适合DeepMALDI谱背景减除的预处理方法。例如，在下述基 于500,000发射数DeepMALDI谱的分类器，使用了下述对齐点：3315，4153， 4457，4710，4855，5289，6431，6629，6835，7561，7931，8202，8807， 8912，9707，12856，13735，14031，14134，15117，15856，17366，21046， 27890，28019，28067和28228。然而，应当注意但是，对齐数量和位置的 其他选择对于两种谱获得方法是可能的。
谱预处理使得其能够彼此比较，从而基于从外部考虑定义的特征，其 可以用于产生分类器，或者可以比较谱的组，以确定各组间差异化表达的特 征，然后可以选择这些特征的一个子集，并使用这一系列特征建立分类器。 具有下述结果的一个分类器是使用从外部考虑确定的特征构建的。
由于已确信VeriStrat分类器中使用的质谱特征(参见下表3和4)与关 联宿主对肿瘤存在的应答的炎性过程有关(参见我们之前于2011年2月22 日提交的美国专利申请系列号12/932,295，在此引入作为参考)，且这与免疫 系统对肿瘤的应答有关，因此有兴趣尝试使用具有由GI-4000治疗后患者的 复发次数定义的新的参考集的谱的8个VeriStrat特征。结果见下述图3。然 而，可以使用在两个参考集的组的比较过程中发现的二者不同的特征来构建 其它的分类器。对于稀释并发射谱这些特征包括下述一种或更多种：
表1
表1的一种或更多种的特征可组合表2，3和5中的特征用于分类器中。
对于150,000发射数的“DeepMALDI”谱，可用于分类的特征包括下述：
表2
对于500,000发射数的“DeepMALDI”谱，可用于分类的特征包括下述：
表5
注意谱标准化的改进可揭示进一步的区别峰，从而上述列表并非被认为 是穷尽的。同样，在预处理中精确的m/z位置可根据谱对齐进行轻微偏移。
A.基于稀释并发射谱的分类器
图3A-3F的图显示了对参考集使用"慢"和"快"定义("慢"＝在500天之 前没有复发事件，"快"＝在276天前复发)、VeriStrat特征定义(表3和4)、和 稀释并发射预处理谱建立的分类器的表现。将分类器用于GI-4000(治疗)方 案的谱和来自安慰剂(对照)方案的46个谱。分类器基于K-最近邻分类算法 (参见美国专利7,736,905)对谱产生了快或慢的分类标签，图3A-3B显示了 K＝1的分类，图3C-3D显示了K＝3的分类，图3E和3F显示了K＝5的分 类。
从图3A-3F中显示的这些结果，我们发现有可能将治疗组(GI-4000+ 吉西他滨)分为两个组，"快"和"慢"，其中"快"组在RFS和OS两个方面较之 "慢"组具有显著更差的表现。相反，对照组(吉西他滨+安慰剂)在"快"和" 慢"组中具有相似的RFS。在"慢"组中支持GI-4000有RFS的治疗益处。OS 中治疗效果的情况难于破解，可能是在"慢"组中来自添加GI-4000的治疗益 处被复发后接受的治疗所稀释了。OS的分析还受到患者群中38％的事件审 查而变得复杂。
注意‘快’治疗组低于对照组，表明‘快’患者未从GI-4000和吉西他滨 的治疗中受益。因此，分类器提供了预测那些不可能从刺激免疫应答治疗中 受益的患者的能力。
B.150,000发射数的基于DeepMALDI的分类器
图4A和4B中显示了基于预处理DeepMALDI谱(参见下文详述)和 选自如上定义的训练集组"快"和"慢"比较的特征的分类器的表现，图4A显 示了分类器在治疗组中但不是在对照组中将快和慢患者按照RFS分离的能 力，图4B显示了分类器在治疗组中但不是在对照组中将快和慢患者按照OS 分离的能力。分类器中使用的特征被选择为接近表4中的8个特征。对于 RFS和OS两者均在治疗组中观察到对"快"和"慢"组的显著分离，但不是在 对照组中。虽然没有显著差异，但是"慢"组对GI-4000治疗较之安慰剂的对 照组显示了更好结果的趋势，特别是RFS。
图4C-4D、4E-4F和4G-4H是使用上表2所列出的用于DeepMALDI 的77个特征的样品和子集的DeepMALDI质谱的3个另外的分类器的RFS 和OS的Kaplan-Meier图。所有3个分类器使用了来自复发事件在276天之 前("快")的患者的20个谱和来自在500天前没有复发事件或审查("慢")的患 者的14个谱的参考集、相同的为DeepMALDI谱优化的预处理、以及K- 最近邻分类算法中K＝5。
图4C和4D的分类器使用了来自上表2的77名候选特征的特征子集。 我们将该77个特征通过p值进行分类，并使用了具有描述其相对表达差异 的最低p值的20个特征：
图4E和4F显示了第三DeepMALDI分类器的RFS和OS的Kaplan-Meier 图。在这一实例中，我们使用了来自谱(表2)列表的特征，其位于VeriStrat 特征(表3和4)的区域内或与其密切相关。
图4G-4H中显示了第四DeepMALDI分类器的结果。对于这一分类器， 我们使用了(表2)特征的子集，其组间表达水平以与图4E-4F的分类器相反 的方式相关，且其与VeriStrat特征不相关。
注意图4A-4H的DeepMALDI分类器在治疗组中清楚地分离了快和慢 患者而在对照组中显示了很少的或不能分离，从而与图3A-3F的“稀释和发 射”分类器表现相似。
在解读图3A-3F和4A-4H的结果中，应当注意上述结果趋向于高估 了对"快"和"慢"组的分离，因为在分析中使用了分类器的参考集。不幸的是， 还不存在用来以独立性方式检测分类器表现的校验集。从而，为了提高可选 的分类器表现评估，如下“分类器的交叉验证”节所述进行了交叉验证分析。
C.500,000发射数的基于DeepMALDI谱的分类器
能够在治疗组中根据RFS良好分离"快"和"慢"患者、但不能在对照组 中分离的分类器还可以通过使用500,000发射数的DeepMALDI谱进行构建。 对该DeepMALDI谱进行与本节呈现的所有分类器相同的预处理，对这些分 类器的训练集仍然是如前定义的"快"和"慢"复发组。在这一DeepMALDI分 析的时候能够获得更新的存活数据，从而这些分类器的表现分析使用了较之 A和B节中呈现的那些而言更新的数据。在各分类器中使用的区别特征集合 是上表5中97个特征的子集。对于每个分类器优化了为K-最近邻分类算法 选择的K近邻。图13A-13L是RFS和OS的Kaplan-Meier图，其显示了使 用500，000发射数的DeepMALDI谱和表5中列出的97个特征的子集建立 的6个分类器的表现。
图13A和13B的分类器使用了表5中列举的42个特征的子集。选择 它们以包括VeriStrat特征(表3和4)的m/z区域中所含的特征和基于对训练 集中'慢'和'快'组之间差异的低单变量p值所选择的额外的特征。对于这一分 类器，发现K＝3是最优的，所使用特征的中心(m/z)列于表6的第一列。
表6
图13C和13D的分类器使用表5所列的32个特征的子集(给出了特 征m/z中心)，其选择基于对训练集中'慢'和'快'组之间差异的单变量p值和' 慢'和'快'组间特征值的振幅比例。这一分类器使用K＝3和表6第2列所列特 征。虽然本分类器和前一分类器有19个特征相同，但是本分类器还包含前 一分类器中未使用的13个特征，而在Kaplan-Meier图方面给出了相似的表 现。
图13E和13F的分类器使用与前述分类器相似标准进行了开发，使用 K＝5。所使用的特征列于表6第3列。该分类器的25个特征中有23个与图 13A和13B的分类器相同，有一半多与图13C和13D的分类器相同。虽然 有分类器特征选择的相似性，但是Kaplan-Meier图中的表现显示本分类器的 结果更适合预后(prognostic)而不是GI-4000的治疗效果预测。
图13G和13H的分类器使用了图13E和13F的分类器的13个特征的 子集，列于表6第4列，且K＝5；Kaplan-Meier图显示与前两种DeepMALDI 分类器更相似的表现(图13A-D)。
图13I和13J的分类器的构建没有使用表3的VeriStrat特征的任何 m/z区域中的特征。然而，可以看出其在Kaplan-Meier图方面与那些包括来 自VeriStrat特征的m/z区域的特征的分类器具有相似表现。所使用的特征列 于表6的第5列，且本分类器的K＝7。
图13K和13L的分类器只使用8个特征，列于表6的最后一列，且 K＝3。8个特征中的4个在任何其他分类器中都未使用。由Kaplan-Meier图 评价的表现与测试的其它分类器仍然没有显著差异。
注意这些DeepMALDI分类器的大部分还清楚地在治疗组中分离了' 快'和'慢'分类的患者，而在对照组中表现出很少的分离，从而与"稀释并发射 "分类器和那些基于具有较少发射数DeepMALDI的分类器表现相似。
分类器的交叉验证
A.基本构架及其在“稀释并发射”分类器中的应用
图3A-3F中所示和如上所述的“稀释和发射”分类器的交叉验证通过 根据图5所概括的流程进行。
在图5的流程中，在步骤100固定了用于分类和预处理步骤(背景减 除、标准化和对齐)的特征(峰或m/z范围)。然后，以重复方式按循环108所 示执行步骤102、104、105和106。在步骤102，随机选择省去10个谱用于 检测分类器表现。在步骤104，使用相同的复发时间(TTR)标准从剩余的34 个谱中选择谱的参考集，即将“快”定义为在276天前复发，“慢”如上定义 (500天前没有复发)。在步骤105，选择了K最近邻分类算法中的K的值。 在步骤106，依据谱的“测试集”的风险比(HR)和中值评价了分类器的表现。 谱的测试集是不包含在参考集中的治疗组中的谱(步骤104)，即在步骤102 中省去的10个谱加上来自TTR在276和500天之间的患者的任何其它的谱。 该过程(108)重复多次(在本实例中为70次)。
应理解图5的流程是具有普适性的，只要恰当选择参考和测试集即可 给出要考虑的特定研究。
图5的这一交叉验证趋向于提供分类器表现的下限，因为其在以下方 面低估了表现：
1.交叉验证分类器的参考集小于原始分类器的那些，其可能影响表现。
2.不包括在参考集中、但是大于之前的10个中间复发谱的样品的测试 集仍然较小。这可能导致计算统计中的较大变化性，且在一些情况下，当组 体积非常小的时候，这些统计可能是无意义的。
3.测试集不能代表整个治疗组群。其包含较高比例的具有中间复发时 间的患者。这一不平衡使得难以比较测试集结果和测试集外的其它组(例如 对照组)。
虽然有这些限制，但是对使用"快"和"慢"组和VeriStrat特征的定义构 建的分类器的交叉验证分析产生了一些有用的观察。图6显示了在对于对照 组、完整治疗组和测试集(排除了分类器参考集的治疗组)的交叉验证分析中 为70个实践(realizations)计算的"快"和"慢"组之间的风险比。虽然所有分类 器都产生了对于对照组接近1的HR，但是对于测试集的中值HR为3.1，接 近对于完整治疗组的中值HR。
图7A和7B显示了交叉验证分析中测试集中的"快"和"慢"组中值RFS 的分布。在图7A中，"慢"组的中值以约382天为中心，而"快"组的中值以 约274天为中心。图7B显示了测试集中的"快"和"慢"组之间中值差别的分 布。中值的差别以约111天为中心，这是一个临床有意义的差别，非常少的 实践显示"慢"组的中值小于"快"组。虽然测试集与对照组的比较被两组之间 复发时间分布的不平衡变得复杂化，但是对于对照组和测试集中"快"和"慢" 组的中值的观察显示"慢"测试集的中值显著位于"快"和"慢"对照组的中值之 上，后者反过来位于"快"测试集的中值之上。参见图8，其是交叉验证分析 中对照组和测试集的"快"和"慢"组的中值分布图。
此外，"慢"组的测试集和对照组之间中值差异的分布显示在几乎所有 的实践中，测试集的中值RFS都大于对照组的，虽然存在群体的不平衡， 参见图9，其是"慢"组的测试集和对照组之间中值差异的分布图。中值RFS 的中值差异约为60天，同样是一个有意义的临床差异。
OS的交叉验证分析受到初始可获得的临床数据中超过三分之一的整 体群组有受审查的数据的阻碍。
交叉验证分析的另一结果是确定慢与快分类比例对在K-最近邻分类 器中使用的K的选择的依赖性。参见图10A，其是分类器中使用的不同K 值在对照组中慢对快分类比例的分布图。图10B是对不同K值的交叉验证 分析的测试集的计算风险比图。当我们进行交叉验证时，我们对70个重复 的每一个选择了K为3、5或7(图5，步骤105)。我们每一种约有1/3，从而 K＝3、5或7的每个分布至少有20值。为了考察K＝1时发生了什么，我们 还使用K＝1重新运行了19个重复的交叉验证。发现K＝5的测试集中慢/快 风险比最大。图10B还显示了交叉验证分析的所有70个重复的对照组获得 的风险比。图10B表明对照组中使用的K值没有造成很大的不同，且分布 非常窄。当与图10A一起考虑时，图10B表明K-最近邻分类算法中K的多 重选择是可能的，但是K＝5可能是一个优选的选择。
B.150,000发射数的基于DeepMALDI谱的分类器的交叉验证
对前述4个150,000发射数的基于DeepMALDI谱的分类器进行了相 同的交叉验证方法，显示其中2个在预测从添加GI-4000得到的相对治疗受 益的能力方面具有出众的表现。图14显示了交叉验证的对照组和测试集中 来自4A-4H的4个分类器的RFS分类为“快”和“慢”的患者的风险比分 布。虽然对来自图4C-4F的分类器观察到的中值风险比与测试集和对照组中 相似，但是对另两个分类器观察到的测试集中的中值风险比大于对照组中 的，支持了Kaplan-Meier图中的表现评价，其显示在治疗组中RFS在'快'和' 慢'组之间的分离大于对照组，并支持了分类器对添加GI-4000至吉西他滨对 照方案的预测能力。
C.500,000发射数的基于DeepMALDI谱的分类器的交叉验证
还对进行了前述6个500,000发射数的基于DeepMALDI谱的分类器 相同的交叉验证方法，并在图13A-M中进行了评价。图15显示了交叉验证 的对照组和测试集中每个分类器的风险比分布。这显示当通过交叉验证方法 评价表现时，展示完整的治疗和对照组的Kaplan-Meier图中的显著差异并不 总是维持。此外，其是即使在交叉验证中也可能使用不同的特征集(其具有 相似的表现特征)构建多个不同分类器的进一步证据。
注意训练集可以具有不相等的“快”和”慢”分类的成员数量。为了处理 不相等组大小的问题，我们选择的相关参考组大小部分为我们在治疗组中具 有的复发时间的分布结果。恰好有很多复发时间在250和275天之间的患者， 可能是由于其与计划的MRI/CT评价相一致。从而，看上去不存在合适的位 置以将所述组在那些时间中分开。然而，我们决定将一个更大的早期复发组 分开更好，从而我们优选在该组中有更多。K-最近邻分类算法可被调整以考 虑参考集中不同的组大小，从而原则上在训练集中有不同的组大小不是问 题。
实际的、有用的测试
正如本公开中一直指出的，在本公开的发现后进行了实际的有用的测 试。一个方面是本发明的测试方法鉴定了特定的癌症患者是否是可能或不可 能从施用单独或配合其它治疗的基于酵母的免疫应答生成型治疗中受益的 一组癌症患者中的一员。另一方面是本发明的测试方法鉴定了特定的癌症患 者是否是可能或不可能从施用单独或配合其它治疗的针对突变Ras阳性癌 症的基于酵母的免疫治疗(例如GI-4000)中受益的一组癌症患者中的一员。 这种鉴定可以在治疗前进行。
在一个实例中该方法包括以下步骤：a)从患者获得血液来源的样品； b)在质谱仪的辅助下获得该血液来源的样品的质谱；c)在程序计算机中，对 该质谱执行预定义的预处理步骤，在执行预处理步骤之后，在预定义的m/z 范围内获取所述质谱中所选特征的累积强度值，并将累积强度值与包括来自 其他癌症患者的分类标签谱的训练集进行比较并用分类标签对质谱进行分 级。对谱分配的分类标签被用于预测患者是否有可能或不可能以施用单独或 配合其它抗癌治疗的基于酵母的免疫应答生成型治疗的形式从治疗中受益。
在另一实例中该方法包括以下步骤：a)从患者获得血液来源的样品； b)在质谱仪的辅助下获得该血液来源的样品的质谱；c)在程序计算机中，对 该质谱执行预定义的预处理步骤，在执行预处理步骤之后，在预定义的m/z 范围内获取所述质谱中所选特征的累积强度值，并将累积强度值与包括来自 其他癌症患者的分类标签谱的训练集进行比较并用分类标签对质谱进行分 级。对谱分配的分类标签被用于预测患者是否有可能或不可能以施用单独或 配合其它抗癌治疗的针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗的形式 从治疗中受益。
该测试在图11中作为过程300以流程图的形式显示。
在步骤302中，从患者获得血液来源的样品。在本实施例中所述样品 是在对样品进行一些处理步骤后的血浆(例如，以预先的密度分离方法从完 整血液获得的血浆)。在一个实施方式中，将该血液来源的样品分成三等份， 且质谱分析法和随后的步骤304、306(包括子步骤308、310和312)、314、 316和318对每一等份独立地进行。该等份的数量可以变化，例如可以有4、 5或10等份，并且每一等份都进行随后的处理步骤。
在步骤304，对该样品(等份)进行质谱分析。优选的质谱分析方法是 基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱分析，但是其他方法也 是可行的，包括2012年5月29日提交的未决美国专利临时申请 61/652,394(其内容在此引入作为参考)中公开的所述“DeepMALDI”质谱方法 (参见下文详述)。如本领域常规的，质谱分析产生代表大量质/荷(m/z)值处的 强度值的数据点。在一个示例实施例中，将样品解冻，并在4摄氏度下以 1500rpm对样品离心5分钟。进一步的，可以在超纯水(MilliQ water)中以1： 10或1：5稀释该样品。可以将稀释后的样品一式三份点样(spot)在MALDI 板上分配的位置(即在三个不同的MALDI目标或“点”上，如本领域公知的)。 在将0.75ul稀释后的样品点样到MALDI板之后，加入0.75ul的35mg/ml芥 子酸(用50％乙腈和0.1％的三氟乙酸(TFA)配制)，然后通过移液管吹吸混合 五次。可以允许在室温下干燥这些板。应当理解，可以根据本发明的原理使 用其他技术和过程来制备和处理样品。
可以使用自动或手动采集谱的Voyager DE-PRO或 DE-STR MALDI TOF质谱仪以线性模式获得阳离子的质谱(当然，可以使用 其它MALDI TOF设备，例如，Bruker Corporation的设备)。从每个MALDI 点内7或5个位置上收集75或100个谱，以针对每份样品产生平均2,000 个谱。使用蛋白质标准品(胰岛素(牛)、硫氧还蛋白(大肠杆菌)以及脱辅基红 蛋白(Apomyglobin)(马))的混合物来从外部校正该谱。
注意DeepMALDI方法可被用于步骤304的一个MALDI板点或几个 MALDI板点，参见下文详述。
在步骤306，对步骤304中获取的谱进行一个或多个预定义的预处理 步骤。使用在步骤304中获得的质谱数据上运行的软件指令来在通用计算机 中实施预处理步骤306。该预处理步骤306包括背景减除(步骤308)、标准化 (步骤310)以及对齐(步骤312)。背景减除的步骤优选地涉及在谱中生成强的 非对称背景估计，并从该谱中减去该背景。步骤308使用在US7,736,905中 描述的背景减除技术，其在此引入作为参考。标准化步骤310涉及背景减除 后的谱的标准化。如美国专利7,736,905中描述的那样，该标准化可以采用 部分离子流标准化的形式，或者总离子流标准化的形式。如US7,736,905中 描述的那样，步骤312将标准化后的背景减除谱与预定义的质量标度对齐， 可以从对分类器所使用的训练集中的谱的考察来获取该预定义的质量标度。 预处理步骤还在上述GI-4000+吉西他滨临床研究的讨论中有一些详细描 述。然而，预处理的细节，例如，用于部分离子流标准化和对齐的特征或谱 区域，可以改变。
一旦执行了预处理步骤306，则该处理300前进至获取预定义的m/z 范围内该谱中的累计强度的步骤314。可以将标准化后的背景减除强度值在 这些m/z范围内积分。将该积分值(即，在对应的预定义的m/z内的强度之 和)分配给特征。对于在该m/z范围内没有检测到峰值的谱来说，可以将预 定义的m/z范围定义为具有与当前m/z位置的峰值宽度对应的宽度的该特征 的平均m/z位置周围的间隔。在美国专利7,736,905中进一步详细公开了该 步骤。
在步骤314，在一个可能的实施方式中在如下m/z范围中的一个或多 个处获得了该谱的强度的积分值：
表3
5732至5795
5811至5875
6398至6469
11376至11515
11459至11599
11614至11756
11687至11831
11830至11976
12375至12529
12502至12656
23183至23525
23279至23622和
65902至67502。
在一个实施方式中，在以如下表4中示出的峰为中心或涵盖其的多达 8个m/z范围内获得了值。在美国专利7,736,905和作为US 2011/0208433公 开的2011年2月22日提交的美国申请系列号12/932,295(其内容在此引入作 为参考)中解释了发现这些峰的重要性以及方法。在实践中上述表3和4中 的宽度(范围)或峰位置可例如根据如何进行谱对齐的变化而轻微变化。已进 一步指出使用“DeepMALDI”技术(参见下文详述)，在谱中揭示了很多可用于 分类的特征。对于稀释和发射质谱，一种或更多种表1的峰，或表1和表3 和4的特征组合可被用于分类。已进一步指出使用“DeepMALDI”技术，在 谱中揭示了很多特征，其组合可用于分类，参见表2、5和6和上述图4A-4H 的例子。
在步骤316，将步骤314中获得的值提供给分类器，该分类器在所示 出的实施例中是K最近邻(KNN)分类器。该分类器使用来自大批其他患者的 分类标记谱的训练集。训练集将包括来自从产生免疫应答的疗法中受益或未 受益的患者的分类标签谱，例如基于酵母的癌症免疫治疗，其可以是单独或 联合其它抗癌治疗的针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗。例如， 上述工作实施例中描述的GI-4000研究中的训练集包括“快”和”慢”复发时间 组中的分类标签谱。对该谱分配的分类标签将表现为“快”、”慢”、或等价物 的形式，例如“受益”、“无应答”、“好”、“差”等等。KNN分类算法对314和 训练集的值的应用实质上是一种来自在多维特征空间中预定义谱特征的累 积强度值比较的距离计算和多数票决算法，如美国专利7,736,905所述。可 以使用其他的分类器，包括概率KNN分类器、支撑向量机或其他分类器。
在步骤318，分类器为该谱生成标签，例如，”快”或”慢”。该方法可 以对单一等份执行，或对分成三等份的样品执行，其中对给来自定患者样品 的三份分开的等份(或者使用不管什么数量的等份)并行地执行步骤304-318。 在步骤320，进行核对来确定是否所有的等份都产生了相同的分类标签。如 果不是，则如步骤322指示的那样，返回未定义(或不确定)结果。如果所有 的等份都产生相同的标签，则如步骤324指示的那样报告该标签。
如本文所描述的，随后将步骤324报告的分类标签用于引导患者的治 疗。例如，根据本公开内容，根据分类步骤被标记“快”的那些胰腺癌患者 被预测为不可能从产生免疫应答的疗法中受益，例如基于酵母的癌症免疫治 疗，其可以是单独或联合其它抗癌剂包括吉西他滨的针对突变Ras阳性癌症 的基于酵母的免疫治疗。作为另一个例子，如果分类后胰腺癌患者谱的分类 标签根据测试被鉴定为“慢”，则患者被预测为可能从产生免疫应答的疗法中 受益，例如基于酵母的癌症免疫治疗，其可以是单独或联合吉西他滨的针对 突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗，患者继续通过施用免疫应答生成 疗法进行治疗，例如基于酵母的癌症免疫治疗，其可以是单独或联合吉西他 滨的针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗。
应当理解，步骤306、314、316和318典型地是在被编程的通用计算 机中执行，该通用计算机使用软件编码预处理步骤306、步骤314中累积强 度值的获取、步骤316中KNN分类算法的应用以及步骤318中分类标签的 生成。步骤316中使用的分类标签谱的训练集被存储在计算机的存储器中或 存储在计算机可以访问的存储器中。
如美国专利7,736,905中描述的那样，该方法和被编程的计算机可以 有利地在实验室测试处理中心实施。
表4：分类中使用的峰。
注：表4中鉴定的峰的m/z值可根据谱对齐过程进行轻微偏移至更高 或更低的m/z值，所述谱对齐过程用于对齐在训练集中使用的、和在预处理 中对齐测试谱中的所有谱。
图12是可被用于实践本公开的方法的实验室测试处理系统400的系 统方框图。该系统400可在作为针对大批患者样品的实验室测试处理中心的 实验室中实施，例如，在测试服务提供者商业中。该系统400接收血液来源 的样品402，其可以是全血液、血浆、血清、或执行其它处理步骤后的血浆， 例如，通过预先的基于密度的分离方法从全血液中获得的血浆。使用前述流 程将样品稀释并等分至MALDI-TOF板404的一个或多个点，然后将其插入 MALDI-TOF质谱仪406。该质谱仪产生质谱408，其如常规的为数据对的 形式(m/z位置、强度)。然后将质谱数据以数字形式储存在数据库或机器可 读存储器410中。存储器410可例如通过局域网连接通用计算机414，其细 节不重要。存储器410进一步存储训练集412的分类标签谱。计算机410 实施软件指令以对谱408进行预处理步骤(背景减除，标准化和对齐)并编码 用于对预处理后的谱执行分类算法(例如K-最近邻)，并使用训练集数据 412。然后，计算机如图11所示对谱408产生分类标签，其如本文所公开的 那样被用于指导治疗。
测试系统400可通过计算机网络422从远端MALDI-TOF设备420接 收质谱数据并执行图11的步骤304-324。MALDI-TOF设备可关联远程的临 床、医院或实验室，其可以附属于实施分类器计算机414的实体，也可不附 属，但是为了保证标准化和可再现性，通常执行分类和产生分类标签的相同 实体也将执行患者样品的质谱。
用于获得质谱的“DeepMALDI”方法
在MALDI(基质附助激光解吸电离)TOF(飞行时间)质谱中，将样品/ 基质混合物置于金属板上的定义位置(在此为“点”或“样品点”)，称为MALDI 板。将激光束以一个非常短的瞬间引导至点上的一个位置(称为一个“发射 (shot)”)，导致样品的分子或其它成份的解吸和电离。样品成分“飞行”至离 子检测器。该设备以质谱的形式检测样品中的成份(分子)的质荷比(m/z)和相 对强度。
一般，在MALDI-TOF检测中，对MALDI板上的每个点施加几百个 发射，将得到的谱(每个发射一份)进行累加或平均以对每个点产生一份完整 的质谱。
按常规的智慧，至少在复杂生物样品例如血清和血浆等的 MALDI-TOF质谱领域而言，是没有必要对样品施加多于大致1,000发射数 的，否则蛋白质的含量被减少，设备中的激光和探测器承受不必要的负担， 而额外的发射数不会揭示关于样品的显著数量的额外信息。从而，当从复杂 生物样品获得质谱数据时，例如在生物标记物发现研究中，通常使用 500-1000发射数每样品点。
在最近的探索性研究中，我们发现从相同的MALDI点或组合的来自 同一样品的多个点的累加谱收集并平均很多发射数(大于20,000，一般 100,000至500,000)，会导致相对噪音/信号水平的减少，且能揭示来自复杂 生物样品质谱的显著数量的额外信息。此外，很多使用MALDI TOF MS的 标准范式看上去是明显错误的。首先，在点上的蛋白含量被彻底清除前在单 一点上运行几十万发射数是可能的。其次，通过将很多发射数进行平均导致 噪音的减少会导致出现之前不可见的峰(即，在1,000发射数下未出现的峰)。 第三，当样品接受非常大数量的发射数(远大于1,000)时，甚至是之前可见的 峰也变得更好地被定义并允许更可靠的峰强度测量和样品间比较。
作为一个例子，已发现在MALDI-TOF质谱中对复杂生物样品例如基 于血液的样品在单一点上进行大数量的发射数(>20,000及甚至100,000和 500,000发射数)导致噪音水平的降低，并揭示了之前不可见的峰(即，在2,000 发射数下不出现的峰)。此外，这可以在不减少样品蛋白含量的情况下完成。 此外，之前可见的峰变得更好地被定义，并允许更可靠的样品间比较。在基 于血液的样品的标准谱(～1,000发射数)中，通常有60-80个峰是可见的，而 使用200,000发射数通常有～200-220个峰是可见的，使用500,000发射数通 常～450-480个峰是可见的，且使用2,800,000发射数通常～760个峰是可见的。 应理解在此报告的峰数与MALDI-TOF设备设置有关，且这些数量仅为一个 粗略的指导；根据设备设置以及还根据特定的峰检测算法(当然还有实际样 品)，更多或更少的峰将是可见的。还必须注意峰的质量和强度的定量(与丰 度相关)也在至少一些测量中变得更好，如下讨论的图16A-16D中所示。
在例如200,000发射数下揭示的峰被认为对应于血清样品中存在的极 少量完整的(未消化的)蛋白。使用本文描述和所提及为“DeepMALDI”方法 (即，来自同一点或来自多个点组合的大于20,000发射数每个点和优选的约 250,000至750,000或更多发射数)的技术，我们相信血清样品中存在的非常 大数量的蛋白及可能至少一半的全蛋白可以以半定量和可重复的方式被检 测。以半定量方式的检测表示强度的检测(峰高、峰下面积)与绝对丰度或样 品中的蛋白浓度有关，以可重复方式的检测表示可以对同一样品检测多次并 在一些可接受的变异系数范围内获得相同的结果。
从单一MALDI点获得大于20,000发射数可能超过现代MALDI-TOF 机器的参数；然而我们在本文中描述了几种在此限制左右进行工作的方法。 理想的，MALDI-TOF设备被设计为适应本文中描述的“DeepMALDI”方法， 且如下描述中提供了对于此种机器的几个具体建议，包括自动光栅扫描特征 和在单一点上进行极大的更多发射数的能力。
从一个MALDI样品点使用几十万发射数的最迫切的问题是在常规的 点制备中点内只有一些发射位置产生足够的离子流以对组合谱中产生信号 有实质上的贡献。当已经使用劳力密集的人工过程靠视觉为激光发射选择 MALDI板上给定点的高离子产出位置且可能用这一方法继续时，为激光发 射选择位置过程的自动化成为可能并作为本发明高通量实施的优选(如果不 是出于不浪费太多激光发射和大幅降低激光寿命的简单原因的话)。变换的 方法是以使得大多数随机选择的位置都产生高离子流的方式来改进MALDI 点的质量。两种方法都可用于产生DeepMALDI谱。
本文的这一部分描述了几种用于谱获得自动化的方法。获得的自动化 可包括以光栅模式定义点激光扫描的最优移动方式和在一个点内离散的 X/Y坐标位置对多个光栅扫描产生特异性序列，以从一个或多个点产生如 750,000或3,000,000发射数。例如，从250,000发射数每4个样品点的每一 个获得的谱可被组合至1,000,000发射数的谱。如前所述，在多个含有相同 样品的点上收集的几十万发射数至几百万发射数可一起平均，以产生一个 谱。一种自动化的方法涉及对一个样品点的非连续X/Y光栅扫描产生光栅 文件。另一种方法涉及将点分为子点的网格(例如，3X3或5X5网格)并对子 点的离散X/Y坐标位置处的光栅扫描产生光栅文件。公开了第三种方法， 其使用图像分析技术以鉴别感兴趣的区域，所述区域含有相对高的样品材料 浓度用于谱获得(多发射数)，和/或鉴别那些其中蛋白浓度相对较低的区域， 并在具有相对高蛋白浓度的区域进行谱的获得。
下文描述了优化样品应用至MALDI板(“点样”)的过程以在单一点内 产生样品/基质的均一、同质的晶体。这一过程有利于使用自动化方法从 MALDI板上的单一点获得几十万发射数。
本公开的这一发现和方法具有多种应用，包括生物标志物发现、测试 进展、底物测试、现存测试的验证和产生假设，例如，在发现生物标志物的 努力中。特别关注的是该方法可用于本文其它部分描述的预测性测试。与现 有方法相比，该方法通过其在复杂样品中以高通量方式可重现地定量更多蛋 白的能力进一步增强了“稀释和发射”方法在质谱研究中的潜力。
本文这一部分使用的术语：
1.术语“瞬态谱”指从指向MALDI点中的单一位置或x/y位置的单一 包(packet)的激光发射获得的谱(每个包由定义数量的发射组成，例如，100、 500、800发射数，等)。
2.术语“位置谱”指激光在MALDI点中的同一位置发射x次时，一种 或多种瞬态谱的累积和。
3.术语“点谱”指在对一个完整的、单一的MALDI点发射的过程中获 得的所有位置谱之和。点谱可使用单独的求和操作以对位置谱累加来获得， 或在对位置谱进行对齐和/或标准化(例如，总离子流标准化)操作后使用求和 操作获得。点谱可通常获得自MALDI点上的100,000至500,000发射数。 获得点的其它选项是可能的，包括a)对位置谱进行背景减除和标准化并随后 累加；b)对位置谱进行背景减除和对齐on the位置谱并随后累加；c)进行位 置谱的背景减除、对齐和标准化并随后累加。我们发现通过位置谱的总离子 流标准化(细节参见美国专利7,736,905)并随后累加获得了最佳的动态范围； 在点谱中将进行任何背景减除。
4.术语“发射位置”指一个给定的位置，其中激光束拦截MALDI点用 于发射。为了获得200,000或500,000发射数每MALDI点，激光束在MALDI 点上指向多个(例如，数百个)个体发射位置，例如，通过手动或更优选的以 自动化的方式使用激光束对所述点的光栅扫描。如下所述，光栅模式设计是 重要的，因为通常不希望连续在紧邻点位置处发射。因此，光栅模式设计顺 序选择具有一定空间分离的发射位置，并以空间移动的方式重复对整个 MALDI点的扫描，以避免连续在紧邻点位置处发射。
5.术语“瞬态谱过滤”指一个过滤或选择过程，其用于接受或拒绝瞬 态谱。作为示例，在瞬态谱过滤中，为了接受一个瞬态谱，在瞬态谱中必须 存在预定义m/z范围内的峰的最低数量(例如，5)，且瞬态谱中信号/噪音比 必须超过一个特定的阈值。也可以采用其它过滤标准，例如谱的总离子流需 要超过某一预定义的阈值，或通过使用如下所示的排除列表或包含列表。谱 过滤从整体上接受或拒绝瞬态谱。
6.本文使用的术语“复杂生物样品”定义为含有几百或几千分析物的 样品，例如完整蛋白，其丰度覆盖一个很大的动态范围，通常为许多数量级。 该复杂生物样品的实例包括血液或其成份(血清或血浆)、淋巴液、导管液、 脑脊液和表达的前列腺浆液。该复杂生物样品也可包含环境或食物样品。
“DeepMALDI”方法中揭示的谱信息的一个实例见图16A-16E。图 16A-16C是选定的质/荷范围(m/z比7,000-8,000)内显示同一样品(血清)的3 个谱的图，显示了随着增加的发射数，可检测峰内容增加。图16A的谱来 自2,000发射数，图16B的谱、图16C的谱来自500,000发射数。特别注意 图16A的谱是如何基本表现为噪音和表现得含有很少或没有可分辨的目标 谱信息的。对比图16A和图16B，其中图16B的谱(来自100,000发射数的 谱)含有很多个体的峰，例如在10)处鉴定的峰，其在图16A的谱中不存在。 在图16C的谱中，在谱中显示有很多在其它谱中不显示的峰。将图16C和 16B与图16A进行比较，显然在100,000发射数和500,000发射数揭示了大 量的谱信息，其在图16A(2,000发射数)的谱中不存在，且如在图16B和16C 中所示的，通过DeepMALDI方法降低了噪音水平。
图16B和16C的谱增加了谱对动态范围的敏感度，所述范围可以指 定并可以允许将峰强度与丰度关联。使用峰强度来分析复杂生物样品在给定 浓度下的一个分子的存在是可能的。例如，在本方法中人们将定义样品中的 目标分子(具有已知质量)，将样品涂(dope)至目标丰度水平(摩尔浓度或ppm) 并用于MALDI板；在板上进行若干发射(例如，大于100,000)直至该分子以 特定丰度(强度)可靠地呈现于谱中(在已知m/z位置的峰)并记录发射数量 (“x”)。产生被称为“参考谱”的这一过程将有常规限制条件和标准化方法以 确保可靠性，其对本领域技术人员而言是显而易见的。然后，待测试的目标 样品将进行MALDI-TOF和x数量的发射。如果得到的谱显示对应目标分子 的已知位置处的峰强度小于参考谱中的峰强度，那么样品中的目标分子浓度 小于产生参考谱中使用的样品中的分子浓度。该方法可同时被用于多个分析 物。此外，可以针对一系列已知浓度范围的目标分子以x发射数获得多个参 考谱，且可以将测试谱与参考谱进行比较以确定测试样品中目标分子的大致 浓度。该方法可用于多种目的，例如，如运动员的药检、代谢物浓度检测、 环境样品检测等。目标分子可以是蛋白质，例如代谢物、癌症抗原(CA)125、 前列腺特异性抗原(PSA)、C-反应蛋白等，其质量范围约1K道尔顿至50K 道尔顿。
图16D是对在DeepMALDI方法中呈现的谱中大量动态范围的描述。 图16D的插图是m/z范围为7140kDa至7890kDa的谱的一部分，其表现了 在约～500,000发射数下获得的所述谱和多个峰10。将背景估值(虚线)叠加在 谱上，其可被减除以产生背景减除的谱。注意插图和具体的很多峰10中的 谱信息在图16D的主要部分中不可见。在图16E中，谱在插图中表现，其Y 轴放大以显示额外的谱信息和约9520的m/z区域的具体的峰强度信息，其 在DeepMALDI方法中有显示，但是在典型的～1,000发射数的谱中不可见。
图16A是含有384个矩阵排列的样品点或“点”的MALDI-TOF靶 板的平面图。这些点由列数1...24和行数A...P确定，例如，左上方的点 被确定为A1。图16B是一个个体样品点P1(14)的放大图，其上被叠加了一 个具有原点(0,0)的X/Y坐标系16。样品点14被显示分为一个5X5的直角坐 标网25个体子点(sub-spots)18。直角坐标网18和位置坐标系16被用于自动 光栅扫描方法以从这些点获得100,000或更多发射数，如下详述。
最初注意到大数量的发射(>20,000)的自动产生并非绝对必要的，目 前可获得的MALDI-TOF设备中存在的特征可以使用。一般而言，在 DeepMALDI技术中，暴露于激光发射时，在能产生高蛋白得率的MALDI 点上选择位置是重要的。现存质谱设备中的标准软件允许使用规则的预定义 途径在点上移动，即方形模式、六边形模式、螺旋模式(从一个点的中心)。 MALDI板上的发射位置在一个称为“教学(teaching)”的过程中定义，其是 现存的BrukerCorporation的MALDI-TOF设备中的FlexControlTM(Bruker) 质谱仪控制软件的一部分。(虽然本文偶尔提及一个Bruker Corporation设备 的特征，但是本发明的方法显然不会限于任何特定设备或特定生产商的设 备。)
图18中显示了含有均匀分布在点中的样品/基质混合物的一个 MALDI点的示例。来自Bruker Corporation的质谱设备包括嵌入式摄像机， 其显示了一个MALDI点的区域；人们可以人工选择挑选亮的位置30以用 激光对准。暗的位置32应当被避免。有时候亮的位置不产生好的得率，其 可能与盐晶体的存在有关。在发射过程中，一个点中的区域可能变得耗尽 (depleted)；从而暗的区域(具有低得率的耗尽的区域)需要被避免。手工方法 将继续在发射过程中获得并展示点的图像。
在我们预备实验的过程中，我们发现随着越来越多发射数的使用，要 发现好的位置会变得越来越难。当重复使用同一个点的时候也发现了这种效 果，例如在之前的50万发射数后增加第二个50万发射数。第二轮没有获得 如期望的质谱噪音水平的减少。事实上，得到的平均化的谱可能总体质量更 差，可能是由于对来自太多空位置的发射数进行平均。这可能导致对早期位 置的获得偏差(acquisition bias)，如果只使用眼睛选择发射位置并接受或拒绝 谱且不使用瞬态谱过滤的话，这种偏差需要被控制。如果人们使用自动光栅 扫描和位置谱过滤的话，则这种偏差被消除。
然而，为了增加通量，需要自动化位置选择过程并从给定点获得高数 量的发射。以下部分描述了几种方法。下述方法能够在13-15分钟内从 MALDI板中位于3个点的一个样品获得750,000发射数(250,000发射数每个 点)，其样品需要3微升血清。
谱收集的自动化
虽然已使用劳力密集的人工过程来在MALDI板上的给定点视觉选择 位置产生每个点100,000或500,000发射数的多发射数获得了结果，且可能 用这种方法继续，但是为激光发射数选择位置过程的自动化是可能的，且本 文中描述了几种方法。获得的自动化可包括定义以光栅模式进行激光扫描点 的最优移动模式和在一个点内离散的X/Y位置处多个光栅扫描的产生序列 以从该样品点产生例如100,000、250,000或500,000发射数。一种自动化方 法涉及对样品点非连续X/Y光栅扫描的光栅文件的产生。光栅模式设计是 重要的，因为通常不希望连续在紧邻点位置处发射。因此，光栅模式设计顺 序选择具有一定空间分离的发射位置，并以空间移动的方式重复对整个 MALDI点的扫描，以避免连续在紧邻点的位置处发射，和选择新的发射位 置。
另一种方法涉及将点分为子点的网格(例如，3X3或5X5网格)(参见图 17B)并对子点的离散X/Y坐标位置处的光栅扫描产生光栅文件。
公开了第三种方法，其使用图像分析技术以鉴别感兴趣的区域，所述区 域含有相对高的样品材料浓度用于谱获得(多发射数)，和/或鉴别那些其中样 品(例如蛋白)浓度相对较低的区域，并避免在相对低样品(例如蛋白)浓度的 区域的谱获得。
A.非连续X-Y坐标的光栅扫描
从一个点获得大数量发射数的过程的自动化方法涉及对样品点非连 续X/Y光栅扫描的光栅文件的产生。这将结合图19和20进行描述。
图19是对用于从图18的点14获得100,000或更多发射数的光栅扫 描模式500的描述。该点14用光栅扫描多次，例如，25次。图19中显示 的符号集502描述了个体的、离散的X/Y位置，其中该点在单一光栅扫描中 被扫描(发射)。根据图中显示的在中心(位置0,0)具有原点的坐标系定义X/Y 位置。在扫描过程中，当激光被引导至每个位置，该位置的点可进行多个发 射数，例如，700或800发射数每位置(position)/位置(location)。从图19中 显示的模式人们可以注意到每个光栅扫描由在点内个体的、离散的位置的发 射组成。顺序实施个体光栅扫描从而避免在点紧邻位置发射。图20显示了 图19的光栅扫描模式对图18的点的叠加。
为如图19所示的光栅扫描产生具有非连续X/Y坐标的25个光栅文 件的过程描述于2012年5月29日提交的美国临时申请61/652,394的附件中， 感兴趣的读者被指向该文件进行进一步参考。
B.使用网格将点分离为子点和子点的光栅扫描
本方法的一个目的是使得手动在样品点(即点A1，点A2，等)上选择 位置/光栅的过程自动化，其在数据获得过程中得到“可接受的”谱，并进 行这一过程直至几十万的谱被添加至累加缓冲器中。累加/平均几十万的谱 增加了信号/噪音比，从而允许检测显著更多的峰，如前所述。
如上述非连续光栅扫描的情况，在如图18所示的样品/基质混合物是 基本上均匀和同质分布于整个点时，本部分描述的网格的使用效果最好。为 达到这个目的的目前优选的方法在本文后面描述，用以稀释并发射血清和芥 子酸(基质)。由于这种均匀分布，我们从而可以从实质上在样品点上所有的 位置/光栅获得谱，其消除了预先对“可接受的”谱评价所有的位置/光栅的 必要性。
在一个样品点上收集几十万个谱可通过定义一个将点14细分为子点 或网格元素18的网格(图17B)来完成，其覆盖了样品点并从子点18中的每 个位置/网格点/光栅收集定义数量的谱，直至期望数量的谱已被加至累加缓 冲器中。之前版本的Bruker软件只允许以自动模式每样品点累加最大20,000 的总谱(图21)。
为了绕开这一限制，我们最初定义了一个5乘5的网格区(图17B， 16)，其将每个样品点分为25个8x 8网格或子点18(图17B)。对每个网格或 子点18产生了分离的光栅文件。该设备被命令在网格18的每个位置/光栅 处获得800个谱(发射)直至20,000谱被加至(谱)累加缓冲器。那时，自动化 方法将命令设备移动至下一个网格或子点18并使用下一个光栅文件和产生 另一个20,000谱。在实践中，人们设计25个光栅文件，每个子点18一个， 其每一个被附加至分开的自动ExecuteTM(Bruker)方法，其根据该方法中建 立的评价标准获得数据。
该过程允许分20,000发射数每批来获得500,000发射谱(20,000发射 谱每格x 25格)，每批使用Bruker的flexcontrolTM软件工具而不必使用成 像应用例如flexImagingTM(Bruker)。该过程的结果是每个样品点25个谱文 件，每个含有一个由20,000发射谱组成的累加谱。这些25个谱文件可以随 后被累加，以产生MALDI板上一个点从500,000发射数获得的总谱，例如， 如图16C、16D和16E所示。
最新版本的flexcontrol TM(Bruker)允许人们累积一个来自最多 500,000发射数的累加谱。例如，在图21中自动ExecuteTM(Bruker)方法编 辑器允许在800发射数的步骤中累加20,000发射数(800发射数每位置/光 栅)。
然而，人们仅能对每个样品点收集一个累加谱(x瞬态谱之和)。为了 从一个单一样品点得到几批累加的谱，我们需要对现有的MS设备中的软件 进行调整。随着这些调整我们可以从一个或几个形成网格的光栅获得谱，例 如上述的那些，并单独存储每个瞬态或位置谱。例如，设备可被命令为收集 并存储图17B的网格或子点18中每个光栅(x,y位置)获得的每个800发射位 置谱，而不必加至累加缓冲器。对在样品点A1、A2、A3等的所有子点重 复相同过程(例如可从250光栅每样品点获得800发射谱＝200,000发射数 每样品点)。可将谱过滤应用于自动Execute TM(Bruker)或不应用来获得位置 谱。
C.图像分析
谱获得的自动化的一个选择是图像处理技术，用以鉴定具有高蛋白得 率/高样品浓度的点上的空间位置，特别是在样品没有在点的空间上均匀分 布、而是集中于离散区域的情况下。在一个可能的实施方式中，设备中包括 的摄像机被用于获得训练点的光学图像。然后，从训练点上一个光栅的位置 获得质谱。得到的质谱与点的光学图像组合被用于产生分类机制以从光学图 像检测从给定样品制备物制备的进一步的点的高得率位置。然后将该分类用 于实际的样品点。虽然这是一种优质解，但我们遇到过捕捉摄像机供给(feed) 和从摄像机图像至激光发射位置的位置可重复校正问题。
一种可选的方法是使用直接为质谱成像方法的形式的质谱仪来考察 点。该想法是首先允许初步扫描并在点上每个精密标度(方形)的位置发射低 数量的发射数(几十个)。对这些光栅位置的每一个收集谱，且对每个位置将 记录总离子流或一些预定义m/z范围内的离子流。基于来自初步扫描过程中 的N最高强度位置产生光栅文件并用于最终获得质谱。该方法利用了Bruker FlexImagingTM软件作为最可行解以在质谱仪成像过程产生多个谱。软件分 析这些谱并产生最终光栅扫描模式。虽然本方法看上去可用于使用芥子酸作 为基质的标准稀释和发射过程，但是其对于其它基质和预先分级的样品集 (例如CLCCA，参见Leszyk,J.D.Evaluation of the new MALDI Matrix 4–Chloro-a-Cyanocinnamic Acid,J.Biomolecular Techniques,21：81-91(2010)) 以及如NOG沉淀的其它方法(Zhang N.等，Effects of common surfactants on protein digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of the digested peptides using two-layer sample preparation.Rapid Commun.Mass Spectrom.18：889-896(2004))可能是次优 的。该可选方法的一个重要方面是在MS成像部分发现获得设定从而不产生 太大的文件。标准的获得文件是兆字节的数量级，以400乘400光栅扫描(400 个位置，400发射数每位置)，我们产生了16,000谱。由于这些谱的需求一 点都不大，且我们只需要估计总离子流，因此我们可以以低分辨率设定进行 工作。可能从自动化谱获得设定来直接获得一系列可用位置，即，得到一系 列成功或失败的获得。从我们的考察来看，看上去使用质量过滤作为MS成 像包的一部分产生一系列通过某些标准的位置(通过文件列表验证)是可能 的。虽然这将很大地帮助产生原型工作流，其还需要通过专门的软件进行优 化以避免半人工过程。
图22显示了使用CLCCA作为基质的一个MALDI点，其中高得率区 域包括线结构，低得率区域作为黑暗区域显示。对于这些其中基质样品非常 不均匀结晶的情形，如图20中所示，成像分析方法似乎最敏感。成像分析 鉴定了相对高得率的区域(120，122)。相对低得率的区域，例如左下方的区 域124和基质区126通过成像分析软件进行鉴定，并在发射过程中被忽略。
鉴定一个点上的高得率和低得率区域的图像分析软件可以为多种形 式，并可以由本领域技术人员开发。例如，点(图19)的黑色和白色图像包括 像素数组，每个具有8比特的量化值，0为黑色(无信号)，255为白色(饱和 的)。可以使用过滤来鉴定相对高得率的区域，例如将像素值大于如100的 像素鉴定为“高得率”，将像素值低于40的像素鉴定为相对“低得率”。然 后可以继续对那些对应像素具有100或更高的值的样品点区域进行扫描。还 可以将其中像素值为240-255的点位置滤除，因为这些区域可被判定为具有 盐结晶或其它导致低得率的性质。再参见图22，晶体结构120,122的像素具 有落入100-240范围内的像素值，从而其将被扫描，而黑色区域124和126 将不会被扫描。还可以使用形态学处理技术以鉴定如图22的晶体120的结 构。图像分析软件可同时包括形态学处理和过滤以确定待扫描的区域。此外， 在扫描过程中可以改变点(由于样品的耗尽)，且在扫描过程中可以运行图像 处理以使得从一个点产生100,000或更多发射数的过程中的发射最优化，而 那些低样品浓度的位置在发射过程中被避免。
图23是来自MALDI-TOF设备的截图，显示设备工作站130的展示， 包括点14的图像132，在此情况下为板上的点F17。板的布局见于12’，其 中点F17在14’指明。选择了一组点134(D9-F20)来使用上述图像分析方法以 自动方式运行。
图24是来自该设备的另一截图。目前的设备运行用户设定评价区以 接受或拒绝瞬态谱(使用评价标签)，设定每个点累加多少谱(使用累加标签) 和跨点“移动”从而激光可以某种模式发射(使用显示的“移动”标签)。选项 包括以例如六边形或螺旋模式随机步进或移动。软件还允许用户保持发射激 光并根据该参数获得和增加总谱，直至从一个发射位置收集了来自750发射 数的谱为止，并随后移动至下一个发射位置。人们可以在发射位置被认为是 一个失败的点之前设定尝试次数。鉴定可能的低得率区域并避免在这些区域 中发射的图像分析方法有助于大量降低或消除那些失败的判断。
图25显示了一个评价页面，其中选择了接受或拒绝瞬态谱的质量范 围，如在150处指出的。在捕获过程中，如果瞬态谱不具有超过阈值集(基 于分辨率、信号强度或其它因素)的预定义范围内的峰——在此情形下为 5,000-18,000Da，那么其将被拒绝。也就是说，该瞬态谱将不被累加至累加 缓冲器以形成位置谱(累加来自所有发射的谱)。
图26显示了一个评价页面，其中如果有人们不想要包括在评价中的 特别的峰，人们可以制作一个排除列表，并将这些峰标记为“背景峰”。软件 已经对基质预定义了“对照列表”，其定义了背景峰，或人们可以导入峰列 表。
从多个点收集谱
一般而言，人们可以将DeepMALDI技术延伸至来自多个点的组合谱。 例如，人们可以从标准MALDI板上的点A1、A2、A3、A4和A5的每一个 获得一个样品的500,000发射数(参见图17A)，并组合(累加)得到的谱至一个 总谱，其由2,500,000个谱(发射)的和组成。可推理，没有理由相信人们不能 从多个点组合谱以达到极其高数量的发射，即，100个点x 1百万发射数每 点可以给我们来自1亿发射的结果。对此过程可能有实践方面的限制，例如， 激光可能因太频繁而失败。
从DeepMALDI中的多个点收集谱的实施例
在本方法的一个实施例中，可能从MALDI板上同一血清的多个点收 集来自5百万发射数的谱，其中使用手动或自动产生的光栅用来使用前述技 术扫描多个点。在本方法中，优选获得MALDI板上单一样品的可再产生的 均质点。这可以使用在此描述的方法获得。
1.将稀释的血清点样至MALDI目标板。
流程：
用HPLC级水1：10稀释血清并漩涡振荡。在0.5ml微量离心管中将样 品与基质(20mg/ml芥子酸，用50％ACN/0.1％TFA配制)1：1(v/v)混合并漩 涡振荡。在MALDI目标的一个或多个点上点样4μl的基质/样品混合物。
在本实施例中使用了MALDI板中的36个点(位置)：
管1：点样在MALDI板的位置E13，E14和E15(参见图2A)
管2：点样在位置E16，E17和E18
管3：点样在位置E19，E20和E21
管4：点样在位置E22，E23和E24
管5：点样在位置F1，F2和F3
管6：点样在位置F4，F5和F6
管7：点样在位置F7，F8和F9
管8：点样在位置F10，F11和F12
管9：点样在位置F13，F14和F15
管10：点样在位置F16，F17和F18
管11：点样在位置F19，F20和F21
管12：点样在位置F22，F23和F24
使用相同的吸管头振荡3次(3x每个管中15ul的4ul)后，样品点 E13-F18(管1-10)被直接使用；而最后6个样品点F19-F24(管11和12)如点 E13-F18中使用，但是还要在板上上下吹吸。
通过将目标板置于台子上使MALDI板上的点在环境温度下干燥。
结果：
对于点E13-F17(其直接应用至板，没有进一步在板上混合)，每个管 的第3个点显然比前两个更均匀。均匀性通过视觉评价：第3个点最好，第 2个次之，第1个最不均匀，除了E23之外，其来自管4的3个点的第2个， 但是看上去比第2个点更像是每个管的第3个点。
在管中漩涡振荡并在板上上下吹吸进行混合的样品点F18、F19、F20、 F21、F23和F24非常相似并具有与来自E13-F17的集合的第3个点相同的 均匀性表现。F22看上去与E23相同。
2.从5百万发射数获得谱
在进行了上述流程后，从16个MALDI点获得了来自约312,500发射 数每点的质谱数据：
E15、E18、E21、E23、E24、F3、F6、F9、F12、F15、F18、F19、F20、 F21、F23和F24。
使用如上所述的光栅扫描文件，来自每个点的谱被累加以产生一个从约 5,000,000发射数获得的样品总谱。
样品应用至MALDI板的优化(点样)
样品应用至MALDI板被优化以对MALDI板上的每个样品点提供同 质和均匀分布的结晶样品，图15中显示了其的一个例子。如下所述进行了 几个实验来发现将样品混合物提供至MALDI板上的点(“点样”)的最优流 程。这些实验在本部分描述。
最初，制备了几个不同的血清制备物。除非另有说明，否则点样2μl 的基质。除非另有说明，否则在样品制备管中混合稀释的样品和基质介质。 除非另有说明，否则我们从一个单一的制备管中没有点样多于1个点，因为 从样品制备管中取出多个等份会影响结晶。
进行了基础钢板(Ground Steel Plate)实验，其产生了均匀的点。流程如 下：
1.1：10稀释样品(2μl样品+18μl水)，然后与50％ACN/0.1％TFA 的基质(芥子酸25mg/ml)1：1(v/v)混合，点样2μl的基质。该流程未产生良 好均质的晶体。
2.装填(prime)基质头。在点样头中吸取2μl的基质并静置30秒。1： 10稀释样品(2μl样品+18μl水)，然后与50％ACN/0.1％TFA的基质(芥子酸 25mg/ml)1：1(v/v)混合。从吸管头射出过量基质。将吸管头放入样品基质混 合物中并吹吸3次。不更换点样头的情况下点样2μl的样品基质混合物。这 一流程形成了良好的均质晶体。因为这是基础钢板，因此样品基质混合物的 展开没有像抛光钢板上那样多。留在吸管头的干燥的晶体可通过作为进一步 晶体形成的种子来改进结晶。
3.研究了温度对结晶的影响。1：10稀释样品(2μl样品+18μl水)， 然后与50％ACN/0.1％TFA的基质(芥子酸25mg/ml)1：1(v/v)混合。将样品 在37℃水浴下放置5分钟。从水浴中移出样品并立即点样。该过程没有产 生良好均质的晶体。
4.重复如上的实验2但是点样4μl的样品而非2μl。该流程形成了 良好的均质晶体。点样4μl完整地覆盖了点的直径，并产生了良好的晶体和 数据。这是目前被认为最优的流程。
在此点样的流程通过实例的方式提供而非限制，来自公开方法的变形 当然是可能的。例如，人们可以在管中混合基质和样品材料并在点样前使其 静置几分钟。已经注意到使用相同吸管头从相同管中制备的点越多则人们得 到更均质的晶体。例如，人们可以使用同一吸管头从同一管点样10个点， 并只收集最后的5个点左右的数据；或可选的人们可以在MALDI板上点样 前弃去来自管的第一轮的5个4μl等份。
我们还发现按照1中的流程但是使用同一吸管头点样同一样品管10 次(2.5μl每个点)至抛光的目标钢板上产生了相似结果(谱质量)。
进一步的考虑
工艺再现性
可通过例如以每天100批的方式运行1,000次工艺重复来进行工艺再 现性研究。人们可以研究对样品(点)制备(板上或板下)的依赖性，特别要考 察是否存在产生更均一的离子流得率的制备方法，例如在样品稀释方面的变 化。人们也可以监控高得率位置的数量是如何从点到点之间变化以及如何最 小化其中的改变。在高水平的粒度下监控和记录所有获得和制备是好的实 践。
样品到样品再现性
样品到样品再现性的相似问题可针对样品到样品的变化进行研究。新 的现象可能发生：可能一些样品富含蛋白质并得到具有更高得率位置的点。 可能从样品属性(光密度和颜色)的一些模式获得检测结果，或使样品获得设 备(例如用于血清的)标准化以产生更可再现的流程。人们可以使用具有尽可 能多样的来源的组合的样品集合来尝试覆盖最多变量。应当从研究现存集合 中获得这样的一个集合，并根据已知样品收集和条件进行匹配，其使得能更 好地使用现存的样品数据库。
灵敏度
观察谱中更多的峰导致了一个问题，即在本方法中我们可以发现多大 的丰度范围，以及什么蛋白种类是事实上可见的。这涉及“常规智慧”，即 在复杂样品的MALDI MS中由于“离子抑制”人们不能观察较低丰度的离 子——一种来自更丰富蛋白的离子抑制来自较低丰富蛋白的离子信号的观 念——从而使得较低丰度蛋白不能检测。该观点看上去完全基于对较低丰度 离子观察的缺失。事实上，我们对峰含量增加的观察(参见例如，图16C)对 此解释提出了一些疑问。相反，看上去人们要认真对待MALDI MS的(半) 定量属性。如果人们同意蛋白丰度以很多数量级跨过一个大的范围，那么人 们可以预期对应的质谱将通过展示峰高度(或者峰下面积)的很大不同来模拟 这一表现。人们将不会预期在MALDI谱中观察到低丰度蛋白，这不是因为 其没有离子化，而是因为对应低丰度蛋白的峰的幅度应该是非常低的。由于 关注大的峰是质谱中的常规实践，且因为较低丰度的峰的将是几个数量级地 更少，因此不奇怪这些峰从未被观察过。这不是说像离子抑制等的现象不会 发生，或离子化概率不发挥作用，而是说这些现象没有完全抑制来自低丰度 蛋白的峰，且如果人们在谱的低强度区域寻找低丰度蛋白峰，它们的确会变 得可观察到。从而可以将覆盖显著比例的血清蛋白质组的寻求视为扩大质谱 动态范围的寻求。正如任何一种其它基于计数的技术，对此问题的简单解决 方案是增加检测离子(每飞行时间箱)的数量。
为了对这种与常规智慧相抵触的简单解释获得更多信心，人们可能希 望建立质谱的动态范围并将其与蛋白丰度关联。这应当同时从建立灵敏度曲 线(作为m/z的函数)的分析化学视角和通过鉴定对应一些峰的对应蛋白质和 通过正交技术如ELISA的这些蛋白的比较性丰度测定来完成。
使用预分级的样品
本公开的方法可联合用于分级样品的沉淀方法例如NOG沉淀、脱液 化等使用。该方法还可与其它基质如CLCCA一起使用。有可能这些方法也 可以从DeepMALDI方法中获益很多。我们使用样品预分级的初步数据表明 人们的确可以看到不同的峰，但是峰含量远远不到最优。这可能被预期为一 个目的是避免高丰度蛋白。
过去我们试图使用消耗和/或质量过滤来降低不想要的蛋白的含量， 如白蛋白和血红蛋白，但是这些方法都不能导致整体去除，这些峰的残余仍 然是可见的。使用在此描述的DeepMALDI方法对于消耗和质量过滤的样品 应该产生更好的结果，因为减少大的峰将同时减少看到较低风度的蛋白所需 要的动态范围。
得到谱获得设定的感性选择
在自动ExecuteTM(Bruker)方法中，可能定义过滤设定以只收集通过 某种标准的瞬态谱；在我们的情形下我们期望仅累加那些具有总离子流大于 外部定义阈值的瞬态谱(来自<xx>数量的发射)。虽然这看上去以简单方式是 不可能的，但是在处理方法标签中有可能被用于简单目的的过滤标准。可选 的，在峰评价方法中可能存在我们能够调节用于该目的的参数。虽然这样不 能减少发射的数量，但是其可以克服相对较早的发射数的发射偏差的问题， 即不获得仅包括噪音的瞬态谱。自动化过滤操作在累加瞬态谱以产生位置谱 中的使用避免了偏差问题。
增加点的大小
由于存在由激光照度大小和由预光栅化步骤的最小网格大小所产生 的限制，很有可能一个标准点上没有具有足够离子得率的足够的发射位置。 解决这个问题的一个简单方法是增加点的大小。FlexImagingTM(Bruker)软件 能很容易地支持这一点。还有在MS成像应用中使用的矩形点样区域的选项， 其可能适合这个目的。使用更大的点的另一个好处是人们不必担心是否能定 位类似数量的合适的(decent)发射位置并产生从一个点到另一个点的相似质 量的谱。看上去样品体积不成为问题。如果更大的点是可能的，其将减少对 同一获得物处理多个点的物流(logistics)，其对高数量的发射可能是必须的。
对“DeepMALDI”方法更进一步的考虑描述于2012年5月29日提交 的美国临时专利申请系列号61/652,394，感兴趣的读者被指向该文件。
基于酵母的免疫治疗和本发明的治疗方法
本公开的一个实施方式指向设计为刺激针对由罹患癌症的患者的肿 瘤细胞表达的癌症抗原的治疗性免疫应答的基于酵母的免疫治疗组合物的 使用。该方法包括对患有表达癌症抗原的癌症的对象和已通过根据如本文描 述的发明的质谱预测方法被鉴定或选择作为可能从施用组合物中受益的对 象施用针对癌症(即，包括癌症抗原)的基于酵母的免疫治疗组合物的步骤。
更具体的，在一方面，描述了一种用基于酵母的癌症免疫疗法治疗癌 症患者的方法。该方法包括以下步骤：(a)执行按照本文描述的任一预测方法 的测试，如果对谱的分类标签表明患者可能从基于酵母的癌症免疫治疗中受 益，则(b)施用基于酵母的癌症免疫治疗。在一方面，患者在基于酵母的癌症 免疫治疗之前、同时或之后被另外进行一种或多种额外的抗癌治疗。在一个 实施方式中，额外的抗癌治疗包括但不限于手术(例如，手术切除肿瘤)、化 疗、放疗、靶向癌症治疗(例如，小分子药物或特异性靶向肿瘤生长和发展 中涉及的分子的单克隆抗体疗法)、和姑息治疗，或其任意组合。
在另一方面，本公开涉及使用基于酵母的癌症免疫疗法治疗癌症患者 的方法。该方法包括对根据任一如本文描述的发明的预测方法的测试选择的 癌症患者施用基于酵母的癌症免疫治疗的步骤，其中谱的分类标签显示患者 有可能从基于酵母的癌症免疫治疗中受益。在一方面，患者在基于酵母的癌 症免疫治疗之前、同时或之后被另外进行一种或多种额外的抗癌治疗。在一 个实施方式中，额外的抗癌治疗包括但不限于手术(例如，手术切除肿瘤)、 化疗、放疗、靶向癌症治疗(例如，小分子药物或特异性靶向肿瘤生长和发 展中涉及的分子的单克隆抗体疗法)、和姑息治疗，或其任意组合。
在本公开的另一方面，描述了一种用针对突变Ras阳性癌症的基于酵 母的免疫疗法治疗癌症患者的方法。该方法包括以下步骤：(a)执行根据上述 任何一种预测方法的测试，如果对谱的分类标签表明患者可能从针对突变 Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗中受益，则(b)施用针对突变Ras阳性癌 症的基于酵母的免疫治疗。在一方面，在进行针对突变Ras阳性癌症的基于 酵母的免疫治疗之前、同时或之后，患者被另外进行一种或多种额外的抗癌 治疗。在一个实施方式中，针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗是 一系列称为GI-4000或等价物的基于酵母的免疫治疗产品中的一种产品。在 本发明这一实施方式的一个方面，突变Ras阳性癌症可包括但不限于胰腺 癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑色素瘤 和多发性骨髓瘤。在一方面，该癌症是胰腺癌。在一个实施方式中，额外的 抗癌治疗包括但不限于手术(例如，手术切除肿瘤)、化疗、放疗、靶向癌症 治疗(例如，小分子药物或特异性靶向肿瘤生长和发展中涉及的分子的单克 隆抗体疗法)、和姑息治疗，或其任意组合。在一方面，针对突变Ras阳性 癌症的基于酵母的免疫治疗协同吉西他滨或等价物对患者进行治疗。在一个 实施方式中，患者是胰腺癌患者，该治疗包括单独或联合吉西他滨的一系列 称为GI-4000或等价物的基于酵母的免疫治疗产品中的一种产品。在一方面， 癌症患者的肿瘤在用基于酵母的免疫治疗组合物治疗之前已被手术切除。
在本公开的另一方面，描述了一种用基于酵母的癌症免疫疗法治疗癌 症患者的方法。该方法包括对根据任一如本文描述的发明的预测方法的测试 选择的癌症患者施用针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的癌症免疫治疗的 步骤，其中谱的分类标签表明患者有可能从针对突变Ras阳性癌症的基于酵 母的免疫治疗中受益。在一方面，在进行针对突变Ras阳性癌症的基于酵母 的免疫治疗之前、同时或之后，患者被另外进行一种或多种额外的抗癌治疗。 在一个实施方式中，针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗是一系列 称为GI-4000或等价物的基于酵母的免疫治疗产品中的一种产品。在本发明 这一实施方式的一个方面，突变Ras阳性癌症可包括但不限于胰腺癌、非小 细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑色素瘤和多发性 骨髓瘤。在一方面，该癌症是胰腺癌。在一个实施方式中，额外的抗癌治疗 包括但不限于手术(例如，手术切除肿瘤)、化疗、放疗、靶向癌症治疗(例如， 小分子药物或特异性靶向肿瘤生长和发展中涉及的分子的单克隆抗体疗 法)、和姑息治疗，或其任意组合。在一方面，针对突变Ras阳性癌症的基 于酵母的免疫治疗协同吉西他滨或等价物对患者进行治疗。在一个实施方式 中，患者是胰腺癌患者，该治疗包括单独或联合吉西他滨的一系列称为 GI-4000或等价物的基于酵母的免疫治疗产品中的一种产品。在一方面，癌 症患者的肿瘤在用基于酵母的免疫治疗组合物治疗之前已被手术切除。
本公开使用术语“基于酵母的免疫治疗”，其短语可被可交换的与“基 于酵母的免疫治疗性组合物”、“基于酵母的免疫治疗产品”、“基于酵母的免 疫治疗组合物”、“基于酵母的组合物”、“基于酵母的免疫疗法”、“基于酵母 的疫苗”、或这些短语的衍生物一起使用。如本文使用的基于酵母的免疫治 疗组合物指一种组合物，其包括酵母载体组份和靶向对象中的疾病或状况的 抗原组分(即，针对癌症的基于酵母的免疫治疗组合物包括酵母载体组份和 靶向患者癌症的癌症抗原组分)。包括在本发明中使用的突变Ras抗原的基 于酵母的免疫治疗组合物靶向患者的突变Ras阳性肿瘤。该组合物可被称为 “酵母-Ras免疫治疗组合物”、或“表达Ras抗原的基于酵母的免疫治疗组合 物”、或“针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗”。针对突变Ras阳 性癌症的基于酵母的免疫治疗包括但不限于一系列基于酵母的免疫治疗产 品，称为“GI-4000”。
连接酵母载体的在基于酵母的免疫治疗产品中包括的癌症抗原(例 如，突变Ras抗原)最通常作为重组蛋白通过酵母载体表达(例如，通过完整 酵母或酵母原生质体，其可选的可被进一步处理为酵母胞质体、酵母鬼(yeast ghost)或其酵母膜提取物或碎片)，虽然以下也是本发明的实施方式：一种或 多种该癌症抗原被上载至酵母载体或以其他方式与酵母载体杂合、吸附、混 合或与其一起施用以形成本发明使用的组合物。
在本发明的一个方面，用于本发明的一种或多种基于酵母的免疫治疗 组合物的抗原包括任何癌症或肿瘤相关抗原。在一方面，抗原包括与肿瘤出 现前或增生状态相关的抗原。抗原还可以与癌症相关或称为癌症的原因。这 一抗原可以是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原(TAA)或组织特异性抗原，其 表位或其表位激动剂。癌症抗原包括但不限于来自任何肿瘤或癌症的抗原， 包括但不限于，黑素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈部癌、甲状腺癌、软组 织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血 管肉瘤、血管内皮瘤、肥大细胞肿瘤、白血病、淋巴瘤、主肝癌症、肺癌、 胰腺癌、胃肠道癌(包括结肠直肠癌)、肾细胞癌、造血瘤及其转移性癌症。
合适的癌症抗原包括但不限于突变Ras癌蛋白(参见，例如，美国专利 号7,465,454和7,563,447)、癌胚抗原(CEA)及其表位例如CAP-1、 CAP-1-6D(GenBank登录号M29540或Zaremba等，1997，Cancer Research 57：4570-4577)、MART-1(Kawakami等，J.Exp.Med.180：347-352，1994)、 MAGE-1(美国专利号5,750,395)、MAGE-3、GAGE(美国专利号5,648,226)、 GP-100(Kawakami等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA91：6458-6462，1992)、 MUC-1(例如，Jerome等，J.Immunol.，151：1654-1662(1993))、MUC-2、 正常和突变p53癌蛋白(Hollstein等，Nucleic Acids Res.22：3551-3555，1994)、 PSMA(前列腺特异性膜抗原；Israeli等，Cancer Res.53：227-230，1993)、 酪氨酸酶(Kwon等，PNAS 84：7473-7477，1987)、TRP-1(gp75)(Cohen等， Nucleic Acid Res.18：2807-2808，1990；美国专利号5,840,839)、NY-ESO-1(Chen 等，PNAS 94：1914-1918、1997)、TRP-2(Jackson等，EMBOJ，11：527-535、 1992)、TAG72、KSA、CA-125、PSA(前列腺特异性抗原；Xue等，The Prostate， 30：73-78(1997))、HER-2/neu/c-erb/B2、(美国专利号5,550,214)、EGFR(表 皮生长因子受体；Harris等，Breast Cancer Res.Treat，29：1-2(1994))、hTERT、 p73、B-RAF(B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；Sithanandam等，(1990)， Oncogene 5(12)：1775–80)、腺瘤性结肠息肉病(APC)、Myc、von Hippel-Lindau 蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1(也称为P-糖蛋 白)、Flt-3、BRCA-1(乳腺癌1；美国专利号5,747,282)、BRCA-2(乳腺癌2； 美国专利号5,747,282))、Bcr-Abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、Brachyury(GenBank 登录号NP_003172.1或NM_003181.2；Edwards等，1996，Genome Res.6： 226-233)、HERV-H(人内源性逆转录病毒H)、HERV-K(人内源性逆转录病毒 K)、TWIST(GenBank登录号NM_000474和NP_000465)、Mesothelin(Kojima 等，1995，J.Biol.Chem.270(37)：21984–90；Chang和Pastan，1996，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1)：136–40)、NGEP(前列腺中表达的新基因；Bera 等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(9)：3059-3064；Cereda等，2010， Cancer Immunol.Immunother.59(1)：63-71；GenBank登录号AAT40139或 AAT40140)、这些抗原和组织特异性抗原的修饰、这些抗原的剪接变体、和 /或这些抗原的表位激动剂。其它癌症抗原是本领域已知的。其它癌症抗原 也可通过本领域已知的方法进行鉴定、分离和克隆，例如那些描述于美国专 利号4,514,506中的。癌症抗原也可以包括一种或多种生长因子和每个的剪 接变体。
在本发明的一个方面，癌症抗原是癌胚抗原(CEA)、包括其表位或由 其表位组成的多肽例如CAP-1、CAP-1-6D(GenBank登录号M29540或 Zaremba等，1997，Cancer Research 57：4570-4577)、修饰的CEA、CEA的 剪接变体、这些CEA蛋白的表位激动剂、和/或包括CEA至少一种免疫原 性域的融合蛋白或其表位激动剂。在一方面，CEA是修饰的CEA，其对应 具有由2007年3月1日出版的美国专利公开号US 2007_0048860中的SEQ ID NO：46表示的氨基酸序列的修饰的CEA，其由该出版物中SEQ ID NO： 45的核酸序列编码。
在本发明的一个方面，该基于酵母的免疫治疗组合物靶向人鼠短尾突变 体表型(Brachyury)。鼠短尾突变体表型抗原和靶向鼠短尾突变体表型的基于 酵母的免疫治疗组合物已被描述于2012年9月20日出版的PCT公开号 2012/125998。
在本发明的一个方面，该基于酵母的免疫治疗组合物靶向粘蛋白 -1(MUC-1)。MUC-1抗原和靶向MUC-1的基于酵母的免疫治疗组合物已被 描述于2013年2月21日出版的PCT公开号2013/025972。
在本发明的一个方面，基于酵母的免疫治疗组合物靶向突变Ras阳性 癌症。Ras是一个原癌基因，其中已知几个突变发生在特定位置处且与一种 或多种类型的癌症的发展有关。因此，针对突变Ras阳性癌症的基于酵母的 免疫治疗产品包括至少一个Ras的免疫原区，其包含一个已知在某种癌症中 突变的氨基酸残基。这些癌症包括但不限于胰腺癌、NSCLC、结肠直肠癌、 子宫内膜和卵巢癌以及黑素瘤和多发性骨髓瘤。在一方面，针对突变Ras阳 性癌症的基于酵母的免疫治疗产品含有两个、三个或更多Ras的免疫原区， 其中每个区包含一种或多种已知在某种癌症中发生的不同的Ras突变，以覆 盖几个或所有已知的Ras蛋白中的突变。例如，在本发明的一个方面，基于 酵母的免疫治疗组合物中使用的Ras抗原至少包括野生型Ras蛋白的5-9个 连续氨基酸残基，其包含相对于野生型Ras蛋白的氨基酸位点12、13、59、 61、73、74、75、76、77和/或78，其中位点12、13、59、61、73、74、 75、76、77和/或78的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白是突变的。在一 方面，癌症抗原包括：(a)包括野生型Ras蛋白的至少来自位点4-20或至少 来自位点8-16的蛋白，除了位点12处的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白 是突变的；(b)包括野生型Ras蛋白的至少来自位点5-21或至少来自位点9-17 的蛋白，除了位点13处的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白是突变的；(c) 包括野生型Ras蛋白的至少来自位点51-67或至少来自位点55-63的蛋白， 除了位点59处的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白是突变的；(d)包括野生 型Ras蛋白的至少来自位点53-69或至少来自位点57-65的蛋白，除了位点 61处的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白是突变的；(e)包括野生型Ras蛋 白的至少来自位点65-81或至少来自位点69-77的蛋白，除了位点73处的氨 基酸残基相对于野生型Ras蛋白是突变的；(f)包括野生型Ras蛋白的至少来 自位点66-82或至少来自位点70-78的蛋白，除了位点74处的氨基酸残基相 对于野生型Ras蛋白是突变的；(g)包括野生型Ras蛋白的至少来自位点67-83 或至少来自位点71-79的蛋白，除了位点75处的氨基酸残基相对于野生型 Ras蛋白是突变的；(h)包括野生型Ras蛋白的至少来自位点69-84或至少来 自位点73-81的蛋白，除了位点77处的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白 是突变的；(i)包括野生型Ras蛋白的至少来自位点70-85或至少来自位点 74-82的蛋白，除了位点78处的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白是突变的； 和/或(j)包括野生型Ras蛋白的至少来自位点68-84或至少来自位点72-80的 蛋白，除了位点76处的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白是突变的。注意 这些位点大致对应于K-Ras、N-Ras和H-Ras蛋白和人和小鼠序列，以及其 它，因为人和小鼠的序列在Ras蛋白的这些区域是相同的，且因为K-Ras、 N-Ras和H-Ras在Ras蛋白的这些区域是相同的。
本文使用的术语“GI-4000”一般指一系列基于酵母的免疫治疗组合物 (产品)，其中每种基于酵母的免疫治疗组合物表达一种或多种 Ras突变，其靶向人癌症中观察到的Ras突变。这些突变与肿瘤发展有关。 作为在临床使用和本文实施例中描述的GI-4000目前包括一系列的4种基于 酵母的免疫治疗产品版本，分别表示为GI-4014、GI-4015、GI-4016和 GI-4020。每个版本是一种热失活的、完全的(完整的)酿酒酵母，其重组表达 含有独特组合的3种Ras突变(一个突变位于相对天然Ras蛋白的位点12处， 两个不同的突变位于相对天然Ras蛋白的位点61处)的融合蛋白，其一起靶 向7种人类癌症中观察到的最常见的Ras突变(4种不同的位点12突变和3 种不同的位点61突变)。在GI-4000临床研究中，每名患者的肿瘤被进行测 序以鉴定该患者的肿瘤中包含的具体Ras突变，然后施用含有鉴定的突变蛋 白的对应酵母-Ras免疫治疗产品。GI-4000系列的每种产品被单独生产和装 瓶。
更具体的，由目前临床上使用的GI-4000产品系列(分别称为GI-4014、 GI-4015、GI-4016和GI-4020)中的基于酵母的免疫治疗组合物所表达的每种 融合蛋白都具有大致有以下整体结构的氨基酸序列，从N端到C端：(1)两 个氨基酸的N端肽序列(M-V)，(2)对应Ras位点56-67的氨基酸序列，其具 有对应天然Ras蛋白的位点61处的单氨基酸取代，和(3)对应Ras位点2-165 的氨基酸序列，其具有分别对应天然Ras蛋白的2个位点12和61处的2个 单氨基酸取代。每种融合蛋白中3个氨基酸取代的具体组合将融合蛋白彼此 区分。靶向突变Ras阳性癌症的基于酵母的免疫治疗产品中的其他结构和免 疫原区的组织是可能的，并详述于，例如，美国专利号7,465,454。
编码GI-4014的构建体的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列分别表示为 SEQ ID Nos：1和2。GI-4014包括以下Ras突变：Q61L-G12V-Q61R。编码 GI-4015的构建体的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列分别表示为SEQ ID Nos：3和4。GI-4015包括以下Ras突变：Q61L-G12C-Q61R。编码GI-4016 的构建体的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列分别表示为SEQ ID Nos：5和6。 GI-4016包括以下Ras突变：Q61L-G12D-Q61R。编码GI-4020的构建体的 核苷酸序列和翻译的氨基酸序列分别表示为SEQ ID Nos：7和8。GI-4020 包括以下Ras突变：Q61L-G12R-Q61H。
本发明还包括使用任一上述Ras抗原的同源物。在一方面，本发明包 括使用Ras抗原，其具有与本文描述的任一Ras抗原至少85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或 99％同一性的氨基酸序列，包括通过本文的具体序列标识符引用的任一Ras 抗原，其全长蛋白或融合蛋白，或关于融合蛋白或定义的蛋白或其结构域(免 疫原区或功能区(即具有至少一种生物活性的结构域))中一个定义的片段，其 形成融合蛋白的一部分。除非另有说明，否则如本文使用的对百分比(％)同 一性的引用指的是同源性的评价，其使用以下方式进行：(1)BLAST 2.0基 础BLAST同源性搜索，以标准的缺省参数使用blastp进行氨基酸检索， blastn进行核酸检索，其中查询序列默认被过滤用于低复杂度区域(描述于 Altschul，S.F.，Madden，T.L.，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.， Miller，W.&Lipman，D.J.(1997)"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs."Nucleic Acids Res.25： 3389-3402，在此全文引入作为参考)；(2)BLAST 2对齐(使用下述参数)；(3) 和/或使用标准缺省参数的PSI-BLAST(位点特异性迭代BLAST)。
在本发明使用的任一基于酵母的免疫治疗组合物中，以下涉及酵母载 体的方面被包括在本发明中。根据本发明，酵母载体是任何酵母细胞(例如， 全细胞或完整细胞)或其衍生物(参见下文)，其能被用于在本发明使用的治疗 组合物中配合一种或多种抗原、其免疫原区或其表位。从而酵母载体可包括 但不限于活的完整(全)酵母微生物(即，具有所有元件的酵母细胞，包括细胞 壁)，被杀死的(死的)或失活的完整酵母微生物，或完整/全酵母衍生物，包 括：酵母原生质体(即，缺少细胞壁的酵母细胞)、酵母细胞质(即，缺少细胞 壁和细胞核的酵母细胞)、酵母鬼(ghost)(即，缺少细胞壁、细胞核和细胞质 的酵母细胞)、亚细胞酵母膜提取物或其片段(也称为酵母膜颗粒，之前称为 亚细胞酵母颗粒)、任何其他酵母颗粒或酵母细胞壁制备物。这些酵母载体 详述于例如，美国专利号5,830,463、美国专利号7,083,787和美国专利号 7,736,642，其公开内容在此引入作为参考。
可以使用任何酵母菌株来产生本发明使用的基于酵母的免疫治疗产 品。可用于本发明的酵母属包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces)、假丝酵 母(Candida)、隐球酵母(Cryptococcus)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母 (Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、红酵母(Rhodotorula)、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)和耶氏酵母(Yarrowia)。可用于本发明的酵母种包括但 不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白假丝酵母(Candida albicans)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、 热带假丝酵母(Candida tropicalis)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、新 型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)、多 形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、变种乳酸马克思克鲁维酵母 (Kluyveromycesmarxianus var.lactis)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、深红酵母 (Rhodotorularubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和解脂耶氏酵 母(Yarrowialipolytica)。要理解很多这些种包括大量亚种、分型、亚型等等， 其也确定为被包括在前述各种之内。
用于生产本发明使用的基于酵母的免疫治疗产品的方法之前已被描 述于，例如美国专利号5,830,463、美国专利号7,083,787和美国专利号 7,736,642，其公开内容在此引入作为参考。一般的，本发明使用的基于酵母 的免疫治疗产品已被杀死或失活。杀死或失活酵母可通过任何一种本领域已 知的多种合适的方法来实现。例如，酵母热失活是一种标准的失活酵母的方 式，本领域技术人员可以通过本领域已知的标准方法来监控目标抗原的结构 变化，如果需要的话。可选的，可以使用其它失活酵母的方法。例如化学法、 电击法、辐射法或紫外线法。
可使用多种本领域技术人员已知的技术将酵母载体配制入本发明的 基于酵母的免疫治疗组合物或产品，包括待给对象施用的制备物。例如，可 通过冻干来干燥酵母载体。也可以通过将酵母填充在蛋糕或片剂中来制备包 括酵母载体的剂型，例如对用于烘焙或酿造操作的酵母所做的那样。此外， 酵母载体可以与药学可接受的赋形剂混合，例如宿主或宿主细胞耐受的等渗 缓冲液。这样的赋形剂的例子包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、汉 克溶液和其他水性质的生理平衡盐溶液。也可以使用非水载体，如固定油、 芝麻油、油酸乙酯、甘油三酯。其他有用的剂型包括包含增粘剂的悬浮液， 如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、甘油或右旋糖酐。赋形剂也可以包含少量的 添加剂，如提高等渗性和化学稳定性的物质。标准的剂型可以是液体注射剂 或固体，后者可以被置于一种合适的液体中作为用于注射的悬液或溶液。因 此，在非液体剂型中，赋形剂可包括例如葡萄糖、人血清白蛋白和/或防腐 剂，在给药前可向其中添加无菌水或盐水。组合物应该被配制为适合对人类 对象给药(例如，生产条件应适于在人类中使用，且用于结束组合物和/或制 备待给药的免疫治疗剂的任一赋形剂或剂型应当适于对人类使用)。在本发 明的一个方面,基于酵母的免疫治疗组合物被配制用于患者或对象的注射给 药，例如通过非肠道途径(如通过皮下、腹腔内、肌肉内或皮内注射，或另 一种合适的非肠道途径)。
治疗方法包括将基于酵母的免疫治疗组合物递送(给药、免疫)至对象 或个体。给药过程可以体外或体内进行，但通常是体内进行。基于酵母的免 疫治疗组合物的给药可以是全身性的、粘膜性的和/或邻近目标位点的位置 (例如，靠近肿瘤位点)。合适的给药途径对于本领域技术人员而言是显而易 见的，其取决于待预防或治疗的癌症和/或目标细胞群或组织的类型。各种 可接受的给药方法包括，但不限于，静脉内给药、腹膜内给药、肌内给药、 结内给药、冠状动脉内给药、动脉内给药(例如，至颈动脉内)、皮下给药、 经皮递送、气管内给药、关节内给药、心室内给药、吸入(例如，气雾剂)、 颅内、脊柱内、眼内、耳内、鼻内、口服、肺部给药、导管注入、和直接注 射入组织。在一个方面，给药途径包括：静脉内、腹膜内、皮下、皮内、结 内、肌肉内、经皮、吸入、鼻内、口服、眼内、关节内、颅内、和脊柱内。 肠胃外递送可以包括皮内、肌内、腹膜内、胸膜内、肺内、静脉内、皮下、 心房导管和肾(venal)导管的途径。耳部给药可包括滴耳液，鼻腔给药可以包 括滴鼻剂或鼻内注射，眼部给药可包括眼药水。也可以使用本领域的标准方 法进行气溶胶(吸入)递送(参见，例如，Stribling等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189：11277-11281，1992)。在一个方面，本发明的基于酵母的免疫治疗组合 物从皮下给药。在一个方面，基于酵母的免疫治疗组合物直接给药至肿瘤周 围。
通常，合适的单一剂量的基于酵母的免疫治疗组合物是在一个合适的 时间段内给药一次或多次时，能够对给定的细胞类型、组织或患者身体区域 以有效引发针对一种或多种癌症抗原或表位的抗原特异性免疫应答的数量 有效提供酵母载体和癌症抗原的剂量。例如，在一个实施方式中，可用于本 发明的单一剂量的基于酵母的免疫治疗剂为约1x 105至约5x 107酵母细胞 当量每公斤被给药该组合物的生物体体重。在一方面，可用于本发明的单一 剂量的基于酵母的免疫治疗剂为从约0.1Y.U.(1x 106细胞)至约100Y.U.(1x 109细胞)每剂量(即，每生物体)，包括任意中间剂量，以0.1x 106细胞的增 量(即，1.1x 106、1.2x 106、1.3x 106...)递增。本文使用的术语“Y.U.”是一个 “酵母单位”或“酵母细胞当量”，其中1个Y.U.＝1千万酵母细胞。在一个实 施方式中，剂量包括1Y.U-40Y.U.的剂量、1Y.U.-50Y.U.的剂量、1Y.U.-60Y.U. 的剂量、1Y.U.-70Y.U.的剂量、或1Y.U.-80Y.U.的剂量，在一方面，为10 Y.U.-40Y.U.、50Y.U.、60Y.U.、70Y.U.、或80Y.U.。在一个实施方式中， 该剂量在个体的不同位置但在同一时间段给药。例如，40Y.U.的剂量可通过 在一个给药阶段注射10Y.U.的剂量至个体的4个不同位置处进行给药，或 20Y.U.的剂量可通过在同一个给药阶段注射5Y.U.的剂量至个体的4个不同 位置处、或注射10Y.U.的剂量至个体的2个不同位置处进行给药。本发明 包括在个体的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同位置给药一个 数量的基于酵母的免疫治疗组合物(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、910、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20Y.U.或更多)来形成一个单一剂 量。
当例如针对抗原的免疫应答减弱时或根据需要时，施用基于酵母的免 疫治疗组合物的"增强剂(Boosters)"或"增强"，以针对特定抗原或抗原组提供 免疫应答或记忆应答。增强剂可在初始给药后间隔约1、2、3、4、5、6、7 或8个周、至每月、至双月、至每季、至每年、至几年进行给药。在一个实 施方式中，给药时间表是其中单一剂量在从几周、至几个月、至几年的时间 段内给药至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在一个实施方式 中，药剂每周给药1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂量，然后根据 获得期望的治疗效果的需要而每月给药。即使患者的肿瘤复发或在患者被相 信已缓和之后，也可以给药额外的剂量。
在一方面，个体用至少一种其它可用于癌症治疗(抗癌治疗)的治疗化 合物或治疗方案进行治疗。可用于癌症治疗的额外的试剂、组合物或方案(例 如，治疗方案)包括但不限于化疗、手术切除肿瘤、放疗、同种异体或自体 干细胞移植、细胞因子疗法、继承性T细胞转移、和/或给药第二免疫治疗 组合物(例如，额外的基于酵母的免疫疗法、基于重组病毒的免疫疗法(病毒 性载体)、细胞因子治疗、免疫刺激剂治疗(包括具有免疫刺激属性的化疗)、 DNA疫苗和其它免疫治疗组合物和/或靶向癌症治疗(例如，小分子药物、生 物制剂或特异性针对参与肿瘤的生长和发展的分子的单克隆抗体治疗，包括 但不限于，选择性雌激素受体调节剂(SERMs)、芳香酶抑制剂、酪氨酸激酶 抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂、类维 生素A受体活化剂、凋亡刺激剂、血管生成抑制剂、聚(ADP-核糖)聚合酶 (PARP)抑制剂或免疫刺激剂)。可以在本发明的免疫治疗组合物之前、同时、 交替或之后，或在不同时间点施用这些额外的治疗剂和/或治疗方案。例如， 当配合化疗或靶向癌症治疗对一名个体给药时，可以在化疗或靶向癌症治疗 的多个剂量之间的“假期”中施用基于酵母的免疫治疗组合物，以最大化免 疫治疗组合物的效果。手术切除肿瘤可经常先于施用基于酵母的免疫治疗组 合物，但是额外的或初级的手术也可以在施用基于酵母的免疫治疗组合物过 程中或之后发生。
例如，在本文描述的发明的治疗方法的任一实施方式中，在一方面， 当个体患有癌症时，该个体在进行治疗或已被另一种癌症疗法治疗过。这些 治疗可包括本文之前描述的任何治疗方案或使用任何治疗化合物或试剂，包 括但不限于，化疗、放疗、靶向癌症治疗、手术切除肿瘤、干细胞移植、细 胞因子疗法、继承性T细胞转移、和/或给药第二免疫治疗组合物。在给药 第二免疫治疗组合物的情形中，该组合物可包括但不限于额外的基于酵母的 免疫治疗、基于重组病毒的免疫疗法(病毒性载体)、免疫刺激剂治疗(包括具 有免疫刺激属性的化疗)、DNA疫苗和其它免疫治疗组合物)。
如本文使用的，“治疗”癌症或其任意排列(例如，“癌症治疗”，等) 一般指一旦癌症已经发生(例如，一旦癌症在个体中被诊断或检测到)，则施 用本发明的基于酵母的免疫治疗组合物，其具有治疗的至少一种治疗目的 (与不存在该治疗相比)，包括：减少肿瘤负担；抑制肿瘤的生长；增加个体 的无复发生存率；增加个体的总存活数；推迟、抑制、阻止或预防转移性癌 症的发生或发展(例如通过延迟、抑制、阻止或预防肿瘤转移的发展的发生 和/或肿瘤入侵初级癌症以外的组织和/或其他与转移性癌症的进展有关的过 程)；延迟或阻止癌症的发展；提高对肿瘤的免疫应答；改善针对肿瘤抗原 的长期记忆免疫应答；和/或改善个体的整体健康。“预防”或“防止”癌症，或 其任意排列(例如，“癌症预防”等)一般指在癌症发生前或癌症中癌症或肿瘤 抗原表达的具体阶段发生前施用本发明的组合物，其具有治疗的至少一种目 的(与不存在该治疗相比)，包括：预防或延缓癌症的发生或发展，或者如果 在治疗后发生癌症，至少减轻癌症的严重程度(例如，减少肿瘤的生长水平、 阻止癌症进展、改善对癌症的免疫应答、抑制转移过程)或改善个体的结果(例 如，改善无复发生存率和/或总存活数)。
在本发明的治疗方法中，基于酵母的免疫治疗组合物和其它抗癌疗法 可对任何动物施用，包括任何脊椎动物，特别是任何脊椎动物类、哺乳纲的 成员，包括但不限于灵长类、啮齿类、家畜和宠物。“个体”是脊椎动物， 例如哺乳动物，包括但不限于人类。术语“个体”可以与术语“动物”、“对象” 或“患者”替换使用。
根据本发明，术语“抗原”在本文中的使用指的是：蛋白(肽、部分 蛋白、全长蛋白)的任何部分，其中蛋白是天然产生或合成来源的；细胞组 合物(全细胞、细胞裂解物或破碎的细胞)；生物体(完整生物体、裂解物或破 碎的细胞)；或碳水化合物或其它分子或其部分。抗原可诱发针对同一抗原 或免疫系统的一个元件(例如，T细胞、抗体)遇到过的相似抗原的抗原特异 性免疫应答(例如体液和/或细胞介导的免疫应答)。
抗原可以小至一个单一表位、一个单一免疫原区或更大，并可包括多 个表位或免疫原区。从而，抗原的大小可以小至约8-12个氨基酸(即，一个 肽)，和大至：全长蛋白、多聚体、融合蛋白、嵌合蛋白、全细胞、全微生 物、或其任意部分(例如，全细胞裂解物或微生物提取物)。此外，抗原可包 括碳水化合物，其可被加载至酵母载体或本发明的组合物中。将理解在一些 实施方式中(例如当抗原通过酵母载体从重组核酸分子中表达时)，抗原是蛋 白、融合蛋白、嵌合蛋白或其片段，而非整细胞或微生物。
当要在酵母中表达抗原时，抗原具有能在酵母中重组表达的最小大 小，通常为至少或多于25个氨基酸的长度，或至少或多于26、至少或多于 27、至少或多于28、至少或多于29、至少或多于30、至少或多于31、至少 或多于32、至少或多于33、至少或多于34、至少或多于35、至少或多于 36、至少或多于37、至少或多于38、至少或多于39、至少或多于40、至少 或多于41、至少或多于42、至少或多于43、至少或多于44、至少或多于 45、至少或多于46、至少或多于47、至少或多于48、至少或多于49、或至 少或多于50个氨基酸的长度，或至少25-50个氨基酸的长度，至少30-50 个氨基酸的长度，或至少35-50个氨基酸的长度，或至少40-50个氨基酸的 长度，或至少45-50个氨基酸的长度。可以表达较小的蛋白，也可以表达相 当大的蛋白(例如，几百个氨基酸的长度或甚至数千个氨基酸的长度)。在一 方面，可以表达全长蛋白，或其结构或功能域，或其免疫原区，其从N端 和/或C端缺少一个或多个氨基酸(例如，从N端和/或C端缺少约1个至约 20个氨基酸)。融合蛋白和嵌合蛋白也是可在本发明中表达的抗原。“靶抗 原”是由本发明的免疫治疗组合物特异性靶向的抗原(即，期望针对其引发 免疫应答的抗原)。例如，“Ras抗原”是一种从一种或多种Ras蛋白来源、设 计或生产的抗原，从而靶向该抗原还靶向对应的由肿瘤表达的Ras蛋白。“突 变Ras抗原”特别指含有一种或多种氨基酸突变的Ras抗原。为了用于本发 明，这些突变对应于在肿瘤中的Ras蛋白中发现的突变，且关联肿瘤发展和 /或肿瘤进展。
当提及刺激免疫应答时，术语“免疫原”是术语“抗原”的子集，从而， 在一些情况下，其可被与术语"抗原"可交换的使用。本文使用的免疫原描述 了一种抗原，其引发体液和/或细胞介导的免疫应答(即，是免疫原性的)，从 而对个体施用免疫原诱发(mount)针对同一抗原或个体免疫系统遇到过的相 似抗原的抗原特异性免疫应答。在一个实施方式中，基于酵母的免疫治疗组 合物中包含的免疫原诱发细胞介导的免疫应答，包括CD4+T细胞应答(例 如，TH1、TH2和/或TH17)和/或CD8+T细胞应答(例如，CTL应答)。
给定抗原的“免疫原区”可以是抗原的任意部分、片段或表位(例如， 肽片段或亚单位或抗体表位或其它构像表位)，其含有至少一个在对动物给 药时作为免疫原的表位。因此，免疫原区大于一个单一氨基酸，且至少具有 足以含有一个可作为免疫原的表位的大小。例如，单一蛋白可含有多个不同 免疫原区。免疫原区不必是蛋白中的线性序列，例如在体液免疫应答的情形 中，其中考虑构象区。
本文将表位定义为给定抗原内的单一免疫原性位点，其在合适的共刺 激信号和/或免疫系统的活化细胞的背景下对免疫系统提供时足以诱发免疫 应答。换而言之，表位是抗原的一部分，其事实上被免疫系统的元件所识别， 还可被称为抗原决定簇。本领域技术人员将认可T细胞表位的大小不同， 且来自B细胞或抗体表位和通过I型MHC途径呈递的表位的组合物在大小 和结构属性方面不同于通过II型MHC途径呈递的表位。例如，通过I型 MHC分子呈递的T细胞表位通常为8-11个氨基酸的长度，而通过II型MHC 分子呈递的表位在长度方面较少限制，可以是从8个氨基酸一直到25个氨 基酸或更长。此外，T细胞表位根据该表位结合的具体MHC分子具有预测 的结构特性。表位可以是线性序列表位或构像表位(保守结合区)。大多数抗 体识别构像表位。
虽然已经详细描述了本发明的各种实施方式，但是显然从这些实施方 式的修饰和改编会被本领域技术人员所想到。然而，将清楚地理解，这些修 饰和改编是在本发明的范围之内的，如附加的权利要求中所示。
机译： 用于选择和取消选择以免疫应答产生疗法治疗的癌症患者的质谱方法
机译： 用于选择和取消选择癌症患者的免疫应答产生疗法的质谱方法
机译： 用于选择和取消选择具有免疫反应产生疗法的治疗癌症患者的质谱方法。
