检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒

摘要

本发明涉及检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒，属于生物技术领域。本发明在高度复合的扩增体系中可以扩增检测8个21号染色体、6个18号染色体、6个13号染色体和3个X染色体相关的STR位点，同时扩增检测4个性别位点。且通过定量荧光PCR(QF-PCR)技术扩增上述所有位点，对21、18、13、X和Y染色体非整倍体数目异常进行检测。本发明试剂盒，检测周期短，获得样本后5小时就可以可得到结果，灵敏度高，每次检测只需纳克级别的DNA，相当于100个细胞所含的DNA量，因此需要的样本量少，需要1-2ml的羊水即可满足需求。由于灵敏度较高，三体细胞占10％以上的嵌合体就可以被检出。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，是一种DNA水平的基于定量荧光PCR(Quantitive  Fluoresent PCR，QF-PCR)的检测方法，可以对常见的21、18、13三体综合征以及X、Y性 别染色体数目异常进行快速、简便、准确的检测。

背景技术

染色体数目异常和结构畸变是导致出生缺陷的重要原因之一(Gardner R J M,Sutherland G  R.Chromosome abnormalities and genetic counseling[M].New York:Oxford University Press, 1996:300-320.)，染色体非整倍体疾病属于染色体数目异常，包括单体型、三体型、多体型和 嵌合体。临床上常见包括21三体综合征(Down’s syndrome)、18三体综合征(Edward  syndrome)、13三体综合征(Patau syndrome)、以及一些性染色体畸变，如Klinefelter综合征 (47,XXY)和Turner综合征(45,X)等。研究表明13、18、21及X/Y染色体异常占新生儿 染色体数目异常的95％，这给家庭的社会造成沉重负担。由于至今还没有有效预防和治疗方 法，因此，在产前及时诊断21号染色体异常并终止妊娠对降低出生缺陷、提高人口素质有重 要意义。

目前，临床上以染色体核型分析为诊断金标准，然而该技术有很大局限性。首先要进行 羊膜穿刺取羊水，然后培养羊水中胎儿细胞，再进行核型分析。整个周期需要2-3周，操作 复杂，需要有经验的检测人员操作。另外近几年应用的技术为荧光原位杂交(FISH)，这一 方法较核型分析速度稍快，不需细胞培养，利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记 或以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交。再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记 物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。 这两种方法都具有成本较高，周期长，对操作人员要求较高的特点，同时结果为图片，需要 人工判读或干预，难以实现自动化和高通量分析。

QF-PCR技术是，通过荧光引物对样本DNA的不同区域进行PCR扩增(因此荧光信号 变量与扩增产物变量成正比)，随后采用高分辨率胶电泳(如用于测序的毛细管电泳)对扩增 片断进行分离，通过荧光检测系统确定扩增片断的长度并实现对多态位点的分型，通过扫描 软件对预期大小的扩增产物对应的峰面积定量，实现对原始模板量的定量。定量荧光PCR体 系(Quantitative Fluorescent PCR，QF-PCR)中同时扩增多个21、18、13、X和Y染色体上 的短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)基因座，利用STR基因座的多态性来判断 染色体数目。非整倍体数目异常是由染色体数目增多或减少一条引起的疾病，因此对染色体 上的STR位点经过QF-PCR扩增、检测会得到1:1:1的三个峰、2:1的两个峰或一个峰，其中 前两种情况是三体综合征样本相对于正常样本所特有的。STR位点多态性越高则出现单一峰 的几率越小，出现前两种情况比例越大。对多个特定染色体上的STR位点进行检测，综合考 量各个位点峰数量和峰面积即可判定检测样本是否为三体综合征。

1993年Mansfield首次报道应用STR(Short Tandem Repeats，短串联重复序列)进行 QF-PCR，成功检测21三体综合征(Mansfield，Diagnosis of Down syndrome and other  aneuploidies using quantitative PCR and small tandem repeat polymorphisms.Hum Mol  Genet.1993；2:43–50.)。此后越来越多的研究者采用STR基因座联合检测的方法来诊断。如： 专利200510025466.8，分子生物学法三体检测试剂盒，通过七个QF-PCR体系检测3个21号染 色体、2个18号染色体和2个13号染色体STR位点；专利200410021619.7，一种生物非整倍体的 检测方法，每条染色体选用6-9个STR位点，一个体系包含3-4个同一染色体STR位点；专利 201310555078.5，一种单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，通过1个QF-PCR 体系检测23个位点，包括6个21号染色体的STR位点，5个18号染色体的STR位点，4个13号染 色体的STR位点和8个性染色体位点。上述专利往往采用的STR位点不合理或数目较少，且每 个QF-PCR扩增体系中包含的位点数量少，导致检测效率和准确性不够高。

发明内容

本发明的目的是提供染色体非整倍体数目异常的检测PCR扩增组合物，在高度复合的扩 增体系中可以扩增检测8个21号染色体、6个18号染色体、6个13号染色体和3个X染色 体相关的STR位点，同时扩增检测4个性别位点。且通过定量荧光PCR(QF-PCR)技术扩 增上述所有位点，对21、18、13、X和Y染色体非整倍体数目异常进行检测。

本发明的另一个目的在于提供一种非整倍体数目异常检测试剂盒。该试剂盒利用多重定 量荧光PCR扩增体系，通过该试剂盒可实现仅以一个扩增检测反应完成对样品简便、稳定、 准确、精细和高效地检测。

检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物，其特征在于：所述扩增组合物中包括27对 引物，可同时扩增23个与21、18、13、X染色体非整倍体数目异常检测相关的STR位点和4个 Y染色体非整倍体数目异常检测相关位点：D13S256、D13S797、DXS6809、DXS9895、 D21S2052、D18S51、AMEL、D18S535、D13S317、D21S1411、D18S1002、D21S1446、D13S305、 TAF9L、D18S877、LFG21、ZFXY、D18S851、D21S1435、SRY、D21S11、D18S391、D13S800、 D21S1246、XHPRT、D13S325和Penta D，所述引物分别为：

扩增D13S256的引物：

引物1：AAGAGCAAAACTCCATCTCGATAG，

引物2：TACTTATAAGCAGAGAGACATAA；

扩增D13S797的引物：

引物1：TTTTGGTTTGCTGGCATCTG，

引物2：TTGTCTGGAGGCTTTTCAGTC；

扩增DXS6809的引物：

引物1：TGTTTCCATCTTTCTCTGAAC，

引物2：GAATCCAATTTTGCTTTAGGC；

扩增DXS9895的引物：

引物1：CCATGATTCAAATTATCTCCCACC，

引物2：CCATCATTTGCCTTGAGAAAA；

扩增D21S2052的引物：

引物1：ACTGTACAGAGGTTCTCCGGGCA，

引物2：CATGTCTTGAGCCTTCCAGCTCTCT；

扩增D18S51的引物：

引物1：TTCACTCTGAGTGACAAATTGA，

引物2：CATTAAGCTCACTTTAGCCG；

扩增AMEL的引物：

引物1：CACCAGCCAAACCTCCCTCCGC，

引物2：GCTGCATGGGGTGCACAGGTG；

扩增D18S535的引物：

引物1：ACAAAAGCCACACCCATAAC，

引物2：GAAATATAGATGAGAATGCAGAGA；

扩增D13S317的引物：

引物1：TATCACAGAAGTCTGGGATG，

引物2：AAAAAGACAGACAGAAAGAT；

扩增D21S1411的引物：

引物1：TAGAACATAGGTAGATACATAA，

引物2：TCCAGGCTTTCTGCCCACTCCCA；

扩增D18S1002的引物：

引物1：AGGAAGCTATCTATACAAAGAGTG，

引物2：AAGATGTGAGTGTGCTTTTCAGGAG；

扩增D21S1446的引物：

引物1：TATTGCCTAGTGATGTTGTAGCC，

引物2：AGAATATGTCCCAAAGGACCTGC；

扩增D13S305的引物：

引物1：CCTGTTTGAGGACCTGTCGTTA，

引物2：TCGAAATCCTAGGCTTGAGTAA；

扩增TAF9L的引物：

引物1：TTTGACAGGTAGTTTTGGGTCA，

引物2：CTACAGCATCTCTGTTAAATTTAGA；

扩增D18S877的引物：

引物1：ACAAATATGCAAAGTATAGCACAC，

引物2：TTCTGTCTCTCTATCCATCATCTAT；

扩增LFG21的引物：

引物1：GTTATGTCCCATGATTTCCC，

引物2：ATCTAGATACTCTTTAATAT；

扩增ZFXY的引物：

引物1：TGGACTCAGATGTAACTGAAGAAGT，

引物2：TACCAATACTTCTTCTGAAACTACG；

扩增D18S851的引物：

引物1：TCTCTCTGTCCTCTAGGCTCATTTAGC，

引物2：TGAGATAGTTTAAATAGTTTGCC；

扩增D21S1435的引物：

引物1：CTCAGCACATTCTCCTCTAGATTTA，

引物2：AAAGCAAGAGATTTCAGTGCCATC；

扩增SRY的引物：

引物1：TTCCTTTGCACTGAAAGCTGTA，

引物2：TGTCCAGTTGCACTTCGCTGC；

扩增D21S11的引物：

引物1：ACTTCTGGAGATGGAACACTTTT，

引物2：TTGTATTAGTCAATGTTCTCCAGAG；

扩增D18S391的引物：

引物1：TTGAGGAAGAGAGAAATAGAGAGA，

引物2：CTATTCCCATCTGAGTCACTCAGC；

扩增D13S800的引物：

引物1：AGGTAGGTAGGTAAATAGCTAGAT，

引物2：ACTGGCTTTCCTCTTCCTTCCTTA；

扩增D21S1246的引物：

引物1：AAAGTAGACAGGTAAACATACA，

引物2：TCATCCATCCATCCACCTATCT；

扩增XHPRT的引物：

引物1：TTGAGGTATACTTTTCTCTCCAGAAT，

引物2：TAATACACATCCCCATTCCTGCC；

扩增D13S325的引物：

引物1：TTCCTAATTTCCCCTGTTACTGGAA，

引物2：CTCCAACGGTCATTAAAAAC；

扩增Penta D的引物：

引物1：GAAGGTCGAAGCTGAAGTGAGCC，

引物2：GTAAGAATTCTTTAATCTGGACACAAG。

所述引物分为四组，每组引物带有不同的荧光标记物，四组引物分别在每一对引物的其 中一条引物的5’末端带有荧光标记物，所述第一组为D13S256、D13S797、DXS6809、DXS9895、 D21S2052和D18S51，第二组为AMEL、D18S535、D13S317、D21S1411、D18S1002、D21S1446 和D13S305，第三组为TAF9L、D18S877、LFG21、ZFXY、D18S851、D21S1435、SRY和 D21S11，第四组为D18S391、D13S800、D21S1246、XHPRT、D13S325和Penta D。

所述第一组、第二组、第三组和第四组分别采用下列四种荧光标记：FAM或荧光素、HEX 或JOE、TMR或VIC、和ROX或PET。

所述的扩增组合物还包括：PCR反应缓冲液、dNTP混合物、模板DNA和Taq酶。

染色体非整倍体数目异常检测试剂盒，包括上述扩增组合物。

所述位点扩增引物的用量体积比为：

位点名称 体积(μl) D13S256 2.4μl D13S797 1.2μl DXS6809 2.6μl DXS9895 2μl D21S2052 2μl D18S51 5μl

AMEL 0.76μl D18S535 2.4μl D13S317 2.4μl D21S1411 2μl D18S1002 5μl D21S1446 2μl D13S305 5μl TAF9L 2μl D18S877 2μl LFG21 2.6μl ZFXY 2.2μl D18S851 2.6μl D21S1435 3.6μl SRY 3.84μl D21S11 5μl D18S391 2.8μl D13S800 1μl D21S1246 5μl XHPRT 3.36μl D13S325 3.2μl Penta D 6.2μl

上述试剂盒在检测染色体非整倍体数目异常中的应用。

本发明选取23个与21、18、13、X染色体非整倍体数目异常检测相关的STR位点和4 个Y染色体非整倍体数目异常检测相关位点(D13S256、D13S797、DXS6809、DXS9895、 D21S2052、D18S51、AMEL、D18S535、D13S317、D21S1411、D18S1002、D21S1446、D13S305、 TAF9L、D18S877、LFG21、ZFXY、D18S851、D21S1435、SRY、D21S11、D18S391、D13S800、 D21S1246、XHPRT、D13S325和Penta D)，对21、18、13、X和Y染色体数目异常进行检 测。所选取的位点经过大量群体数据筛选，具有高度多态性和遗传稳定性，适用于染色体数 目异常检测。各位点在染色体上分布均匀，并且在唐氏综合征关键区域及其附近设置位点， 这样不仅使检测结果更稳定、可信，也可对易位型唐氏综合征进行有效检测。

本发明的优势在于：

1.检测周期短，获得样本后5小时就可以可得到结果。我们采用了羊水细胞提取直接扩增， 扩增加检测时间共计5小时，能够在1-2天内出具报告，大大加快了速度。

2.灵敏度高，每次检测只需纳克级别的DNA，相当于100个细胞所含的DNA量，因此需要 的样本量少，需要1-2ml的羊水即可满足需求。

3.准确性高，这一方法准确性超过目前任何检测唐氏综合征的技术。同FISH相比，本技术 对人员操作要求较低，发生污染的几率更小。由于采用了可靠的PCR技术和遗传分析仪 检测，能够实现自动化和数字化分析数据，无需人工干预，结果更加客观和准确。

4.可清晰判断样本污染情况，体系中位点多态性高，可以指示样本是否来自同一个体，避免 母体细胞污染的问题。

5.对于部分易位和嵌合体有更好的检出率。我们采用的基因座覆盖范围包括了染色体多个区 段，对于部分易位的情况检出率更大，另外由于灵敏度较高，三体细胞占10％以上的嵌合 体就可以被检出。

本发明的技术思路

1、引物组合的设计

首先，我们选择了具有高度灵敏性及扩增特异性的21、18、13、X染色体STR位点和Y 染色体位点，选择的位点包括D13S256、D13S797、DXS6809、DXS9895、D21S2052、D18S51、 AMEL、D18S535、D13S317、D21S1411、D18S1002、D21S1446、D13S305、TAF9L、D18S877、 LFG21、ZFXY、D18S851、D21S1435、SRY、D21S11、D18S391、D13S800、D21S1246、 XHPRT、D13S325和Penta D。我们从人类的基因组特别是我国人群基因组数据中筛选了这 些STR位点，具有高度多态性和遗传稳定性等特点。根据候选的位点所在基因的GenBank 序列号从NCBI核酸数据库下载基因序列，各位点所在基因的部分序列见序列表。

用于扩增D13S256的引物对是由位于下列部分序列中1～24位24个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中126～148位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D13S797的引物对是由位于下列部分序列中1～20位20个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中181～201位的互补序列的21个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增DXS6809的引物对是由位于下列部分序列中1～21位21个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中245～265位的互补序列的21个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增DXS9895的引物对是由位于下列部分序列中1～24位24个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中308～328位的互补序列的21个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D21S2052的引物对是由位于下列部分序列中1～23位23个连续碱基构成的引 物，和与下列部分序列中348～372位的互补序列的25个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D18S51的引物对是由位于下列部分序列中1～22位22个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中457～476位的互补序列的20个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增AMEL的引物对是由位于下列部分序列中1～22位22个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中89～109位的互补序列的21个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D18S535的引物对是由位于下列部分序列中1～20位20个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中111～134位的互补序列的24个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D13S317的引物对是由位于下列部分序列中1～20位20个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中166～185位的互补序列的20个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D21S1411的引物对是由位于下列部分序列中1～22位22个连续碱基构成的引 物，和与下列部分序列中288～301位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D18S1002的引物对是由位于下列部分序列中1～24位24个连续碱基构成的引 物，和与下列部分序列中278～302位的互补序列的25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D21S1446的引物对是由位于下列部分序列中1～23位23个连续碱基构成的引 物，和与下列部分序列中333～355位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D13S305的引物对是由位于下列部分序列中1～22位22个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中383～404位的互补序列的22个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增TAF9L的引物对是由位于下列部分序列中1～22位22个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中80～104位的互补序列的25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D18S877的引物对是由位于下列部分序列中1～24位24个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中109～133位的互补序列的25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增LFG21的引物对是由位于下列部分序列中1～20位20个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中205～224位的互补序列的20个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增ZFXY的引物对是由位于下列部分序列中1～25位25个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中230～254位的互补序列的25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D18S851的引物对是由位于下列部分序列中1～27位27个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中260～282位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D21S1435的引物对是由位于下列部分序列中1～25位25个连续碱基构成的引 物，和与下列部分序列中302～325位的互补序列的24个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增SRY的引物对是由位于下列部分序列中1～22位22个连续碱基构成的引物，和 与下列部分序列中362～382位的互补序列的21个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D21S11的引物对是由位于下列部分序列中1～23位23个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中444～468位的互补序列的25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D18S391的引物对是由位于下列部分序列中1～24位24个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中105～128位的互补序列的24个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D13S800的引物对是由位于下列部分序列中1～24位24个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中136～159位的互补序列的24个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D21S1246的引物对是由位于下列部分序列中1～22位22个连续碱基构成的引 物，和与下列部分序列中194～215位的互补序列的22个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增XHPRT的引物对是由位于下列部分序列中1～26位26个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中270～292位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D13S325的引物对是由位于下列部分序列中1～25位25个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中311～330位的互补序列的20个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增Penta D的引物对是由位于下列部分序列中1～23位23个连续碱基构成的引物， 和与下列部分序列中403～429位的互补序列的27个连续碱基构成的引物的组合。

D13S256部分序列：

AAGAGCAAAACTCCATCTCGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATA GATAGATAGACAGACAGACAGACAGACAGACACAAGATGGATAGATAGATAGACAGACACAATTATGTCTCTCTGCTTATAAGTA

D13S797部分序列

TTTTGGTTTGCTGGCATCTGTATTAGGGTTCTCCAGACAGATAGAACCAATAGGATAGATATAG ATAATAGATACATAGATGGATGGATGGATGGATAGATACATAGATAGATAGATAGATAGATAGATA GATAGATAGATAGATAGCATTTGTTAGGAGAATTGGCTCGTGATTATAGAGACTGAAAAGCCTCCAGACAA

DXS6809部分序列

TGTTTCCATCTTTCTCTGAACCTTCCTAGCTCAGGAATACTGAGGGCATGACTAGATTATGTAGG AATTTGGGCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATATCTATCTATCTATCATCTATTATC TATCTATCATCTATCTATCTATCTATCTATTATCTATCATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCT ATCTATCTATCTATCTATCCTCTATCTCTTCCTCACATCAGCCTAAAGCAAAATTGGATTC

DXS9895部分序列

CCATGATTCAAATTATCTCCCACCAGGTCCCTCTCACAACACGTGGGAATTATGGGAGTCCAATTC AAGATGAGATTTGGGTGGGGACACAGAGCCAAACCATATCAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGAT AGATAGATAGATAGATAAGATAGATAGATAGAATGAATATATAGACACAGGTAAATTTTCATTTTTTATTT GTAATTCCTTGAGCAGAGCCATTCAATATTTGTCAGACAAGTCAAAAGGCCTAACACTATGCCAGACA CTATTTATTTAGGGAAAATAATTAAGCCACTTCATTTTCTCAAGGCAAATGATGG

D21S2052部分序列

ACTGTACAGAGGTTCTCCGGGCACCCCTTTATACTTGGCTGTGATAGATAGATAGATAGATAGATA GATAGATAGATAGATAGATGATAGATAGATAGATAGATAGACAGACAGATAGATAGAGGGATAGATGGA TGGTAGAGTACTATTATAAGGAATTGGCTCATGTGATTCTGGAGATCGAGAAGTCTTAAAAACTGCAG TGAGCAAGCTCGACATCCAGCAGAACTAACGGCCTAGTTCCAGTCTGAGTCCAAAGGCTTGAAAACC AGGAGAGTTGATGGTGTGGTTCTAGTCTGAATCTAAAGACCTGAGAACCAAGAGAGACGATGGTGTA AGTGCCCGTCAGAGAGCTGGAAGGCTCAAGACATG

D18S51部分序列

TTCACTCTGAGTGACAAATTGAGACCTTGTCTCAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAG AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAAGAGAGAGGAAAGAAAGAGAAAAAGAAAAGAAATA GTAGCAACTGTTATTGTAAGACATCTCCACACACCAGAGAAGTTAATTTTAATTTTAACATGTTAAG AACAGAGAGAAGCCAACATGTCCACCTTAGGCTGACGGTTTGTTTATTTGTGTTGTTGCTGGTAGTC GGGTTTGTTATTTTTAAAGTAGCTTATCCAATACTTCATTAACAATTTCAGTAAGTTATTTCATCTTTC AACATAAATACGCACAAGGATTTCTTCTGGTCAAGACCAAACTAATATTAGTCCATAGTAGGAGCTA ATACTATCACATTTACTAAGTATTCTATTTGCAATTTGACTGTAGCCCATAGCCTTTTGTCGGCTAAAGTGAGCTTAATG

AMEL部分序列

CACCAGCCAAACCTCCCTCCGCCCGCCCAGCAGCCCTACCAGCCCCAGCCTGTTCAGCCACAGC CTCACCAGCCCATGCAGCCCCAGCCACCTGTGCACCCCATGCAGC

D18S535部分序列

ACAAAAGCCACACCCATAACTTTTTTCCTCTAGATAGACAGATAGATGATAGATAGATAGATAG ATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATAGATTCTCTTTCTCTGCATTCTCATCTATATTTC

D13S317部分序列

TATCACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGAGAGTTCATTTCTTTAGTGGGCATCCGTGACTCTCTGG ACTCTGACCCATCTAACGCCTATCTGTATTTACAAATACATTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATC TATCTATCTATCTATCAATCAATCATCTATCTATCTTTCTGTCTGTCTTTTT

D21S1411部分序列

TAGAACATAGGTAGATACATAAATATGATGAATGCATAGATGGATGGGTGGATGGATGGATGG ATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGAATGGATACATAGATGAATGGATGGATAGATAGTATATA AATGGATGGATGGATAGATACACAGTAGGTAGGTAGGTAGTAGATAGATAGATAGATAGATAGATA GATAGATAGATAGATAGATAAACAGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATA GATAAACAGGATGAATATTTAGAAGGCTGGGAGTGGGCAGAAAGCCTGGA

D18S1002部分序列

AGGAAGCTATCTATACAAAGAGTGAATGCTGTACAAACAGCAAACTTTACAGGGAAAAAGTTG ATATTTATAGATACTCATTTATACCCCAGGGCAAGACAGACAGATAGATAGATAGATAGATAGATA GATAGATAGATAGATAGATAGCAATATATTGATATCTGTTTATCCATTGAGTCAAACAAATAAACAC ACATAGATTACAAAGGTCCTTTTCTCTTCCCATGCCTGAAGAGAAAGGAGGCCTGTGGTTTCTTTCCA TAGATATGCATCACTCCTGAAAAGCACACTCACATCTT

D21S1446部分序列

TATTGCCTAGTGATGTTGTAGCCATCAAAACATTGTAGTGCAATGCATTACTCATGTGTCTGTGG TTATAGTGGTATAAACAAACCTACTGTGCTACCAGTCACATAAAAGTATAGTACATCAAATTATGTA CGATACGTAATACTTGACAATGATCATAAATGACCATCTTACTGGTTTATGTATTTACTATACAATAC ATTTTATTATTTTAGATGGTACTCTTTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTA TCATCTATCTATCTATCTATGTAAAGTTAGTTAACAGTTAGTTACCAGTAAAATAGCCTCGAGCAGGTCCTTTGGGACATATTCT

D13S305部分序列

CCTGTTTGAGGACCTGTCGTTACGAATGAATGGAAGGAAGGAAGGGACAGAGGGAGGGAGGA AGGAAGGAAAGAAGGATGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAAGAAAGAAAGAAAAAGAAAGGAAGGA AAGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGAAGAAAAAGAAAGAAGGAAGGAAAGAAAAAGAAAGAAAGA AAGAAAAAGAAAGAGAAAGAAAGAAAGAAGGAAAGAAAAAGAAAGAAAGAAAAAGAAAGAGAA AGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGC GAAAGAGCACACATGCATGGTGTTGCATGCTTGTAATCTCAACTACTTGGGAGGCTGAGGTGGGAG GATTACTCAAGCCTAGGATTTCGA

TAF9L部分序列

TTTGACAGGTAGTTTTGGGTCAGTTATATTCAGTTTTAGTATTGTATTCCAAGTTGATAACTCTTC CATGTTTCACATTTCTAAATTTAACAGAGATGCTGTAG

D18S877部分序列

ACAAATATGCAAAGTATAGCACACAGACAAAAAATAGATGATAGAGATGACACATGATAGGTA AATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATGATGGATAGAGAGACAGAA

LFG21部分序列

GTTATGTCCCATGATTTCCCTGTAGAGACTTTAGTCTTAGAACAGTGTGTTCATACTGTGCAGAAA TAATTATTGGCGAATCATGACACTAATTTTGGCCAGCATTTACGAATAGAATAGAATAGAATAGAATAG AATAGAATAGAATAGAATAGAATAGAATAGAATAGAATAGAATAGAATAGAATAGAATGGATCAGAGTA ATATTAAAGAGTATCTAGAT

ZFXY部分序列

TGGACTCAGATGTAACTGAAGAAGTTTCTTTAGCACATTGCACAGTCCCAGATGATGTTTTAGC TTCTGACATTACTTCAGCCTCAATGTCTATGCCAGAACACGTCTTGACGGGTGATTCTATACATGTGT CTGACGTTGGACATGTTGGACATGTTGGACATGTTGAACATGTGGTTCATGATAGTGTAGTGGAAGC AGAAATTGTCACTGATCCTCTGACTACCGACGTAGTTTCAGAAGAAGTATTGGTA

D18S851部分序列

TCTCTCTGTCCTCTAGGCTCATTTAGCAATTTAGCCATCAATTATAACTTACATACAGATTTAGA TATAAATATAGACAGATAAATACATAAATAAATATATAGTTATACACACACAAACATCTCTTTCTAT CTATATATCTTATCTATCTATCTATCTATCTAAATTTGTAGTTTCTCATATGTTTTAAGAGTGAGTCTT GGTACCAGAAAACATGGATTGGCATCACTGCTTCATAAAGGCTTGTTGTATGGCCTTAGGCAAACTATTTAAACTATCTCA

D21S1435部分序列

CTCAGCACATTCTCCTCTAGATTTAGCATCGGTTGATGATTTTTGGCTAACTCTTTCTGTATGATG GTCTTAAAACAATTCTTTTCAATTCTATAACTCCCTTCTACATTTATTCTTTGACATTCTTCTGTTAGG AAGAGCCCCATTCCCCTCTCCAATTGTTTGTCTACCCTATCTATCATCTATCTATCTATCTATCTATCT ATCTATCTATCTATCTATCTAATCTTCTATTATCTATCTATCTATCTAAAAATCATTTCACAGGACTCA ATAATATACGTCAAATCTCATTTTTCTTGATGGCACTGAAATCTCTTGCTTT

SRY部分序列

TTCCTTTGCACTGAAAGCTGTAACTCTAAGTATCAGTGTGAAACGGGAGAAAACAGTAAAGGCA ACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCATGAACGCATTCATCGTGTGGTCTCGCGATCAGAGGCGCAA GATGGCTCTAGAGAATCCCAGAATGCGAAACTCAGAGATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTGGAAA ATGCTTACTGAAGCCGAAAAATGGCCATTCTTCCAGGAGGCACAGAAATTACAGGCCATGCACAGAG AGAAATACCCGAATTATAAGTATCGACCTCGTCGGAAGGCGAAGATGCTGCCGAAGAATTGCAGTTTG CTTCCCGCAGATCCCGCTTCGGTACTCTGCAGCGAAGTGCAACTGGACA

D21S11部分序列

ACTTCTGGAGATGGAACACTTTTCTTCTGCTTTTGGACATCAGAAATCCAAGTTCTCTGGCCTTT GGACTTTGGGACTTGTGCCAGCACCCTCCTGGGTTCCCTGGCCTTTGGCCTCAAACTGAAGGTTACA CTATCAGCTTCCGTTGTTCTAAGGGCTTCAGACTTGGACAGCCACACTGCCAGCTTCCCTGATTCTTC AGCTTGTAGATGGTCTGTTATGGGACTTTTCTCAGTCTCCATAAATATGTGAGTCAATTCCCCAAGTG AATTGCCTTCTATCTATCTATCTATCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTATCTATCTATATCTATCTA TCTATCATCTATCTATCCATATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCGTC TATCTATCCAGTCTATCTACCTCCTATTAGTCTGTCTCTGGAGAACATTGACTAATACAA

D18S391部分序列

TTGAGGAAGAGAGAAATAGAGAGATAGAGATGATATACATAGATAGATAGATAGATAGATAG ATAGATAGATAGATAGATAATGATAAATCAGGAATTTAATTAGCTGAGTGACTCAGATGGGAATAG

D13S800部分序列

AGGTAGGTAGGTAAATAGCTAGATGACAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGAT AGATAGAGATTTATTACAAGGTATTGACTCATATAATTAAGGAAGCTGAGAAGTCCCACAATCCTCC CCAATTAAGGAAGGAAGAGGAAAGCCAGT

D21S1246部分序列

AAAGTAGACAGGTAAACATACATAGATGGATAAATGGATGGATGCATGGATGGATGGAGAGAT GGATGGATGGATAGATGGATGGATGGATAATGTTCAGAGACAGACAGACAGACGGAGGAATGGAT GGATGGGCAAACAGATGGGTAGGCAGGCAGACAGACATAGATAGATAGACAGATAGATAGATGAT AGATAGGTGGATGGATGGATGA

XHPRT部分序列

TTGAGGTATACTTTTCTCTCCAGAATAGTTAGATGTAGGTATACCACTTTGATGTTGACACTAGTTT ACCTAGAACTTATCTTCTGTAAATCTGTCTCTATTTCCATCTCTGTCTCCATCTTTGTCTCTATCTCTATC TGTCTATCTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTAAAGCAAATTC ATGCCCTTCTCCTATTTATTGAATCGAGACCATAGACAGGGGTGAGAGAAAGAATTTGGCAGGAATGGGGATGTGTATTA

D13S325部分序列

TTCCTAATTTCCCCTGTTACTGGAATAACTATTCATGCTAACCATTCTCCCCACGGTGTTTGAAA GATAGGCCATGCAGCTTAAGTTCTTTAAGTGTCTAGAGAGGAGGGCTTTGAGATAGACAGATAGAT AGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGA TAGATAGAGGCAATAACATAATTTCAACTGTTATTAGCTGGAAGGATTCTGGAGATAACATTTATTC TTCTTTCTGCTTCCAAACTTCTGAGAGAGAGATAAGAATCTACGTTGTTTTTAATGACCGTTGGAG

Penta D部分序列

GAAGGTCGAAGCTGAAGTGAGCCATGATCACACCACTACACTCCAGCCTAGGTGACAGAGCAA GACACCATCTCAAGAAAGAAAAAAAAGAAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAA AGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAAACGAAGGGGAAAAAAAGAGAATCATAAACATA AATGTAAAATTTCTCAAAAAAATCGTTATGACCATAGGTTAGGCAAATATTTCTTAGATATCACAAAATC ATGACCTATTAAAAAATAATAATAAAGTAAGTTTCATCAAAACTTAAAAGTTCTACTCTTCAAAAGATA CCTTATAAAGAAAGTAAAAAGACACGCCACAGGCTAAGAGAAAGTACTTCTAATCACATATCTAAAAA AGGACTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTTAC

以上引物由Primer3、Primer Premier 5和NCBI Blast等软件设计而成。设计引物时应尽量 确保各引物的Tm值在(60±2)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小 相差50bp以上。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互 作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的 引物序列。

选用任一人类DNA模板，分别用27对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5～2.0％的 琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到27对引物共同的扩增 条件。最终要达成的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单 一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。

然后，将满足要求的27对引物，分为四组进行荧光标记。每组采用一种荧光素，分别可 以是FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC和ROX或PET。获得荧光标记引物后，用 与之相配对的非荧光引物组合后分别进行单重扩增，将扩增产物置于ABI 3130xl遗传分析仪 上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。

其后，将同一荧光素标记的6对至8对引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于ABI 3130xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效 率以及此6对至8对引物的混合扩增是否引起非特异扩增。

最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将27 对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对 的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致为准。最终确定的12对引物序列分别见序 列表。

2.扩增体系及条件的建立

2.1Taq酶的选择

Taq酶是扩增体系的重要组分，多种Taq酶都满足本发明的需要，如Takara公司的rTaq 酶和HS Taq酶、KAPA Biosystems公司的Taq酶、Roche公司的AmpliTaq Gold酶等均能得 到较好的扩增效率和特异性，采用热启动Taq酶比非热启动酶的扩增特异性要好。

2.2Mg²⁺浓度的选择

我们摸索了在不同Mg²⁺浓度梯度下复合扩增的效果，其中在1.0-2.5mM的浓度范围内均 能得到较好的扩增。

2.3反应体积的选择

我们分别采用了50μl、20μl和10μl体系进行了复合扩增，结果显示：50μl与20μl的 体系效果基本相当，优于10μl体系的扩增效果。

2.4反应程序的优化

退火及延伸温度：我们摸索了退火温度从55℃到62℃之间各温度下的扩增情况，结果显 示在59-61℃范围内均能得到较好结果。扩增循环数在28-32个之间有较好的效果。

我们摸索了在以下变性、退火及延伸温度下各时间范围内(见表1)的扩增可以得到较好 的结果：表1 温度与时间

附图说明

图1 正常女性检测结果，

图2 正常男性检测结果，

图3 21三体综合征检测结果，

图4 18三体综合征检测结果，

图5 13三体综合征检测结果，

图6 Klinefelter综合征(47,XXY)检测结果，

具体实施方式

实施例1

以下是我们采用本发明对1例21三体综合征患者、1例18三体综合征患者、1例13三 体综合征患者、1例Klinefelter综合征患者和2例正常人的DNA样本进行检测的具体实施情 况。

1.DNA提取

采用Chelex-100、DNA提取试剂盒(天根生化)进行DNA提取，操作步骤依照说明书， DNA提取完毕用紫外分光光度计定量，并稀释成2ng/μl。

2.PCR

2.1反应体系：

将23个21、18、13、X染色体STR位点和4Y染色体位点，共27对引物分别溶解并配 成浓度为10μM的工作液，然后按表2体积比配成引物混合液(Primer mix)：引物序列见附 录中序列表。

表2 各引物体积比

位点名称 体积(μl) D13S256 2.4μl D13S797 1.2μl DXS6809 2.6μl DXS9895 2μl D21S2052 2μl D18S51 5μl AMEL 0.76μl D18S535 2.4μl D13S317 2.4μl D21S1411 2μl D18S1002 5μl D21S1446 2μl D13S305 5μl TAF9L 2μl D18S877 2μl LFG21 2.6μl ZFXY 2.2μl D18S851 2.6μl D21S1435 3.6μl SRY 3.84μl D21S11 5μl D18S391 2.8μl

D13S800 1μl D21S1246 5μl XHPRT 3.36μl D13S325 3.2μl Penta D 6.2μl

将各反应试剂(Buffer、Primer Mix、dNTP等)振荡混合后按表3体积比(DNA除外) 配成PCR反应混合液，分装19μl于PCR反应管中，最后往各反应管加入1μl模板，离心后 进入下一步。

表3 标准扩增反应体系

H₂O 6.8μl 2.5×Buffer 8μl Primer mix 4μl Taq 0.2μl DNA 1μl 总计 20μl

2.2 PCR反应程序：

将PCR反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：第1步：95℃变性10分钟，第2 步：94℃变性30秒，第3步60℃退火1分钟，第4步：70℃延伸1分钟，重复2至4步30 次，最后60℃延伸60分钟。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。

3.毛细管电泳检测

3.1取上一步得到的PCR扩增产物，点样于1.5-2.0％琼脂糖凝胶上，电泳20min后观察 结果，若在100-450bp处出现明亮的阶梯条带则可上机检测。

3.2根据电泳胶图上的样品的条带亮度，确定样品稀释倍数，按稀释倍数将扩增产物稀 释待用。将LIZ500内标和甲酰胺按比例20：1000混合，取9μl混合物加到96孔板里， 再加入稀释过的样品1μl，混合静置数分钟，写上板号，离心后放入ABI 3130xl测序仪上， 准备检测。

3.3打开ABI 3130xl测序仪数据采集软件，编辑上机检测的板标，导入检测程序。

3.4点击运行，即开始检测。

3.5检测完毕后，将数据拷贝至光盘。

4.数据分析

4.1导入原始数据，在主页面的File菜单选择Add sample to project，找到样品文件， 选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在Project窗口；

4.2选择分析参数。定义analysis method、panel和size standard。浏览样本电泳的原始 数据，任一样本文件名，在“Sample”菜单下选择“Raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰 右侧(第一个橙色的内标峰之前)，以此时窗口左下角X轴上显示的数值作为analysis method 分析参数中的起始点；

4.3点击绿色分析按钮，出现Save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据， 分析完成后左下角显示analysis completed。

4.4采用GeneMapper v3.2软件分析得到的数据并生成图谱，见图1-3。

5.结果分析

5.1正常结果判定：

至少有两个STR位点为正常位点(表现为双峰，前后峰高比值在0.8-1.4之间，两峰分子 量间隔超过24bp时，前后峰高比值在0.8-1.5之间)，其余为无效位点(单峰或双峰峰高比值 在1.4-1.8之间)。如图1和图2。

5.221、18和13号染色体非整倍体结果判定：

21、18或13号染色体上STR位点，至少两个为异常位点(表现为三峰，且峰高比值0.8-1.4 之间；或双峰，且峰高比值在0.45-0.65或1.8-2.4之间)，其余为无效位点(单峰，三峰或双 峰峰高比值在1.4-1.8之间，双峰峰高比值小于0.45或大于2.4)。如图3至图5。

嵌合体表现为单一染色体STR位点3峰(异源嵌合体)，或失衡双峰(同源嵌合体)。

5.3性别染色体结果判定：如图6