开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组、高通量测序方法及应用

摘要

本发明提供了一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组、高通量测序方法及应用。本发明通过针对恒河猴TCR的可变区V区(variable)设置了26条上游引物序列，针对TCR的连接区(joining)J区设置了13条下游引物序列，通过多重PCR扩增出外周血或者其他免疫组织中高达107左右数量级的TCR序列，制备高通量测序文库并测序，通过生物信息学对恒河猴TCR基因免疫组库进行了全面分析。本发明提供的技术方案对构建恒河猴分析模型意义重大，有利于促进恒河猴模型在研究自体免疫系统疾病和传染病中的应用，也有利于人类对T细胞介导的疾病有更深入和广泛的认识。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组、高通量测序方法及应用。

背景技术

T细胞受体(TCR)在细胞免疫中发挥着非常重要的作用，TCR属于异源二聚体分子，在循环系统中，超过95％的TCR的属于αβ类型。在人类外周血中，有超过2×10⁷特异的TCRα和TCRβ配对。所述的免疫组库的复杂性是由淋巴细胞的成熟过程中，染色体上三类基因片段，包括V、D、J基因重排以及三种基因片段连接处的插入缺失生成的。该关键区域也被成为CDR3，是主要的抗原识别位点，也称为互补决定区3(CDR3)，它是TCR基因可变区中最多样和复杂的区域。

恒河猴(猕猴)这种动物模型被广泛用于研究许多重要的人类疾病，尤其是用于研究T淋巴细胞在发病机制中的作用。因此，该非人灵长类的TCR序列的表征是非常重要的。早在1992年，Gene Levinson et al.等，通过传统RT-PCR和克隆的方法，在隆恒河猴的外周血测到了23种TCRβ重排序列。后来，Emma E.M.Jaeg又在这类猕猴中发现了若干其他的TCRβ序列。通过序列比对，我们发现这些TCRβ在猕猴，黑猩猩和人类中的多样性和结构非常相似，具有很高的同源性。这些前期的工作，一共在恒河猴发现了超过23种Vβ基因，为后续建立更完整的TCRβ序列提供了至关重要的一个公共序列库。然而，由于传统克隆技术的低通量性质，在过去的二十年中恒河猴中发现的有关TCR序列的数目大约也就几百条，远远少于预估的10⁷，这也成为了限制我们了解T细胞在免疫疾病中的演化过程的重要因素。

近年来，基于下一代测序这个强大的新技术在免疫系统中的应用，一个新的领域，称为免疫基因组库测序的技术诞生了。我们可以将循环血液中来自单个样品的数以百万计的TCR序列，在单次测序中全部一次性读取。这项技术，最早是在2009年，Weinstein等人，应用高通量测序，估计斑马鱼抗体库的大小，用这种方法，他们在每条鱼中检测到了1200至3700条抗体序列。之后Freeman等人，将该方法用于检测人T细胞检测，并且检测到了33664种不同的TCRβ克隆。随后由于测序方法的改进和通量的增加，Wang等在单个健康人中检测到了113290条独特的TCRβCDR3序列。运用统计模型，估计出的T细胞受体库的总多样性在10⁶左右。运用这种免疫组库测序方法，科研人员检测到了抗体的不同过程的动态变化，并用于追踪淋巴细胞成熟过程以及在不同年龄组之间的差异。最近，科研人员用这项技术检测各种人类疾病。例如，检测各种白血病微小残留病变，他的灵敏度较传统的流式细胞分析法更灵敏，更可靠。这种方法也用于研究免疫系统癌症，传染性疾病如登革热，和自身免疫疾病特别是类风湿性关节炎。

尽管免疫组库测序技术在人类基础研究领域中已经有广泛应用，但这种技术在其他模式生物的使用非常有限，仅限于小鼠和斑马鱼。猕猴是一种重要的动物模型，尤其是对人类疾病的研究。超过70种传染病的研究都在恒河猴模型中进行，特别是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)，结核病(TB)和疟疾。因此，建立对恒河猴TCRβ进行大规模测序的方案对构建该物种分析模型十分必要。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组、高通量测序方法及应用。

第一方面，本发明提供了一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组，包括26条上游引物和13条下游引物，其中，所述26条上游引物为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列，所述13条上游引物为如SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列。

本发明通过针对恒河猴TCR的可变区V区(variable)设置至少26条上游引物序列，针对TCR的连接区(joining)J区设置至少13条下游引物序列，通过多重PCR扩增出目的链的PCR产物，获得高通量测序文库。

本发明采用至少13条下游引物序列与所述至少26条上游引物序列随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增TCRβ区。

本发明针对TCR所有的64类V和13类J基因家族进行了比对分析，26条上游引物序列针对TCR的CDR3区上游(即FR3区)，13条下游引物针对J基因，扩增TCR的CDR3区。

优选地，所述的上游引物为3’端比SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列，所述下游引物的为3’端比SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列；

所述上游引物或下游引物多出的1～3个碱基为与目的TCR互补的碱基。

本发明所述的与设计目的TCR互补的碱基是指：针对恒河猴TCR的可变区V区(variable)或针对TCR的连接区(joining)J区设计引物。 

第二方面，本发明提供了一种检测恒河猴T细胞免疫组库的高通量测序方法，包括如下步骤：

提取恒河猴基因组DNA或总RNA；

采用开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组，进行多重PCR反应；

将所得多重PCR产物进行高通量测序；

其中，所述开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组包括26条上游引物和13条下游引物，其中，所述26条上游引物为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列，所述13条上游引物为如SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列。

优选地，所述多重PCR反应的体系中，26条上游引物等摩尔混合；13条下游引物等摩尔混合。

优选地，所述多重PCR反应的体系中，模板量为1～3ug/50ul体系。

优选地，所述多重PCR反应程序为： 

优选地，所述多重PCR反应结束后，电泳，割胶回收片段长度为100-150bp的DNA片段。

优选地，所述的上游引物为3’端比SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列，所述下游引物的为3’端比SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列；

所述上游引物或下游引物多出的1～3个碱基为与目的TCR互补的碱基。

本发明提供的TCR高通量测序文库能获得的长度和数量丰富的TCR序列，有利于TCR序列的多态性程度分析及TCRCDR3区长度多态性分布分析。

优选地，所述T淋巴细胞受体(TCR)待测序列为采用RNA试剂盒提取人外周血单个核细胞的总RNA或者获得的基因组DNA。

总RNA样品需要先进行逆转录，再进行多重PCR。

第三方面，本发明提供了一种构建恒河猴T细胞免疫组库的方法，包括：

提取恒河猴基因组DNA或总RNA；

采用开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组，进行多重PCR反应；

将所得多重PCR产物进行高通量测序；

生物信息学分析，对高通量测序结果进行定量分析；

其中，所述开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组包括26条上游引物和13条下游引物，其中，所述26条上游引物为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列，所述13条上游引物为如SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列。

在高通量测序平台的基础上，通过对恒河猴TCR基因免疫组库进行全面的生物信息学分析，获得了TCR在VDJ重组时的基因偏好性(usage patterns)，基因组合、连接多样性信息，以及CDR3序列中氨基酸的偏好性(usage patterns)、CDR3氨基酸序列的长度多样性以及连接处N端碱基的特性。正是这些因素形成数量庞大且种类多样的TCR受体库。

优选地，所述生物信息学分析采用了发明人自编的在线生物学分析软件“iRAP”，网址为： http://sustc-genome.org.cn/irap。

优选地，所述多重PCR反应的体系中，26条上游引物等摩尔混合；13条下游引物等摩尔混合。

优选地，所述的上游引物为3’端比SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列，所述下游引物的为3’端比SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列；

所述上游引物或下游引物多出的1～3个碱基为与目的TCR互补的碱基。

优选地，所述多重PCR反应的体系中，模板量为1～3ug/50ul体系。

优选地，所述多重PCR反应程序为： 

优选地，所述多重PCR反应结束后，电泳，割胶回收片段长度为100-150bp的DNA片段。

第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组在检测恒河猴T细胞受体、对恒河猴T细胞受体进行高通量测序、构建恒河猴T细胞免疫组库、以及制备恒河猴T细胞免疫组库试剂盒中的应用。

本发明提供的技术方案对构建恒河猴分析模型意义重大，有利于促进恒河猴模型在研究自体免疫系统疾病和传染病中的应用，也有利于人类对T细胞介导的疾病有更深入和广泛的认识。

采用本发明的技术方案，达到如下有益效果：

1)获得了恒河猴1.26(百万)条TCR序列；

2)获得了恒河猴643,570条特异性TCR克隆；

2)获得了恒河猴270,557条特异的TCR CDR3序列，这大大扩展了对该物种免疫TCR的认识。而目前IMGT和NCBI数据库所有恒河猴TCR相关的序列只有几百条。

附图说明

图1-a为TCRβVDJ重组、TCR文库构建以及生物信息流程示意图；

图1-b为高通量测序序列的统计分析结果；

图1-c为高通量测序TCRβ序列的频率直方图；

图2-a TCRβV基因使用频率分布

图2-b TCRβJ基因使用频率分布

图2-c TCRβD基因使用频率分布

图2-d为整个VDJ基因组的3D分布图；

图2-e为不同VDJ重组频率和的数量对应分布情况；

图2-f为测序深度和VDJ重组片段饱和度分析结果；

图3-a TCRβ的CDR3氨基酸长度分布和不同J基因使用分布；

图3-b为12aa长度的TCRβ的CDR3氨基酸组成成份分析；

图3-c为TCRβ的CDR3序列中，不同氨基酸采用的密码子情况；

图3-d为不同TCRβ的CDR3序列的出现频率图；

图3-e为CDR3序列组大小和多样性统计分析；

图4-a为VDJ重组片段区域的13个分区；

图4-b为VDJ重组片段区域中，插入或缺失的片段长度分布情况；

图5-a为PCR偏差的分析；

图5-b为测序误差的评估。

具体实施方式

图1-a为TCRβVDJ重组、TCR文库构建以及生物信息流程示意图；图1-a显示TCRβ的多样性来源 于VDJ重组以及连接多样性，我们通过设计多重PCR引物组扩增TCR基因，并进行测序和分析；根据图1，本发明提供了如下实施例：

材料及试剂说明：

恒河猴：10年大的母猴，来源于广州生物医药与健康研究院(GIBH)，饲养按行业标准。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。

实施例1

T淋巴细胞受体(TCR)基因组DNA样品的制备，包括如下步骤：

(1)收集的新鲜外周血样本各10毫升(ml)，按LymphoPrep试剂盒(Axis-shield,Cat.No.AS1114544UK)说明书操作，获得相对较纯的PBMC；

(2)采用PureLink Genomic DNA Mini Kit(Life Technology,Cat.No:K1820-00)试剂盒提取步骤(1)所得细胞的基因组DNA，并用Nanodrop2000(Thermo)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。

实施例2

采用开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组进行多重PCR，构建TCRβ高通量测序文库，进行高通量测序，包括如下步骤：

(1)以实施例1所得基因组DNA为扩增模板，取TCR引物，再采用QIAGEN公司Multiplex PCR试剂盒(货号：206143)，按试剂盒说明书配置多重PCR体系，其中，每个前向引物等摩尔混合，引物总浓度是10微摩尔，每个反向引物等摩尔混合，引物总浓度是10微摩尔，模板量可以调整，本实施例中采用3ug，1ug也可以做出来，但是多样性会下降。

该体系中的上游引物为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示引物的等摩尔混合物；下游引物为如SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:39所示引物的等摩尔混合物。

(2)多重PCR

为方便送测，若无特别说明，本发明实施例进行多重PCR时，分别在上游引物和下游引物加上测序接头，具体为：在如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的引物的5’端分别接上illumina测序公司的上游引物接头序列，在下游引物的5’端分别接上illumina测序公司的下游引物接头序列，具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书；

再按下述多重PCR的条件设置PCR仪器程序，进行多重PCR：

72℃7min，PCR结束后，4℃保存PCR产物并电泳检测，挑选片段长度约为120bp的TCRβ片段，割胶回收，得到纯化后的TCRβ片段，胶回收步骤采用QIAGEN公司QIAquick胶纯化试剂盒，按常规实验室操作进行；Nanodrop 2000测试DNA浓度，并送公司进行高通量测序(采用Illumina  hiseq2000测序，2*100pair-end)。

本发明实施例设计26条上游引物，13条下游引物对TCRβ免疫组重链进行分析：

1)设计引物：针对TCR所有的64类V和13类J基因进行了比对分析，采用Oligo 7.0和MFEprimer-2.0对引物二聚体以及茎环错配进行分析，在TCR的CDR3区上游(即FR3区)设置了上游引物，针对J基因下游设计反向引物，扩增TCRβ基因。

本实施例提供的引物组覆盖了大部分TCRβVDJ重组片段。由于很小的序列变化将导致引物扩增效果显著降低，本发明选取了扩增效果最佳的引物组。

2)多重PCR产物大小在120bp左右。

3)采用Illumina Hiseq 2*100pair-end测序。

4)对高通量测序结果的生物信息学分析采用本发明人自研在线软件Immune Repertoire Analysis Pipeline(iRAP，http://www.sustc-genome.org.cn/irap/) 

生物信息学分析结果如下：

一、TCR基因序列的分析

采用本发明的引物组以及多重PCR构库后，高通量测序得到大约1.69(百万)条序列。经过和TCRβ比对分析，得到图1-b所示结果，图1-b为高通量测序序列的统计分析结果，由图1-b可知，1.69(百万)条序列中，1.26(百万)条为TCRβ序列，其中，1.07(百万)条为可正常编码氨基酸序列的CDR3序列，另有0.19(百万)条在CDR3不能正常编码序列，T细胞中含有的out-of-frame序列，如果不被nonsense-mediated decay(NMD)途径沉默或破坏，将会引起严重疾病。

CDR3区域是TCRβ基因中多样性最丰富的区域，是抗原结合位点的关键，本次分析，我们发现了0.23(百万)条CDR3氨基酸序列，这可以和人类CDR3多样性相匹敌。图1-c为高通量测序TCRβ序列的频率直方图，结果显示，25.2％的TCR序列只有1个拷贝，所有TCR CDR3的寡克隆指数(oligoclonality index，OI)为0.63，表明CDR3序列拷贝数的分布非常不一致，变化幅度很大。

二、VDJ基因出现频率的规律

根据IMGT数据库可知，恒河猴具有64种V,2种D和13种J基因片段。本实施例参考现有数据库，通过比对分析每一条高通量测序所得TCRβ序列，获得57种V,2种D和13种J基因片段，由此可知，本发明提供的多重PCR引物组覆盖了大部分VDJ基因片段。

根据分析，V、D、J基因片段的丰度非常不一致，有些片段丰度显著高于其他片段，结果如图2-a～c所示。图2-a TCRβV基因使用频率分布，图2-b TCRβJ基因使用频率分布，图2-c TCRβD基因使用频率分布。横坐标为不同的V,D,J基因家族，不同的V基因家族，纵坐标为每类V基因家族的序列占 总序列数(Total reads)的百分比，可以看出：丰度最高的V基因片段为V6-1,V6-3和V6-4，丰度排前8的V基因片段共占所有V基因的50％。同样，J基因中，J2-7占所有J基因的27％。此外，我们发现，D1的丰度高于D2。图2-a～c的现象可能是受重组过程中染色体空间位置影响，即空间位置越近的越容易重组在一起。

由上可知，恒河猴具有1664中可能的VDJ重组方式(64V×2D×13J＝1,664VDJ)，本发明实施例获得了1094中VDJ重组，覆盖率达66％，结果如图2-d所示。

图2-d为整个VDJ基因组的3D分布图，3个坐标轴代表了所有可能的VDJ值，每一个(V,D,J)坐标代表一个特异的VDJ重组方式，图中小球的体积代表了该点对应的VDJ重组方式的数量。红、绿、蓝(竖轴从上至下)分别代表D2、D1和未确定的D，由于TCR D是较复杂的的区域，可能存在不稳定的缺失或转化，导致在VDJ重组过程中的D基因缺失，与此相符的，本发明分析发现，在对D基因的测序结果进行分析后，大概有16.8％的D基因测序结果比对不到确定的、对应的D基因，这些基因归类为未确定的D。

由于VDJ3种基因片段丰度的不同，我们预测VDJ重组种类也有所差异，与此相符的是，如图2-d中，在所有1094种重复方式中，不同VDJ重组方式的丰度在0.01％-1.85％之间变化，丰度最高的VDJ重组(V10-1/D2/J2-7)具有12057条测序所得序列，然而，最小丰度的VDJ重组至对应1条测序所得序列。

进一步地，如图2-e所示，图2-e为不同VDJ重组频率和数量对应分布情况。发明人随机在测序所得基因文库中选择一定比例的基因片段，统计了不同VDJ重组种类的数量。由图2-e可知，VDJ重组种类丰度变化曲线具有长尾巴分布规律。

图2-f为为测序深度和VDJ重组片段饱和度分析结果。

通过多重采样分析结果显示目前的测序深度对于TCR的多样性已经接近饱和(Fig.2f).

三、CDR3的特点

CDR3氨基酸序列中，1个氨基酸(aa)的变化可能导致受体构象的改变，因此，CDR3氨基酸序列长度的变化可以反映出CDR3基因连接区的多样性。本发明实施例中，恒河猴CDR3的定义采用人类中一样的定义，即，从TRBV最后一个半胱氨酸到TRBJ片段的FGXG结构域中的苯丙氨酸之间的序列。可以发现，CDR3的aa长度为10-16(核苷酸序列30-48bp)，其中，84％的CDR3序列长度为11-13aa之间，如图3-a所示。图3-a为TCRβ的CDR3氨基酸长度分布和不同J基因使用分布；横坐标为氨基酸序列的长度，纵坐标为某种长度CDR3序列的数量，其中，柱子中的不同颜色代表了不同的J基因，由图3-a可知，所有的TCRβ的CDR3氨基酸序列均采用了J2-1基因；此外，12个aa长度的TCRβ的CDR3序列 数量最庞大；图3-a还显示了部分具有13个氨基酸(aa)的序列的数量。

我们以12aa长度的TCRβ的CDR3序列为目标，采用Crooks et al.中的WebLogo法，研究CDR3氨基酸组成组成成份，如图3-b所示。图3-b为12aa长度的TCRβ的CDR3序列的组成情况。

图3-c反应了TCRβ的CDR3区域中氨基酸的种类，以及不同氨基酸采用的密码子情况；

图3-d为不同TCRβCDR3序列的丰度图；由图3-d可知，多数CDR3序列少于10个拷贝。

图3-e为CDR3序列组大小和多样性统计分析。

该统计是用于分析我们的测序深度是否足够用于评估目前的TCR多样性，结果显示我们的测序深度已经接近饱和，足够用于评估。

四、恒河猴的总TCRβCDR3多样性分析

CDR3多样性是正常免疫反应的基础。现有研究表明人类TCR中特异的CDR3有340,000种。为了确定我们的测序是否覆盖恒河猴主要的特异性CDR3种类，我们参照Fisher RA et al.中提到的采样-重采样统计分析方法对样本的大小和多样性进行了分析。结果如图3-e所示，相比由该方法预测的262,412种特异性CDR3序列，我们实际获得的特异性CDR3序列为235,573中，覆盖了总特异性CDR3序列的90％。

五、恒河猴连接区的多样性分析

恒河猴TCR多样性不仅来源于VDJ重组，很多TCR还来源于CDR3区域V-D和D-J之间连接区核苷酸的插入或缺失，此类插入或缺失不依赖于模板，而是通过末端脱氧核苷酸转移酶实现，在本发明中，我们参照IMGT数据库的定义，将恒河猴的TCRβ的连接区划分为13个区域，如图4-a所示。图4-a为VDJ重组片段区域的13个分区；我们对所有270,557种CDR3的核苷酸序列的每个区域均进行研究，分析了不同插入或缺失序列的长度分布情况，如图4-b所示。图4-b为VDJ重组片段区域的13个分区中，插入或缺失的片段长度分布情况，x轴表示13种片段，y轴表示VDJ重组过程中，插入或缺失的片段长度，z轴表示某种特定片段长度所占比例。z轴正方形为插入，负方向为缺失。N1和N2插入片段的平均长度分别为4bp和3bp。

注：

本发明测序结果分析方法：Illumina Hiseq 2000(paired-end 2*100)测序得到2,645,432条序列，我们用FLASH软件拼接有重叠的paired-end序列。拼接后的结果采用IMGT-High V-QUEST比对V、D和J基因。同源性低的从测序所得文库中去除。CDR3区域的起点和重点、编码框以及丰度的定义来源于IMGT。

我们用采样-重采样的方式研究整个CDR3免疫组库的大小，第一次取样中，占总CDR3免疫组库1％ 的序列中，获得953条特异性的CDR3序列，第二次取样中，占总CDR3免疫组库1％的序列中，获得885条特异性的CDR3序列，第三次取样中，占总CDR3免疫组库1％的序列中，获得9831条特异性的CDR3序列，我们总结出对数衰减值(R2＝0.97)。所有样品计算后，将所有特异性CDR3序列求和，可预测出整个CDR3免疫组库的大小。

我们用寡克隆指数(oligoclonality index，OI,见式1)来评估CDR3序列丰度的分布，如果是单克隆则OI值为1，如果不止1个克隆，OI值记为0，式1的定义基于Gini相关因素：

$>\mathrm{OI}=2\times \{\underset{k=1}{\overset{S}{\Sigma }}\frac{X_k}{S}-0.5\}---\left(1\right)$>

其中，S代表所有的TCRβCDR3克隆

S_i表示特定TCRβCDR3克隆的丰度

测序所得的TCRβCDR3克隆

表示TCRβCDR3克隆的相对丰度

表示递减顺序下，TCRβCDR3克隆的累加相对丰度。

实施例3

矫正多重PCR引物扩增误差的方法，包括：

本发明的目的之一是分析TCR序列的丰度情况，然而，PCR扩增过程中，由于PCR引物对不同基因片段的扩增偏好，会影响TCR序列丰度的真实情况。

为了评估这类系统误差，我们采用了Robins et al中的方法，我们按照实施例1的方法提取1只恒河猴的基因组，均分为6管，3管采用25循环的多重PCR(参照实施例2)，3管采用30个循环，每管扩增产物均由Illumina Miseq测序，在25循环的实验组中，共发现10,345条特异的TCR CDR3序列，15.3％were also found in the 30-cycle PCR experiment. 

我们将25循环组中发现的19658条测序结果和30循环组中发现的32647条测序结果进行分析，发现了如图5-a所示的线性关系。图5-a为PCR偏差的分析。对比25循环组和30循环组，假设误差全部来源于PCR误差，则平均每个PCR循环引入1.033，因此，整个30循环组引入的误差为1.033³⁰＝2.7。

矫正高通量测序误差的方法，包括：

(1)制备多重PCR模板

(1a)构建质粒文库 

参照实施例1和实施例2步骤(1)-(2)，进行多重PCR；

采用Invitrogen公司TOPO克隆试剂盒将实施例2步骤(2)胶回收纯化后的PCR片段与TA克隆的质粒载体连接；然后取2-3μl连接产物，加入至100μl JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰中静置30分钟后，再在42℃水浴加热60秒钟，然后迅速置于冰上1-2分钟；往转化产物中加入890μlLB培养基(amp-)，37℃、175rpm振荡培养60分钟，然后将培养液以4000rmp离心1min，弃上清若干，剩下的菌液混匀后取3/4的量在含有X-Gal(10ul)、IPTG(100ng 20ul)、Amp的L-琼脂平板培养基上涂布，待菌液完全被培养基吸收后，37度倒置培养12-16h，形成单菌落，计数白色、蓝色菌落；

挑取每个平板上单个白色菌落，加到600ul LB培养液(Amp+)，恒温孵育箱225rpm 37度震荡培养2-5h，然后取2.5ul菌液做PCR(25ul体系)；

将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认载体中插入片段的长度大小，测序后选取阳性克隆组成TCR质粒文库；

(1b)挑选26种质粒混合制备多重PCR模板

在(1a)所得TCR质粒文库中挑选出26种质粒，挑选标准为：根据BCR的C区、V、D和J区的特征，所得克隆与IMGT数据库中的序列进行生物信息学分析并分类，26种质粒为26种V区beta基因质粒，序列已知。

将该26种TCR质粒等摩尔混合后，作为多重PCR模板，每种质粒的添加数量是已知的，即每条DNA的数量是已知的；

(2)设置多重PCR引物

多重PCR引物为实施例2步骤1中多重PCR引物；

(3)多重PCR

取步骤(1)制备的多重PCR模板与多重PCR引物，参照实施例2步骤2的方法进行多重PCR，不同点在于设置3个实验组，每组平行3管，PCR循环次数分别设置为20、25、30，分别得到的PCR产物，将得到的PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，确认载体中插入片段的长度大小100-150bp，胶回收(Qiagen,Cat.No.28704,Valencia,CA)；

(4)测序分析

将所有步骤3的PCR产物送测(Illumina Miseq 2*150)，测序结果和原始质粒比对，计算误差(方法参照Robins et el.)。结果如图5-b所示。图5-b为测序误差的评价结果。

由图5-b可知，95.1％的测序结果和原始质粒完全一致，4.9％的测序结果在CDR3区域有至少1个bp的错误，经过计算，得到CDR3的测序误差为0.0186％/bp。

注：

本发明人采用的引物组：

本发明参考文献：

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