一种融合的叶酸结合蛋白质、基因序列及试剂盒

摘要

本发明涉及疾病诊断领域，特别涉及一种融合的叶酸结合蛋白质，所述蛋白质为截短的FOLR1基因、截短的FOLR2基因，以及截短的FOLR3基因以任意顺序连接后融合表达而获得的蛋白质。本发明还提供了一种用于检测叶酸含量的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的蛋白质；以及一种融合的叶酸结合蛋白质的基因序列，所述基因序列为通过表达获得如上所述的蛋白质的基因序列中的至少一种。

说明书

技术领域

本发明涉及疾病诊断领域，特别涉及一种融合的叶酸结合蛋白质。

背景技术

叶酸是一种水溶性的维生素，是介导一碳单位转移极其重要的辅助因子。在植物中， 蛋白质、核苷酸、泛酸的合成以及分子的甲基化都需要一碳单位的参与。人体自身不能合 成叶酸，体内叶酸的缺乏与许多疾病有关，其中包括心血管疾病和癌症。叶酸缺乏会引起 高同型半胱氨酸血症，它是冠状动脉疾病和中风发作的条件之一。同时叶酸在正常胚胎神 经管的发育中具有至关重要的作用，缺乏叶酸就会导致胎儿发育缺陷。因此，叶酸可预防 神经管发育畸形。

由于叶酸与DNA的合成密切相关，孕妇若摄入叶酸严重不足，就会使胎儿的DNA合成 发生障碍，细胞分裂减弱，其脊柱的关键部位的发育受损，导致脊柱裂开。妇女在怀孕的 前6周内若摄入叶酸不足，其生出无脑儿和脑脊柱裂的畸形儿的可能性增加4倍。因此测定 人体内叶酸至关重要。叶酸受体是结合并转录叶酸及其衍生物的细胞表面受体，基于此， 本发明我们重点关注人源的叶酸结合蛋白三种亚型：FRα、β和γ。其中，FRα的在体内的表 达具有明显的特异选择性：在正常细胞中低表达，而在癌症细胞中高度表达。

目前叶酸结合蛋白(FBP)主要通过盐析、离子交换、亲和层析等方法从牛奶中进行 提取。并且目前已经发展了一些叶酸检测的方法，主要有：微生物法、免疫法、高效液相 色谱法和比色法。

然而，从牛奶中提取FBP存在工艺繁琐，不确定性因素多，产量低以及易降解等缺点， 因而，需要开发出一种不同的生产FBP的技术。

发明内容

本发明的目的之一是筛选出与叶酸特异结合的融合蛋白质(也可以称作融合抗原蛋白 质)。目的之二是开发能满足应用于化学发光封闭系统的抗原蛋白，并应用于化学发光封 闭系统。

本发明对叶酸结合蛋白的三个亚型进行了深入的研究，对其中每个亚型的核心区域进 行了定位，并出乎意料的发现将三个亚型截短后进行融合表达得到的蛋白质与叶酸的结合 的性能有了非常大的改善与提高，并能够很好的应用于化学发光封闭系统以用于检测叶 酸。这相比于从牛奶中提取FBP，不但简化了工艺步骤、减少了不确定因素以及解决了产 量低的问题，而且，该融合表达的FBP用于检测叶酸时，其灵敏度和特异性也显著优于从 牛奶中提取出的FBP的灵敏度。

因此，本发明的目的之一提供了一种融合的叶酸结合蛋白质，所述蛋白质为截短的 FOLR1基因、截短的FOLR2基因，以及截短的FOLR3基因以任意顺序连接后融合表达而 获得的蛋白质。

在研究过程中，发明人发现，并非所有的融合蛋白质都具有近似的灵敏度和特异性， 而是有些灵敏度和特异性优于另外一些融合蛋白质的灵敏度和特异性。这可能是因为那些 灵敏度和特异性优良的融合蛋白质所形成的空间构象更有利于与叶酸稳定的结合，但是， 对于融合蛋白质具有优良的灵敏度和特异性的原因并不限于这一解释。

因此，在一个优选的具体实施例中，所述蛋白质的序列选自B1-B3-B2、A3-A2-B1、 C1-A2-A3、B2-B1-B3、B1-A2-B3、C1-A2-B3、B2-B3-B1、B1-A2-C3、A2-C1-C3、B3-B1-B2、 B1-B2-A3、C1-B2-A3、B3-B2-B1、B1-B2-B3、B2-C1-B3、C3-B2-A1、B1-B2-C3、C1-B2-C3、 C2-A1-A3、C2-B1-A3、A3-C1-C2、A1-C2-B3、B1-C2-B3、C1-C2-B3、C3-C2-A1、 C3-C2-B1和C3-C2-C1中的至少一种；其中，符号A1为如SEQ ID NO:1的第25-100位 的截短蛋白质，B1为如SEQ ID NO:1的第101-197位的截短蛋白质，C1为SEQ ID NO:1 的第198-234位的截短蛋白质；A2为SEQ ID NO:2的第17-96位的截短蛋白质，B2为SEQ  ID NO:2的第97-191位的截短蛋白质，C2为SEQ ID NO:2的第192-230位的截短蛋白质， A3为SEQ ID NO:3的第24-98位的截短蛋白质，B3为SEQ ID NO:3的第99-194位的截 短蛋白质，C3为SEQ ID NO:3的第195-243位的截短蛋白质；所述蛋白质的融合表达的 顺序为所述蛋白质的符号的连接顺序。

在一个更优选的具体实施例中，融合的所述蛋白质选自B1-A2-B3、B1-B2-A3、 B1-B2-B3、B1-B2-C3、B1-B3-B2、B2-B1-B3、B2-B3-B1、B3-B1-B2、B3-B2-B1中的至少 一种。

在一个最优选的具体实施例中，融合的所述蛋白质选自B1-B2-B3、B1-B3-B2、 B2-B1-B3、B2-B3-B1、B3-B1-B2、B3-B2-B1中的至少一种。

在一个具体的实施例中，融合的所述蛋白质为在真核表达系统中表达而获得的蛋白 质，优选为在哺乳动物表达系统中表达而获得的蛋白质。

在本发明中，对该融合蛋白进行表达，最重要的目的是将其用于叶酸的检测，而在叶 酸可以选用的检测的众多方法中，目前比较前沿的方法为化学发光标记检测法，但在化学 发光标记检测中利用融合蛋白检测叶酸尚属空白，因此，在一个具体的实施例中，所述蛋 白质可以进行示踪物标记，从而形成携带有标记示踪物的蛋白质，也就是说，所述蛋白质 可以使用示踪物标记；或者，所述蛋白质包被磁珠。所述携带有标记示踪物的蛋白质选自 化学发光标记的蛋白质、生物素化的蛋白质、生物素衍生物化的蛋白质或荧光素标记的蛋 白质中的至少一种。

在一个具体的实施例中，标记示踪物选自吖啶酯、吖啶酯酸-NHS酯、吖啶酸丙磺酸 钠盐、9-吖啶羧酸、鲁米诺、鲁米诺钠盐、光泽精、3,3',5,5'-四甲基联苯胺丙磺酸钠、3,3',5,5'- 四甲基联苯胺、异鲁米洛、多聚异鲁米诺、多聚吖啶酯、氧化葡聚糖、氨化葡聚糖、羧基 化葡聚糖、生物素、生物素衍生物以及荧光素中的一种。

本发明目的之二在于提供一种用于检测叶酸含量的试剂盒，所述试剂盒包括如上携带 有标记示踪物和/或不携带有标记示踪物的所述的蛋白质。

在一个具体的实施例中，当所述蛋白质使用示踪物标记时，所述试剂盒中还包括包被 FA-NHS-修饰蛋白的磁珠；当所述蛋白质包被磁珠时，所述试剂盒中还包括携带有标记示 踪物的FA-NHS-修饰蛋白。所述标记示踪物可以选自吖啶酯、吖啶酯酸-NHS酯、吖啶酸 丙磺酸钠盐、9-吖啶羧酸、鲁米诺、鲁米诺钠盐、光泽精、3,3',5,5'-四甲基联苯胺丙磺酸钠、 3,3',5,5'-四甲基联苯胺、异鲁米洛、多聚异鲁米诺、多聚吖啶酯、氧化葡聚糖、氨化葡聚糖、 羧基化葡聚糖、生物素、生物素衍生物以及荧光素中的一种。

本发明目的之三提供了一种融合的叶酸结合蛋白质的基因序列，所述基因序列为通过 表达获得如上所述的蛋白质的基因序列中的至少一种。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做以下详细说明。

实施例1

1.主要试剂与设备

PCR所用试剂(包括Taq酶、缓冲液和dNTP等)，T4连接酶、DNA Marker、蛋白Marker 购自全式金生物技术有限公司；Xba I和Kpn I及其他限制性内切酶、小牛肠碱性磷酸酶 (CIAP)购自Takara(宝生物工程(大连)有限公司)；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒 购自OMEGA公司；氨苄青霉素购自BBI公司；PCR引物及重组质粒测序由华大基因公司或 Invitrogen公司完成；所用Anti-His(C-term)-HRP抗体及ECL显色剂均购自康为世纪公司； Ni柱蛋白纯化试剂盒购自康为世纪。其余试剂由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 提供。

ABI Veriti PCR仪购自ABI，水平电泳仪RDY-SP1Z购自上海山富，恒温摇床COS-2102C 购自上海比朗，超净工作台BSC-1000II A2购自上海博迅实业有限公司，离心机购自Sigma， 倒置显微镜购自奥林巴斯，垂直电泳仪购自BioRad，转膜仪购自BioRad，凝胶成像仪805 购自上海山富，其余设备由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供。

2.细胞株、菌株和质粒

Human FBP(hFBP，来源于人的叶酸结合蛋白)的cDNA购自OriGene公司，其包括 FOLR1、FOLR2和FOLR3三个亚型的cDNA序列。质粒pEF1/V5-His A及Expi293F^TM细胞、 相应的培养基购自life technology公司；感受态细胞Trans5α购自北京全式金公司。

3.通过分子克隆技术构建表达FBP的动物细胞表达载体

3.1引物的设计与合成

为确保得到截短的FOLR1、FOLR2和FOLR3的融合表达的最佳组合，本发明首先对 hFBP的三个亚型FOLR1、FOLR2和FOLR3分别截短，并对单独表达的片段进行筛选：

利用Primer primer5.0根据FOLR1的cDNA序列(SEQ ID NO:4)设计扩增截短的FOLR1  DNA的特异性引物，正向引物增加起始密码子，并分别在其序列的两端分别引入Kpn I和 XbaI酶切位点，引物序列如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:12。详细信息见表1。

表1

利用Primer primer5.0根据FOLR2的cDNA序列(SEQ ID NO:5)设计扩增截短的FOLR2  DNA的特异性引物，正向引物增加起始密码子，并分别在其序列的两端分别引入Kpn I和 Xba I酶切位点，引物序列如SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:18。详细信息见表2。

表2

利用Primer primer5.0根据FOLR2的cDNA序列(SEQ ID NO:6)设计扩增截短的FOLR3 DNA的特异性引物，正向引物增加起始密码子，并分别在其序列的两端分别引入Kpn I和 Xba I酶切位点，引物序列如SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:24。详细信息见表3。

表3

以购买的人源FBP cDNA为模板，利用相应的上下游引物，PCR扩增出目的条带，用 胶回收试剂盒回收目的基因的片段，然后分别双酶切pEF1/V5-His A载体和纯化的目的片 段。酶切结束后用胶回收试剂盒直接纯化回收截短的FOLR1片段、截短的FOLR2片段、 截短的FOLR3片段分别与pEF1/V5-His线性载体的酶切产物进行连接。即向酶切后的线性 载体中直接加入1μL CIAP，37℃反应1h进行去磷处理(选做)。用T4连接酶连接纯化 后的目的片段和线性载体片段(两者的摩尔数的比例为1:2～1:10)，连接体系为10μL，16℃ 连接过夜。

将连接体系转化大肠杆菌(E.coli)Trans5α。将转化产物涂布于含氨苄(100μg/mL) 的LB固体培养基中，37℃过夜培养。在含有重组杆粒的LB平板上随机挑取多个单菌落， 进行菌液PCR和双酶切并测序验证阳性样品。将获得的阳性载体转染Expi293F^TM细胞， 培养后进行蛋白检测。

收集经过培养的细胞，提取蛋白，然后采用亲和层析纯化重组蛋白。

在上述筛选的截短FOLR1、FOLR2和FOLR3的蛋白质表达的实验结果基础上进行随 机组合，其中优选的融合片段列举如下：B1-B3-B2、A3-A2-B1、C1-A2-A3、B2-B1-B3、 B1-A2-B3、C1-A2-B3、B2-B3-B1、B1-A2-C3、A2-C1-C3、B3-B1-B2、B1-B2-A3、 C1-B2-A3、B3-B2-B1、B1-B2-B3、B2-C1-B3、C3-B2-A1、B1-B2-C3、C1-B2-C3、C2- A1-A3、C2-B1-A3、A3-C1-C2、A1-C2-B3、B1-C2-B3、C1-C2-B3、C3-C2-A1、C3-C2-B1 和C3-C2-C1。

其中，克隆上述融合的蛋白质的cDNA所用的引物序列的设计与单独扩增FOLR1、 FOLR2和FOLR3的设计基本相同，其不同之处在于，如果有必要(例如当不适用于表达 载体中的起始密码子时)，用于扩增5’端DNA片段的上游引物含起码密码子，其下游引 物不含终止密码子；中间片段的上游引物不含起始密码子，下游引物不含终止密码子；而 用于扩增3’端DNA片段的上游可以不含起始密码子，但在必要的情况下(例如当不适用 于表达载体中的终止密码子时)，其下游引物含终止密码子(例如，如果将A1-A2-A3克隆 到pEF1/V5-His质粒，扩增A1片段的上游引物含有起码密码子，但其下游引物不含终止 密码子；扩增A2片段的上游引物可以不含起始密码子，其下游引物不含终止密码子，而 扩增A3片段的上游引物可以不含起始密码子，其下游引物不含终止密码子)。此三个DNA 片段可以通过重叠PCR的方式获得DNA片段后与载体进行常规的连接，或通过引入适当 的酶切位点的方式，将扩增的PCR产物进行酶切，之后依次将三段PCR产物连接到同一 载体上，或将酶切后的三段PCR产物同时与同一载体连接获得可进行融合表达的DNA片 段。接下来的操作步骤同上述蛋白质表达的步骤。

4.FBP检测

Western blot：取单克隆细胞上清l0μL，加入2×SDS上样缓冲液，95℃变性5min， 进行SDS-PAGE电泳。其中，浓缩胶丙烯酰胺的浓度为5％，分离胶丙烯酰胺的浓度为10％。 电泳时，浓缩胶层的电泳电压为80V，分离胶层的电泳电压为120V。电泳完毕后，用转 移电泳仪将蛋白转印至PVDF膜上，恒电流300mA转膜2h。以TBST溶液洗膜3次后， 将膜置于2％鸡卵清封闭液中封闭1h：用TBST洗膜10min×3次，采用 Anti-His(C-term)-HRP进行杂交，并显色观察，并拍照记录。

5.收获并纯化重组蛋白

采用康为世纪的可溶性蛋白纯化试剂盒进行融合蛋白的纯化。

(1)样品的处理：

用灭菌的PBS Buffer洗涤重悬细胞，采用超声破碎(超声3s，间隔ls，总时间12min) 细胞的方法破碎细胞。然后12,000rpm，离心20min；收集上清。

(2)纯化步骤：

依据康为世纪可溶性蛋白Ni柱纯化操作说明进行。

6.实验结果

采用hFBP/pEF1/V5-His A在Expi293F^TM细胞哺乳动物表达系统表达的重组hFBP抗原 蛋白纯度和产量高。

实施例2

利用优化表达得到的hFBP抗原进行化学发光检测

本发明使用ABEI标记FBP，FA-NHS-修饰蛋白直接包被磁球方案，在本发明中最终 形成ABEI-FBP-FA-NHS-修饰蛋白-磁球的发光免疫复合物。血清中的叶酸与磁球上的 FA-NHS-修饰蛋白竞争结合FBP，最终检测FA浓度与光强度成反比。通过低高校准品修 正工作曲线后，根据四参数拟合可由检测光强度得到浓度值。

其中，由于叶酸为小分子物质，基本很难直接连接到磁球上，故需要对其进行一定的 蛋白修饰处理以便更容易吸附在磁球表面的小孔中。可用于修饰的蛋白可以为羊IgG、牛 IgG、鼠IgG、兔IgG等中的一种，但并不局限于此。然后通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 与叶酸相连，最终形成FA-NHS-修饰蛋白的叶酸衍生物。

另外因为血清中的叶酸大部分均与叶酸结合蛋白紧密结合，而如需要使两者分离需要 对蛋白进行变性处理，目前国际通用的方法为使用二硫苏糖醇及NaOH溶液对血清样本进 行处理，本发明也沿用了此方法。

本实施例所用组分如下：

(1)包被FA-NHS-修饰蛋白的磁性微球溶液(FA-NHS-修饰蛋白浓度：10-100μg/l；磁性 微球浓度：0.1-2mg/mL)。

(2)标记FBP的ABEI溶液(FBP浓度：10-100μg/l；ABEI浓度：0.1-1mg/l)。

(3)ABEI稀释液(0.1-1M磷酸盐缓冲液pH值：5.0-6.0)。

(4)含FA的低点校准品(浓度为1-3ng/mL)。

(5)含FA的高点校准品(浓度为10-20ng/mL)。

(6)样本释放剂1：DTT冻干粉(DTT有效含量：30mg)。

(7)样本释放剂2：NaOH溶液(浓度为0.1-1mol/l)。

所述各组分除样本释放剂1、2外均含有BSA和防腐剂，BSA浓度为0.01-0.5mg/mL， 防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或两种以上混 合物。

上述包被FA-NHS-修饰蛋白的磁性微球通过以下方法制备：先使用N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)等作为搭桥物质连接FA与修饰蛋白后形成“FA-NHS-修饰蛋白”复合物，再使 用碳二亚胺(CDC)等作为搭桥物质连接FA-NHS-修饰蛋白与经处理后已吸附羧基基团的 磁性微球，30-40℃温育1-2小时，再经过3-5次磁球悬浮液的洗涤去除杂质，即可使用。

上述标记ABEI的FBP通过以下方法制备：使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等作为搭 桥物质连接ABEI与FBP后，经过G-25凝胶层析过柱得到纯化物。

具体试剂盒可根据上述范围值酌情搭配。

检测过程具体操作如下：

1.样本预处理：因血清中的叶酸大部分均和FBP紧密结合，故需要样本释放剂对血清使 用国际通用的方法为使用二硫苏糖醇及NaOH溶液对血清样本进行预处理，让其中的FA 充分释放与FBP结合。

用300μL蒸馏水或去离子水将冻干DTT试剂充分溶解，用吸管取5mL样本释放剂2 加入到空置换剂瓶中，再取100μL样本释放剂1加入到上述置换剂瓶中，用吸管混匀，然 后将配制好的样本释放剂插入到试剂盒置换剂孔中，仪器自动取40μL样本释放剂及40μL 样本(或校准品)至反应杯中，37℃温育2分钟。

2.加入标记FBP的发光标记物100μL、包被FA-NHS-牛IgG的磁性微球溶液20μL。

3.37℃温育15分钟。

4.自动灌注系统缓冲液进行清洗。

5.加入底物后检测光强度。

实施例3

将提取的牛奶中的FBP(Cabioreagents公司购买)、单独真核表达的B1、B2和B3 的纯蛋白混合物(即B1+B2+B3)与上述真核表达FBP对血清中叶酸(FA)检测的结果 影响进行对比：随机挑取5例阳性体检标本及Bio-rad质控作为检测样本，分别使用等量 的ABEI标记FBP，其他成分均一致，检测结果如表4-7。

表4

表5

表6

表7

结果分析：从以上结果可发现本发明中真核融合表达FBP片段B1-A2-B3、B1-B2-A3、 B1-B2-B3、B1-B2-C3、B1-B3-B2、B2-B1-B3、B2-B3-B1、B3-B1-B2、B3-B2-B1用于化学 发光检测系统能够达到非常优良的技术效果，从而大大提高了检测叶酸的灵敏度和特异 性。尤其是与牛奶提取FBP(Cabioreagents公司购买)使用化学发光法检测叶酸相比， B1-B3-B2、B2-B1-B3、B2-B3-B1、B3-B1-B2、B3-B2-B1、B1-B2-B3的低值样本光强度结 果更高，高值样本光强度结果更低，整体区分度更好，因此本发明选取其为最优的融合蛋 白质。

实施例4

基于上述化学发光检测系统的检测结果，将上述得到的9个优化片段B1-A2-B3、 B1-B2-A3、B1-B2-B3、B1-B2-C3、B1-B3-B2、B2-B1-B3、B2-B3-B1、B3-B1-B2、B3-B2-B1 进行稳定性分析。以从牛奶中提取的FBP为对照，将标记ABEI后的上述蛋白质溶液进行5℃ 及37℃的稳定性跟踪，在其他条件均不变的前提下观察对比样本在5℃及37℃温度下一周 内所检测光强度。选用样本为：零点稀释液(0ng/mL)、配制FA中间品(即校准品，20 ng/mL)、Bio-rad质控及上述5例阳性体检样本，检测从牛奶中提取的FBP各样本的热稳定 性结果见表8，真核表达片段B1-A2-B3、B1-B2-A3、B1-B2-B3、B1-B2-C3、B1-B3-B2、 B2-B1-B3、B2-B3-B1、B3-B1-B2、B3-B2-B1热稳定性结果依次见表9-17。

表8 从牛奶中提取的FBP的热稳定性结果

表9 B1-A2-B3的热稳定性结果

表10 B1-B2-A3的热稳定性结果

表11 B1-B2-B3的的热稳定性结果

表12 B1-B2-C3的热稳定性结果

表13 B1-B3-B2的热稳定性结果

表14 B2-B1-B3的热稳定性结果

表15 B2-B3-B1的热稳定性结果

表16 B3-B1-B2的热稳定性结果

表17 B3-B2-B1的热稳定性结果

结果分析：从以上结果可发现，真核表达的各个片段在5℃和37℃都具有很好的热 稳定性，而B1-B2-B3、B1-B3-B2、B2-B1-B3、B2-B3-B1、B3-B1-B2和B3-B2-B1更加突 出，因此这6个片段是本发明最终获得的最优片段。

实施例5

特异性分析

为了比较上述表达的FBP融合片段与从牛奶中提取的FBP，以及B1、B2与B3的组 合物的特异性，在本发明中选取了检测叶酸过程中几种常见的交叉物，例如氨蝶呤、亚叶 酸、氨甲碟呤作为干扰，试验方法参照技术文献D.S.Young,Effects of drugs on clinical lab  tests,5th ed.AACC Press,Washington D.C.中的进行，计算交叉率，结果见表18表19。

表18

表19

结果分析：真核表达的融合的FBP蛋白与其他干扰物交叉率较从牛奶中提取的FBP， 以及B1、B2与B3的组合物与其他干扰物交叉率均明显降低，特别是B1-B2-B3、B1-B3-B2、 B2-B1-B3、B2-B3-B1、B3-B1-B2、B3-B2-B1尤为显著。

结论：由实施例1-5的验证结果可知真核表达的融合的FBP蛋白B1-B2-B3、B1-B3-B2、 B2-B1-B3、B2-B3-B1、B3-B1-B2、B3-B2-B1在纯度、特异性、检测灵敏度、热稳定性相 对于从牛奶中提取的FBP以及B1、B2与B3的混合物均有着明显的改善，从而可使目前 叶酸检测更为准确灵敏。

需要说明的是，虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精 神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具 体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体 实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这 是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示 例的方式，并不旨在限制本发明。