一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法

摘要

本发明涉及一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，包括如下步骤：步骤1，线粒体基因组覆盖引物设计；步骤2，NUMT排查；步骤3，基因组混池构建；步骤4，PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分析。本发明所述的方法，运用全基因组测序策略，采用DNA混池测序技术，建立了一整套线粒体基因组多态的分析方法，既排除了NUMT对线粒体基因多态分析的潜在干扰，获得真实的线粒体基因组多态信息，又能高效、便捷地获得品种内、品种间的多态信息。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域中DNA多态位点的检测方法，具体说是一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法。

背景技术

线粒体是动物细胞的动力工厂，机体内90％以上的能量都是由线粒体内膜呼吸链复合体氧化磷酸化合成的ATP提供。线粒体基因组(mitochondrial genome，mtDNA，线粒体DNA)是动物体内唯一长期、稳定存在的核外基因组。动物线粒体基因组因其在世代间没有基因重组、呈现严格母系遗传、拷贝数高等特点，被广泛用于动物起源进化、物种鉴定、疾病诊断、衰老、抗病力以及动物经济性状的研究与应用。

线粒体基因组多态分析是开展线粒体功能相关研究与应用的前提。目前，线粒体基因组多态分析没有系统的方法报道，特别是缺少针对不同群体(品种)间的线粒体基因组多态分析方法。针对线粒体基因组多态分析方法，目前使用较为广泛的是利用线粒体基因组覆盖引物的PCR测序技术，即针对来自不同母系的个体，逐一进行线粒体基因组分段引物的PCR扩增及PCR产物的测序。该方法存在两个缺陷：一是该方法费时、费力，需要大量的PCR扩增和PCR产物测序的重复操作；二是更为关键的缺陷，该方法没有考虑核线粒体假基因可能存在的干扰，因此在检测DNA多态的结果上存在假阳性的风险，即可能导致对线粒体基因组多态的分析出现错判。

核线粒体假基因(Nuclear mitochondrial pseudogen，NUMT)是线粒体基因组(线粒体DNA)序列在物种进化过程中插入到核基因中的DNA片段。自1967年第一次通过核DNA和mtDNA杂交在小鼠肝 脏中发现NUMT以来，几乎所有的高等动物核基因组都发现了NUMT的存在。通常情况下，利用常规PCR和通用引物会将mtDNA和NUMT的靶序列共扩增出来，导致mtDNA多态检测出现假阳性的结果。例如，mtDNA条形码是为了快速鉴定物种而设计的一小段标准基因序列作为物种特异标记，比如说选择物种保守基因COI作为一个DNA条形码，但是在此序列存在NUMT的对应序列，如果引物设计不当，很容易导致mtDNA与NUMT的共扩增而不能有效鉴定物种来源(Moulton et al.，2010)。另一个典型的例子是mtDNA突变与Alzheimer’s疾病之间的关系，同样也是因为有NUMT的存在而影响了对该mtDNA突变的判断(Wallace et al.，1997)。这两个例子都说明了NUMT已经成为mtDNA多态研究的影响因素。所以，有效排查NUMT是开展mtDNA研究必要的环节。

因此，开展线粒体功能相关研究与应用需要建立一整套系统的群体(品种)间线粒体基因组多态分析的技术方法，同时，群体(品种)内线粒体基因组多态检测技术也需要完善(排查NUMT)，现行方法中大量的PCR扩增和PCR产物测序的重复操作也需要从分析策略上加以改进。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，运用全基因组测序策略，采用DNA混池测序技术，通过线粒体基因组覆盖引物设计、NUMT排查、基因组混池构建、PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分析，建立了一整套线粒体基因组多态分析的方法，既排除了NUMT对线粒体基因多态分析的潜在干扰，获得了真实的线粒体基因组多态信息，又能高效、便捷地获得品种内、品种间的多态信息。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征 在于，包括如下步骤：

步骤1，线粒体基因组覆盖引物设计；

步骤2，NUMT排查，得到覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物；

步骤3，基因组混池构建；

步骤4，PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分析。

在上述技术方案的基础上，步骤1中，参照已有线粒体基因组序列，设计线粒体基因组PCR引物，所述线粒体基因组PCR引物扩增覆盖线粒体基因组片段，且保证每对引物在扩增单一DNA模板(样品)时只特异扩增mtDNA片段，无测序套峰出现。

在上述技术方案的基础上，步骤2中，用步骤1设计的线粒体基因组PCR引物分别对单一DNA模板(样品)进行扩增和PCR产物测序，其中：

扩增片段应为单一特异条带，否则需要优化扩增条件或重新设计引物直至出现单一特异条带；

PCR产物的测序结果应为特异峰图，无套峰出现，否则需要优化扩增条件或重新设计引物直至无测序套峰出现；

同时满足扩增片段为单一特异条带和PCR产物的测序结果为特异峰图，即得到所需的覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物。

在上述技术方案的基础上，步骤3中，采用DNA混池测序技术，将不同母系来源的猪基因组DNA样品浓度标定为100ng/μL，并等量混合，每个混池的最大样本量为20个。

在上述技术方案的基础上，步骤4中，使用步骤2得到的覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物进行扩增、测序及序列比对分析，从而获得品种内、品种间多态位点。

在上述技术方案的基础上，品种内多态通过混池测序出现的套峰直接获得；品种间多态的查找方法为：以单字母定义品种内多态类型，规则为：R表示A+G，Y表示C+T，M表示A+C，K表示G+T，S表示C+G，W表示A+T；通过定义字母替代碱基多态类型即可获得品种特异的线粒体基因组定义DNA序列，通过比对不同品种的定义序列，即可获得 品种间多态位点。

本发明所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，简便、快捷、准确，具有以下优点：

(1)本发明建立了一整套获得不同群体(品种)线粒体基因组多态检测的分子生物学方法，包括品种内和品种间线粒体基因组多态的检测方法。

(2)建立了系统的品种内线粒体基因组多态的检测方法，包括线粒体基因组引物的NUMT排查步骤，从而避免了NUMT共扩增而出现假阳性的潜在风险，为获得真实线粒体基因组多态提供了保障，并采用DNA混池测序技术获得线粒体基因组多态信息，提高了实验检测效率，降低了实验费用。

(3)利用单字母定义品种内多态类型的设计，建立了品种间线粒体基因组多态的分析方法。

本发明所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，具有社会效益及经济效益。

1、社会效益：线粒体基因组多态在动物起源与进化、群体遗传结构分析、疾病、经济性状(产奶量、日增重、肉质、繁殖、抗病力等)等领域的研究与应用紧密相关。本发明是真实检测动物群体线粒体基因组多态的有效方法，对开展动物线粒体基因效应分析、群体遗传结构、起源、进化的研究具有重要的现实意义。

2、经济效益：本发明具有简便、经济的特点。针对1个具有20个实验样本(混池的最大实验样品量)，与常规检测方法相比，在不考虑相同的支出费用的情况下(DNA提取、线粒体基因组覆盖引物合成)，本方法的检测费用仅为常规方法的1/20(见下表)。如果检测样本量或检测群体增加，本方法的优势将更加明显。因此，本方法具有操作简便、费用低廉的优点。

本发明与常规方法的成本核算(相同的支出的费用没有罗列)

具体实施方式

本发明所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，建立了一整套获得不同品种(或群体)线粒体基因组多态检测的分子生物学方法。具体的技术解决方案包括如下三个连续的环节：

一是设计、筛选覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物，保证每对引物在扩增单一DNA模板(样品)时只特异扩增mtDNA片段，无测序套峰出现；

二是将同一品种(或群体)的DNA样品等量混池并进行线粒体基因组覆盖引物的扩增、测序；

三是进行测序结果的比对分析，品种(或群体)内多态通过混池测序的套峰获得；

品种(或群体)间多态的获取方法为：以单字母定义品种内多态类型，规则为：R表示A+G，Y表示C+T，M表示A+C，K表示G+T，S表示C+G，W表示A+T；通过定义单字母替代碱基多态类型即可获得品种特异的线粒体基因组定义序列，通过比对不同品种(或群体)的定义序列的差异，获得品种间多态位点。

本发明所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，包括以下步骤：

步骤1，线粒体基因组覆盖引物设计；

步骤2，NUMT排查，得到覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物；

步骤3，基因组混池构建；

步骤4，PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分析。

在上述技术方案的基础上，步骤1中，参照已有线粒体基因组序列，设计线粒体基因组PCR引物，所述线粒体基因组PCR引物扩增覆盖线粒体基因组片段，且保证每对引物在扩增单一DNA模板(样品)时只特异扩增mtDNA片段，无测序套峰出现，符合这一要求的线粒体基因组PCR引物即为覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物。

在上述技术方案的基础上，本发明增加了线粒体基因组覆盖引物的NUMT排查步骤(步骤2)，具体的技术解决方案如下：

用线粒体基因组覆盖引物(步骤1设计的线粒体基因组PCR引物)分别对单一DNA模板(样品)进行扩增和PCR产物测序，其中：

扩增片段应为单一特异条带，否则需要优化扩增条件或重新设计引物直至出现单一特异条带；

PCR产物的测序结果应为特异峰图，无套峰出现，否则需要优化扩增条件或重新设计引物直至无测序套峰出现；

同时满足扩增片段为单一特异条带和PCR产物的测序结果为特异峰图，即得到所需的覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物。

在上述技术方案的基础上，步骤3中，采用DNA混池测序技术替代现行方法中对每个实验样品(个体)的PCR扩增、测序的的方法，将同一群体(品种)的DNA样品混池，具体的技术解决方案如下：

将不同母系来源的猪基因组DNA样品浓度标定为100ng/μL，并等量混合，每个混池的最大样本量为20个。

在上述技术方案的基础上，步骤4中，使用步骤2得到的覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物进行扩增、测序及序列比对分析，从而 获得品种内、品种间多态位点，其中：

品种内多态通过混池测序出现的套峰直接获得；

品种间多态的查找方法为：以单字母定义品种内多态类型，规则为：R表示A+G，Y表示C+T，M表示A+C，K表示G+T，S表示C+G，W表示A+T；通过定义字母替代碱基多态类型即可获得品种特异的线粒体基因组定义DNA序列，通过比对不同品种的定义序列，即可获得品种间多态位点。

以下为具体实施例。

(一)实验动物

实验动物为不同品种猪，包括二花脸、梅山、沂蒙黑、杜洛克、苏淮、大白，每个品种为不同母系来源的个体，各20头猪。采集外周血1mL，EDTA抗凝。

(二)DNA提取

总DNA来自猪血液，其提取的方法如下：

(1)向1.5mL离心管(EP管)中加入200μL血样。加入500ul SNET(1％SDS，400mM Nacl，5mM EDTA，20mM Tris-cl PH8.0)，混匀。

(2)向以上溶液中加入蛋白酶K至终浓度100ng/mL，混匀。

(3)55℃孵育4h。

(4)加入等体积的Tris-饱和酚，缓慢颠倒离心管数次，12000g离心10min。

(5)取水相于新的EP管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，震荡摇匀10min，12000g离心10min。

(6)取水相于新的EP管中，加入1/10体积的3M NaAc及2.5倍体积的无水乙醇，摇匀，-20℃静置30min，12000g离心10min。

(7)去水相，干燥后用适量的超纯水溶解，标定DNA浓度。

(三)猪线粒体基因组特异引物设计与NUMT排查

参照猪线粒体基因组序列(NC_000845.1)，使用Primer premier version 5设计出16对覆盖猪线粒体基因组引物，每段序列长度约1.2kb，相邻片段有100bp左右的重叠区域。

16对引物分别对一头猪的DNA模板进行扩增(扩增片段应为单一特异条带，否则需要优化扩增条件或重新设计引物直至出现单一特异条带)和PCR产物测序；PCR产物测序结果出现套峰，则需要优化扩增条件或重新设计引物直至无测序套峰出现。最终经鉴定的16对猪线粒体基因组特异引物信息如表1所示。

表1猪线粒体基因组特异PCR引物信息(序列参考：NC_000845.1)

(四)DNA样品混池测序

利用酶标仪测定每个样品DNA浓度，按照每个样品浓度为100ng/μL组成DNA池。

16对线粒体基因组特异PCR引物扩增、测序如下：

(1)混池DNA的PCR反应体系(25ul)：

(2)反应条件：95℃预变性5分钟；循环条件95℃变性20秒，退火50秒(退火温度Tm见表1所示)，72℃延伸90秒，35个循环， 72℃延伸7分钟；4℃保存。

(3)PCR产物测序：将PCR产物纯化后直接测序，获得DNA序列信息。 

(五)序列拼接与品种内、品种间多态位点分析

参考已公开的猪线粒体全基因组序列，利用DNASTAR软件中SeqMan模块将测序获得的每一段基因序列进行拼接、比对，获得各品种内线粒体基因组多态位点。

品种间多态的查找方法为：以单字母定义品种内多态类型，规则为：R表示A+G，Y表示C+T，M表示A+C，K表示G+T，S表示C+G，W表示A+T。这样通过以定义字母替代碱基多态类型即可获得品种特异的线粒体基因组定义序列，通过比对不同品种的定义序列，即可获得品种间多态位点。如表2，13325T(Y表示C+T)为二花脸所特有碱基，13354A、13399T、13502C、13526C为杜洛克所特有的碱基类型，13393C(S表示C+G)为大白猪所特有碱基，13629A(R表示A+G)为梅山和沂蒙黑特有的碱基类型。

表2品种间线粒体基因组多态位点的比对方法

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

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