结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒及其制备方法，检测试剂盒由TB-SA抗原包被板、样品稀释液、酶标记液、浓缩洗液、显色剂A液、显色剂B液、阴性对照品、阳性对照品和终止液组成。制备方法包括：TB-SA抗原包被板的制备、样品稀释液的制备、酶标记液的制备、浓缩洗液的制备、对照品的制备和显色液的制备。本发明灵敏度高、特异性强，因此，本发明不但减少了假阳性或假阴性现象对临床诊断带来的干扰，使该试剂盒能够对结核分枝杆菌TB-SA抗体进行快速、准确的检测，而且误差小、检测灵敏度高；该试剂盒制备方便，制备方法操作简单，适宜于工业化大规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试 剂盒及其制备方法。

背景技术

结核病、艾滋病与疟疾一起，被视为至今影响全球公共卫生的三大疾病，结核病是我国 重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。

据世界卫生组织(WHO)和全国第五次结核病流行病学调查显示：目前全球有近1/3的人 口感染结核分枝杆菌，每年有约800万新病例发生，接近300万人死于该病。中国是全球22 个结核病高负担国家之一，结核病患者数量居世界第二位。目前有肺结核病人约450万，结 核病年发病人数约130万，我国肺结核的发病率为459/10万人，占全球发病的14.3％，每年 因结核病死亡人数达13万，大大超过其他传染病死亡人数的总和。

结核病是人畜共患传染病，可感染各个阶段的人群，第五次流行病学调查显示，随着年 龄的增长，结核病人的发病率增加。有报道显示，一个传染性结核病人一年内可能传染10～ 15人。面对如此严峻的形势，我们应该及早采取措施。结核病的早期诊断及有效治疗是结核 病预防工作的重中之重，对于控制结核菌传播有着重要的临床意义。目前国内大多数医院根 据直接涂片镜检和结核分枝杆菌培养技术对活动性结合进行诊断。结核菌涂片检测虽然简单 易行且准确性高，但阳性率低。结核菌培养检测可信度高，但耗时较长，不能满足临床需求。 此外，结核菌素皮试(PPD)试验所用抗原为结核分枝杆菌粗提的抗原混合物，和许多非结核 分枝杆菌及卡介苗(BCG)均存在共同抗原成分，从而导致该法用于结核病诊断特异性差。中 国是结核病高度流行区，由于广泛接种BCG，也造成PPD实验假阳性率很高，所以临床上只 能根据PPD实验皮肤的反应强弱给予辅助诊断。

发明内容

本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种可快速定性检测样本中的结核分枝 杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒的制备方 法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测 试剂盒，所述检测试剂盒由TB-SA抗原包被板、样品稀释液、酶标记液、浓缩洗液、显色剂 A液、显色剂B液、阴性对照品、阳性对照品和终止液组成。

进一步地，所述TB-SA抗原包被板为包被有TB-SA抗原的微孔板，所述TB-SA抗原用磷 酸盐缓冲液稀释，其包被浓度为0.01mg/ml。

进一步地，所述样品稀释液为含有吐温-20和蛋白的缓冲液。

进一步地，所述酶标记液为含辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A溶液。

进一步地，所述浓缩洗液为含吐温-20的缓冲液。

进一步地，所述显色剂A液为含有过氧化脲的溶液，显色剂B液为含TMB的溶液。

进一步地，所述阳性对照品为含TB-SA抗体阳性的血清溶液，阴性对照品为含TB-SA抗 体阴性的血清溶液。

进一步地，所述终止液为含硫酸的溶液。

结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒的制备方法，它包括以下步骤：

S1.TB-SA抗原包被板的制备：用磷酸盐缓冲液将TB-SA抗原稀释至包被浓度为0.01mg/ml， 将包被液包被于微孔板上，35～40℃干燥后保存；

S2.样品稀释液的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液500ml，加入酪蛋白5.00g，加入纯化 水搅拌至酪蛋白充分溶解；再加入3ml的吐温-20，混匀后加纯化水至1000ml，充分混匀， 保存；

S3.酶标记液的制备：用pH为10倍浓缩的磷酸盐缓冲液300ml，加纯化水至3000ml，将辣 根过氧化物酶标的葡萄球菌蛋白A稀释至1:4万～1:6万，保存；

S4.浓缩洗液的制备：称取氯化钠300g、磷酸氢二钠85g加入1000ml纯化水溶解后，再加 吐温-20 15ml，用纯化水加至1300ml，搅拌混匀后保存；

S5.对照品的制备

S51.阳性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0.15g、吐温 -20 0.35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阳性的 血清6.5ml，混匀后保存；

S52.阴性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0.15g、吐温 -20 0.35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阴性的 血清6.5ml，混匀后保存；

S6.显色液的制备：

S61.显色剂A液的制备：称取柠檬酸0.9g，过氧化脲0.1g，加纯化水100ml溶解后， 加纯化水至170ml，充分混匀后保存；

S62.显色剂B液的制备：用100ml纯化水将3g柠檬酸溶解后加入丙三醇17ml，混匀后 加入用3ml DMSO溶解的0.04g TMB，加纯化水至170ml，保存；

S7.终止液的制备：将纯化水150ml和量取的硫酸18ml混匀后加纯化水至180ml，保存。

本发明的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒的检测原理：

本试剂盒在微孔板内包被TB-SA抗原，若待测样本中有TB-SA抗体即可与之结合，再与 酶标记抗体反应，形成“抗原-抗体-酶复合物”，酶催化显色剂显色，根据显色程度可判断 TB-SA抗体的有无。

本试剂盒检测样本为血清，分离的样本可在2-8℃保存下存储7天，长期存储应置-20℃， 避免反复冻融，冷藏或冷冻保存的样本使用前应平衡至室温，并充分混匀。

本试剂盒的检测方法为：

1.试剂准备：将试剂盒平衡至室温，用纯化水将浓缩洗液作1:20稀释，即配成洗涤工 作液备用。

2.加样：将所需数量的TB-SA抗原包被板条固定于板架上，各孔加入100μl样本稀释 液，按序加入5μl待测样本；每次实验设空白对照(用双波长检测时可以不设空白对照)、 阴性对照、阳性对照各2孔，分别加入样本稀释液、阴性对照品、阳性对照品各100μl/孔； 震荡混匀，封板，37℃温育10分钟，用洗涤工作液洗板5次，拍干。

3.加酶：每孔加入酶标记液100μl，震荡混匀，封板，37℃温育10分钟，用洗涤工作 液洗板5次，拍干。

4.显色读值：每孔加入显色剂A、B液各50μl，混匀，封板，置37℃避光显色10分钟。 每孔加终止液50μl，混匀，10分钟内完成结果测定。单波长测定：可用空白对照凋零，在 酶标仪450nm波长下测定各孔的OD值；双波长检测：在酶标仪450nm/630nm波长下测定各孔 OD值。

阴性对照的OD值应<0.15。阳性对照的OD值应>0.80。

检验结果的解释：

1.临界值(Cutoff)计算：Cutoff＝阴性对照品OD值+0.2

2.检验结果的判断：

[样本的OD值]≤[Cutoff]为：TB-SA抗体阴性。

[样本的OD值]>[Cutoff]为：TB-SA抗体阳性。

本发明的有益效果是：本试剂盒在微孔板内包被TB-SA抗原，若待测样本中有TB-SA抗 体即可与之结合，再与酶标记抗体反应，形成“抗原-抗体-酶复合物”，酶催化显色剂显色， 根据显色程度可判断TB-SA抗体的有无。本发明灵敏度高、特异性强，因此，本发明不但减 少了假阳性或假阴性现象对临床诊断带来的干扰，使该试剂盒能够对结核分枝杆菌TB-SA抗 体进行快速、准确的检测，而且误差小、检测灵敏度高；该试剂盒制备方便，制备方法操作 简单，适宜于工业化大规模生产。

附图说明

图1为实施例1中样本不同反应时间的P/N曲线图；

图2为实施例1中酶标记液不同反应时间的P/N曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：

1.样本反应时间的确定

我们选择了不同抗体水平的阳性参考品和阴性参考品，按照确定的稀释比例，(请明确不 同抗体水平、阳性参考品、阴性参考品、确定的稀释比例)测定10min、20min、30min、45min 和1小时的结果，数次实验结果显示10min效果最佳，统计如表1所示：

表1：样本不同反应时间的结果差异

样本反应时间 阳性参考品平均值(P) 阴性参考品平均值(N) P/N 10min 1.40 0.148 9.40 20min 1.41 0.156 9.09 30min 1.44 0.162 8.89 45min 1.46 0.166 8.82 60min 1.50 0.173 8.63

2.酶标记液反应时间的确定

酶标记液中主要参与反应的物质为辣根过氧化物酶标SPA，SPA会特异性的结合到IgG上， 形成IgG-SPA-辣根过氧化物酶复合物链接在微孔板上，最终孔内辣根过氧化物酶标SPA与IgG 的含量呈正相关，所以适当提高酶的含量可以减少反应时间。我们测定了10min、20min、30min 结果，实验结果显示10min效果最佳，统计如表2所示：

表2：酶标记液不同反应时间的结果差异

样本反应时间 阳性参考品平均值(P) 阴性参考品平均值(N) P/N 10min 1.234 0.137 9.03 20min 1.308 0.147 8.91

30min 1.450 0.163 8.88

3.显色反应时间的确定

试剂盒使用的显色系统是当前通用的TMB显色系统，同类产品中显色时间基本在10min 和15min，我们设计10min的显色时间，确保在10min时显色呈线性关系，经过对pH值的调 整、主要反应成分过氧化脲和TMB的调整，使得在辣根过氧化物酶的催化作用下，10min显 色剂呈现良好的线性关系，R²达到0.99，完全满足定性产品的使用要求。显色反应时间为确 定为10min。

4.酶标记液浓度的确定

按照《酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则》的要求，测定不同酶浓度下的结果， 在确保阳性参考品和阴性参考品全部通过，并且阴性本底较低的前提下，阳性和阴性的比值 (P/N值)尽可能大，拉开区分效果。具体确定过程如下：

①按照工艺要求，包被好TB-SA包被板和其他组分液体。

②将辣根过氧化物酶标SPA作梯度稀释，如1:2万、1:3万、1:4万、1:5万、1:6万等。

③检测制备好的阴性参考品和阳性参考品，比较浓度不同的差异，以最符合上述要求的 定为最佳使用浓度。

数次测试结果显示，当前工艺使用酶标记液的浓度为1:4万～1:6万之间，但要求每批 按此方案调试，确定最佳酶浓度。

实施例2：结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，所述检测试剂盒由TB-SA抗原 包被板、样品稀释液、酶标记液、浓缩洗液、显色剂A液、显色剂B液、阴性对照品、阳性 对照品和终止液组成。规格及数量为：48T。

TB-SA抗原包被板为包被有TB-SA抗原的微孔板，TB-SA抗原用磷酸盐缓冲液稀释，其包 被浓度为0.01mg/ml。48孔×1块。

样品稀释液为含有吐温-20和蛋白的缓冲液。5ml×1瓶。

酶标记液为含辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A溶液。5ml×1瓶。

浓缩洗液为含吐温-20的缓冲液。25ml×1瓶。

显色剂A液为含有过氧化脲的溶液，3ml×1瓶。显色剂B液为含TMB的柠檬酸溶液，3ml ×1瓶。

阳性对照品为含TB-SA抗体阳性的血清溶液，1ml×1瓶。阴性对照品为含TB-SA抗体阴 性的血清溶液，1ml×1瓶。

终止液为含硫酸的溶液，3ml×1瓶。

储藏条件及有效期：试剂盒置2～8℃

上述结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒的制备方法，它包括以下步骤：

S1.TB-SA抗原包被板的制备：用磷酸盐缓冲液将TB-SA抗原稀释至包被浓度为0.01mg/ml， 将包被液包被于微孔板上，37℃干燥后保存；

S2.样品稀释液的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液500ml，加入酪蛋白5.00g，加入纯化 水搅拌至酪蛋白充分溶解；再加入3ml的吐温-20，混匀后加纯化水至1000ml，充分混匀， 保存；

S3.酶标记液的制备：用pH为10倍浓缩的磷酸盐缓冲液300ml，加纯化水至3000ml，将辣 根过氧化物酶标的葡萄球菌蛋白A稀释至1:4万～1:6万，保存；

S4.浓缩洗液的制备：称取氯化钠300g、磷酸氢二钠85g加入1000ml纯化水溶解后，再加 吐温-20 15ml，用纯化水加至1300ml，搅拌混匀后保存；

S5.对照品的制备

S51.阳性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0.15g、吐温 -20 0.35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阳性的 血清6.5ml，混匀后保存；

S52.阴性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0.15g、吐温 -20 0.35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阴性的 血清6.5ml，混匀后保存；

S6.显色液的制备：

S61.显色剂A液的制备：称取柠檬酸0.9g，过氧化脲0.1g，加纯化水100ml溶解后， 加纯化水至170ml，充分混匀后保存；

S62.显色剂B液的制备：用100ml纯化水将3g柠檬酸溶解后加入丙三醇17ml，混匀后 加入用3ml DMSO溶解的0.04g TMB，加纯化水至170ml，保存；

S7.终止液的制备：将纯化水150ml和量取的硫酸18ml混匀后加纯化水至180ml，保存。

实施例3：结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，所述检测试剂盒由TB-SA抗原 包被板、样品稀释液、酶标记液、浓缩洗液、显色剂A液、显色剂B液、阴性对照品、阳性 对照品和终止液组成。规格及数量为：96T。

TB-SA抗原包被板为包被有TB-SA抗原的微孔板，TB-SA抗原用磷酸盐缓冲液稀释，其包 被浓度为0.01mg/ml。96孔×1块。

样品稀释液为含有吐温-20和蛋白的缓冲液。10ml×1瓶。

酶标记液为含辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A溶液。10ml×1瓶。

浓缩洗液为含吐温-20的缓冲液。50ml×1瓶。

显色剂A液为含有过氧化脲的溶液，6ml×1瓶。显色剂B液为含TMB的柠檬酸溶液，6ml ×1瓶。

阳性对照品为含TB-SA抗体阳性的血清溶液，2ml×1瓶。阴性对照品为含TB-SA抗体阴 性的血清溶液，2ml×1瓶。

终止液为含硫酸的溶液，6ml×1瓶。

上述结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒的制备方法，它包括以下步骤：

S1.TB-SA抗原包被板的制备：用磷酸盐缓冲液将TB-SA抗原稀释至包被浓度为0.01mg/ml， 将包被液包被于微孔板上，37℃干燥后保存；

S2.样品稀释液的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液500ml，加入酪蛋白5.00g，加入纯化 水搅拌至酪蛋白充分溶解；再加入3ml的吐温-20，混匀后加纯化水至1000ml，充分混匀， 保存；

S3.酶标记液的制备：用pH为10倍浓缩的磷酸盐缓冲液300ml，加纯化水至3000ml，将辣 根过氧化物酶标的葡萄球菌蛋白A稀释至1:4万～1:6万，保存；

S4.浓缩洗液的制备：称取氯化钠300g、磷酸氢二钠85g加入1000ml纯化水溶解后，再加 吐温-20 15ml，用纯化水加至1300ml，搅拌混匀后保存；

S5.对照品的制备

S51.阳性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0.15g、吐温 -20 0.35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阳性的 血清6.5ml，混匀后保存；

S52.阴性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0.15g、吐温 -20 0.35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阴性的 血清6.5ml，混匀后保存；

S6.显色液的制备：

S61.显色剂A液的制备：称取柠檬酸0.9g，过氧化脲0.1g，加纯化水100ml溶解后， 加纯化水至170ml，充分混匀后保存；

S62.显色剂B液的制备：用100ml纯化水将3g柠檬酸溶解后加入丙三醇17ml，混匀后 加入用3ml DMSO溶解的0.04g TMB，加纯化水至170ml，保存；

S7.终止液的制备：将纯化水150ml和量取的硫酸18ml混匀后加纯化水至180ml，保存。

实施例4：本发明试剂盒的检测方法

1.储藏条件及有效期：

试剂盒置2-8℃保存，切勿冷冻，有效期12个月。使用后液体试剂密闭放回2-8℃保存， 未用完的微孔板条需要与干燥剂一起用自封袋密封2-8℃保存。

2.适用仪器：

温箱、具有单波长450nm或双波长450nm/630nm的酶标仪。

3.样本要求：本试剂盒检测样本为血清，分离的样本可在2-8℃保存下存储7天，长期 存储应置-20℃，避免反复冻融，冷藏或冷冻保存的样本使用前应平衡至室温，并充分混匀。

4.检测方法为：

(1)试剂准备：将试剂盒平衡至室温，用纯化水将浓缩洗液作1:20稀释，即配成洗涤工 作液备用。

(2)加样：将所需数量的TB-SA抗原包被板条固定于板架上，各孔加入100μl样本稀释 液，按序加入5μl待测样本；每次实验设空白对照(用双波长检测时可以不设空白对照)、 阴性对照、阳性对照各2孔，分别加入样本稀释液、阴性对照品、阳性对照品各100μl/孔； 震荡混匀，封板，37℃温育10分钟，用洗涤工作液洗板5次，拍干。

(3)加酶：每孔加入酶标记液100μl，震荡混匀，封板，37℃温育10分钟，用洗涤工 作液洗板5次，拍干。

(4)显色读值：每孔加入显色剂A、B液各50μl，混匀，封板，置37℃避光显色10分 钟。每孔加终止液50μl，混匀，10分钟内完成结果测定。单波长测定：可用空白对照凋零， 在酶标仪450nm波长下测定各孔的OD值；双波长检测：在酶标仪450nm/630nm波长下测定各 孔OD值。

阴性对照的OD值应<0.15。阳性对照的OD值应>0.80。

检验结果的解释：

1.临界值(Cutoff)计算：Cutoff＝阴性对照品OD值+0.2

2.检验结果的判断：

[样本的OD值]≤[Cutoff]为：TB-SA抗体阴性。

[样本的OD值]>[Cutoff]为：TB-SA抗体阳性。

5.性能指标：

(1)符合率：使用企业参考品进行检测，其中阳性参考品和阴性参考品符合率为100％。

(2)精密度：试验内不精密度<15％；试验间不精密度<15％。

(3)常见药物、病理状态和内源性物质干扰：

A.下列药物在2.5倍治疗水平不影响检测结果：利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、链霉素、 阿米卡星、青霉素、头孢曲松、红霉素、地高辛、心痛定、雷尼替丁、呋塞米、利多卡因、 酮康唑、甲基强的松龙、强的松。

B.下列情况对于检测结果无干扰：轻度溶血、血甘油三酯升高(>980mg/dL)、血糖升 高(>11.1mmol/L)、胆红素升高(>6.3mg/ml)、注射流感疫苗、HBV阳性、HCV阳性、HIV 阳性、类风湿因子阳性、肺炎、肺癌等。