一种桑黄菌子实体菌丝分离方法

摘要

本发明公开了一种桑黄菌子实体菌丝分离方法，将完整的桑黄菌子实体放入培养瓶中，加入液体浸没，然后煮沸并保持5-20秒，再在25-37℃培养8-72小时，重复前述步骤的煮沸、培养过程多次后，桑黄菌子实体上长出菌丝，可进行菌丝分离。与传统的组织分离法相比，本发明具有原材料易得、制备方便，无需专用设备，操作中染杂率低，成功率高，菌丝生长快，培养时间短等特点，非常适合桑黄菌子实体菌丝野外分离操作。

说明书

技术领域  

本发明涉及一种子实体菌丝分离方法，尤其是涉及一种桑黄菌子实体菌丝分离方法，属于药用菌菌种分离领域。

背景技术  

桑黄属担子菌亚门(Basidiomycotas)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochae taceae)、针层孔菌属 (Phellinus Quel.)，因其子实体颜色鲜黄而俗称为桑黄，是珍稀药用真菌。桑黄是目前国际公认的抗肿瘤最好的大型真菌之一，无任何毒性作用，是一种极具开发价值的珍贵药用真菌。由于野生桑黄菌的资源有限，人们就开始了人工培养，但无论是人工栽培还是液体发酵菌丝体生产，获得高品质的优良菌菌丝体是关键。目前，在实际的桑黄菌规模化生产的菌种分离和筛选过程中，桑黄菌纯菌丝的分离多半采用常规的组织分离法，如：CN200710018319.7所公开的“取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质，用75%酒精擦洗固体外表面数次，再在0.5%甲硝唑溶液里浸泡5-10分钟进行消毒，再将己处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用己灭菌的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面”。其关键就是要对子实体进行化学药剂的消毒，由于桑黄菌子实体十分坚硬，且木质化，使得对桑黄菌子实体的消毒、组织取块操作十分繁琐，并不易消毒彻底，使得用传统的组织分离法从桑黄菌子实体获得菌丝的杂菌污染率非常高，成功率非常低，且重复工作量大。

发明内容  

本发明的目的是针对以上问题，提供一种桑黄菌子实体菌丝分离方法，通过该方法可以方便、有效地从桑黄菌子实体获得其菌丝。

    为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种桑黄菌子实体菌丝分离方法，具体步骤为：

将完整的桑黄菌子实体放入培养瓶中，加入液体浸没，然后煮沸并保持5-20秒，再在25-37℃培养8-72小时，重复前述步骤的煮沸、培养多次后，桑黄菌子实体上长出菌丝，可进行菌丝分离。

所述培养瓶为广口瓶，加热煮沸前用3层报纸严密包扎瓶口；桑黄菌子实体一般较大，采用广口瓶方便取放桑黄菌子实体和分离菌丝。

所述的液体为自来水、蒸馏水、纯净水、土豆汁或豆芽汁中的一种。

优选的方案中，所述煮沸时间为10-20秒。可充分杀死桑黄菌子实体表面的微生物，但不会杀死桑黄菌子实体内部要分离的菌丝。

进一步地，所述煮沸时间为15秒。

所述煮沸、培养过程共进行四次，其中前三次的培养温度为35℃-37℃，培养时间为8-24小时，最后一次的培养温度为25℃-28℃，培养时间为48-72小时。

进一步地，前三次的培养时间为8-12小时，最后一次的培养时间为60-72小时。

本发明的有益效果为：

1、由于桑黄菌子实体十分坚硬，且木质化明显，组织取块麻烦，且不易消毒彻底，用传统的组织分离法从桑黄菌子实体获得菌丝的杂菌污染率非常高，采用短时间反复的煮沸、培养的方式，能够很好的将桑黄菌子实体表面及浅层的杂菌杀死，并有效地保护了桑黄菌子实体内部的组织的活性；

2、原材料，如所用的液体易得、制备方便；

3、相比传统的分离方法，无需使用超净工作台和高压灭菌锅等设备，非常适合桑黄菌子实体菌丝野外分离操作；特别是无条件进行实验室分离时。

4、本发明的方法简单，操作中染杂率低，成功率高。

    5、由于经过多次反复加热煮沸，桑黄菌子实体中的营养物质溶入液体中，使得后期培养的桑黄菌菌丝较传统方式分离的菌丝生长快，培养时间短。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但实施例仅在于说明本发明，而不是对其进行限制。

实施例1 ：

取完整的桑黄菌子实体（半径3-4cm、厚2-3cm）放入广口培养瓶（口径7.5cm、高12cm）中，加入120ml自来水，然后用3层报纸严密包扎瓶口，加热培养瓶至水沸腾，并保持10秒钟，冷却后，在35-37℃条件下培养8-12小时，取出，再重复前述煮沸、培养2次；最后在第4次煮沸10秒钟，冷却后，在25-28℃条件下培养72小时即在桑黄菌子实体上长出1cm菌丝，这时就可取出进行菌丝分离了。

实施例2 ：

将完整的桑黄菌子实体（半径3-4cm、厚2-3cm）放入广口培养瓶（口径7.5cm、高12cm）中，加入纯净水，使其没过桑黄菌子实体，用3层报纸严密包扎瓶口，然后煮沸，并保持5-15秒，再在30-37℃培养12-18小时，重复前述步骤的煮沸、培养2次后，最后煮沸10秒钟，冷却后，在25-28℃条件下培养48小时，即在桑黄菌子实体上长出约0.5cm的菌丝，可进行菌丝分离。

实施例3：

将完整的桑黄菌子实体（半径3-4cm、厚2-3cm）放入广口培养瓶（口径7.5cm、高12cm）中，加入蒸馏水浸没，用3层报纸严密包扎瓶口，然后煮沸并保持15-20秒钟，再在32-35℃培养18-24个小时，重复前述步骤的煮沸、培养2次后，最后煮沸15秒钟，冷却后，在25-30℃条件下培养60小时，即在桑黄菌子实体上长出约0.8cm的菌丝，可进行菌丝分离。

实施例4：

取土豆一个（约200g），去皮，切块，加水1000ml，煮沸20分钟，纱布过滤，滤液即为土豆汁，备用。

取完整的桑黄菌子实体（半径3-4cm、厚2-3cm）放入广口培养瓶（口径7.5cm、高12cm）中，加入120ml左右的土豆汁，然后用3层报纸严密包扎瓶口，再加热瓶中土豆汁至沸腾，并保持15秒钟，冷却后，在37℃条件下培养8小时，取出，再加热瓶中土豆汁至沸腾，并保持15秒钟，冷却后，在37℃条件下培养8小时，共煮沸、培养3次后，最后第4次煮沸10秒钟，冷却后，在28℃条件下培养48小时，即在桑黄菌子实体上长出约0.5cm菌丝，这时就可取出进行菌丝分离了。

实施例5 ：

取新鲜黄豆芽（约200g），加水1000ml，煮沸20分钟，纱布过滤，滤液即为豆芽汁，备用。

取完整的桑黄菌子实体（半径3-4cm、厚2-3cm）放入广口培养瓶（口径7.5cm、高12cm）中，加入豆芽汁，豆芽汁的加入量以没过桑黄菌子实体为宜，然后用3层报纸严密包扎瓶口，加热瓶中豆芽汁至沸腾，并保持20秒钟，冷却后，在37℃条件下培养12小时，取出，再加热瓶中豆芽汁至沸腾，并保持15秒钟，冷却后，在37℃条件下培养12小时，取出，再加热瓶中豆芽汁至沸腾，并保持10秒钟，冷却后，在37℃条件下培养8小时；第4次煮沸10秒钟，冷却后，在25℃条件下培养70小时，即在桑黄菌子实体上长出约1cm菌丝，这时就可取出进行菌丝分离了。

具体操作中，使用的培养瓶可根据需要进行调整。