公开/公告号CN104628834A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-05-20
原文格式PDF
申请/专利号CN201510037101.0
申请日2015-01-23
分类号C07K14/35;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;G01N33/68;G01N33/577;A61K39/04;A61P31/04;C12R1/32;
代理机构
代理人
地址 102206 北京市昌平区流字5号
入库时间 2023-12-18 08:44:53
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-03-23
授权
授权
2015-06-17
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K14/35 申请日:20150123
实质审查的生效
2015-05-20
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种结核感染特异T细胞免疫检测抗原及其应用。具体地说就 是一种结核分枝杆菌抗原及其表位肽组合物,用于结核感染细胞免疫检测,属于 结核病检测领域。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的人畜共患的慢性传染病。根据世界卫生 组织的统计,目前全球有超过1/3的人口感染了结核分枝杆菌,每年有200万人 因结核病死亡。我国是全球22个结核病流行严重的国家之一、同时也是全球27 个耐多药结核病流行严重的国家之一。我国第五次结核病流行病学抽样调查报告 显示,中国结核病年新发病人数约为130万,占全球发病人数的14.3%,位居全 球第二位;15岁及以上人群肺结核的患病率为459/10万。结核分枝杆菌除感染 人外,还感染50多种哺乳动物和20多种禽类;易感性因动物种类和个体不同而 异,家畜中牛是最敏感动物。结核病的流行不仅影响养殖业的发展,更重要的是 由于交叉感染,而使人类的健康受到严重威胁。因此,结核病已经成为一个严重 的社会经济问题,对我国公民健康、社会安定和经济发展带来严重的危害。
结核病的早期诊断对结核病的控制至关重要,而结核病防治的最大挑战之一 就是缺乏早期、快速、敏感和特异的诊断工具。目前所采用的结核感染的诊断方 法仍然存在着较大的局限性。经典的结核菌素试验(TST)用于结核病诊断虽然 已达一个世纪,但其受卡介苗接种和大多数非结核分枝杆菌感染的干扰,特异性 和敏感性均不理想;细菌学培养作为诊断的金标准用于结核病也存在着培养周期 过长、阳性率较低、且依赖于标本采集质量等问题;而影像学、血清学等方法, 因为较高的假阴性或假阳性,用于结核病诊断的参考价值受限。现有结核病检测 试剂灵敏度、特异度均有待提高。
抗结核病的保护性免疫机制目前仍不完全清楚,细胞免疫尤其是循环及感染 部位的T淋巴细胞应答被认为起着重要作用。因此能否有效地激发机体的T细 胞,尤其是CD4+T细胞免疫反应是机体成功对抗结核感染的关键。被病原菌致 敏的T淋巴细胞,再次受到同种抗原刺激后会释放γ干扰素,高水平的γ干扰素 反应可以提示该病原菌的感染。近年来,随着免疫学和基因组学的发展,出现了 以T细胞为基础的体外γ干扰素反应测定法(IGRA),可用于结核病辅助诊断和 结核感染筛查。目前已经有以结核分枝杆菌基因组RD1区编码的结核特异性抗 原ESAT-6和CFP-10为刺激物的商品化IGRA试剂,如QuantiFERON-TB Gold test 和T-SPOT.TBtest,用于检测外周血中结核特异性释放γ干扰素的T淋巴细胞, 呈现较高的灵敏性和特异性。
抗原表位是多肽抗原的一部分,是抗原性的核心基础;抗原通过抗原表位与 相应的淋巴细胞表面受体结合从而致敏淋巴细胞、引起免疫应答,即免疫反应的 特异性是针对抗原表位,而不是针对整个抗原,抗原表位在抗原诱导免疫应答的 过程中起着决定性作用。
基于T细胞分泌γ干扰素的体外检测技术,主要以完整抗原作为相应的刺激 源,抗原成分组成较为复杂、灵敏度和特异性有待提高,且相应试剂由于国外公 司的专利保护,使得我国在引进相关产品应用时成本较高,不适合目前情况下在 我国大范围应用。本发明是在国家传染病重大专项资助下,对结核菌蛋白抗原及 其表位充分分析、验证和比较研究的基础上产生,拥有完全的自主知识产权,基 于本发明的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测与感染筛查等 相关领域。
发明内容
本发明在现有的T细胞γ干扰素释放试验技术的基础上,应用RD1区基因 Rv3873所编码的Rv3873抗原和/或其所包含的抗原表位肽,形成一个抗原表位 肽组合物,并结合ELISA方法对结核病例和健康志愿者体内结核感染特异性T 细胞进行检测,从而评价该抗原表位肽组合物用于结核检测的灵敏度和特异性。
Rv3873基因作为分枝杆菌核心基因组中的基因在分枝杆菌属中高度保守, 其表达产物具有较高的T细胞免疫原性;且Rv3873抗原存在于致病性结核分枝 杆菌中,而卡介苗(BCG)及绝大多数非结核分枝杆菌中均缺失该多肽抗原。本 发明验证了Rv3873抗原亦可用于结核感染特异性检测,且使用相应的抗原表位 肽替代完整的多肽抗原作为检测标志物,提供了一种抗原衍生的表位肽库组合 物,并将这种抗原衍生表位肽库应用于结核病例及健康志愿者的检测中。
本发明的第一方面提供了一种用于结核感染细胞免疫检测的抗原组合物,由 结核分枝杆菌Rv3873抗原和/或其衍生的抗原表位肽组成。
所述结核分枝杆菌抗原Rv3873氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述结核分枝杆菌Rv3873抗原衍生的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2~59中的1种或多种。
组合物中的表位肽可以是上述表位肽的氨基酸序列经过取代、缺失或添加1 个或几个氨基酸且具有相同抗原性的衍生表位肽或其类似物。
在一个优选的实施方案中,抗原组合物由结核分枝杆菌Rv3873抗原及其包 含的全部抗原表位肽组成。
在另一个优选的实施方案中,抗原组合物由结核分枝杆菌Rv3873抗原包含 的全部抗原表位肽组成。
在最优选的实施方案中,抗原组合物由氨基酸序列为SEQ ID NO:2~59所示 的抗原表位肽组成。
本发明还提供了编码所述抗原组合物的DNA分子,以及含有该DNA分子 的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌。
本发明的第二方面提供了所述抗原组合物在制备用于体外检测结核感染引 起的特异性T细胞免疫反应的检测试剂中的应用,其特征在于人或动物的淋巴 细胞经过所述抗原组合物的刺激后,检测结核特异性T细胞分泌的细胞因子。
在特定的实施方案中,所述结核特异性T细胞分泌的细胞因子选自γ干扰素 (IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α),优选IFN-γ;所述 结核特异性T细胞分泌的细胞因子的检测方法选自酶联免疫斑点试验 (ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试验、细胞因子内染色和 T细胞增殖试验,优选ELISA;所述淋巴细胞来源于外周血、脑脊液、胸水或腹 水,优选外周血。
本发明还提供了所述抗原组合物在制备结核检测试剂中的应用,并提供了一 种结核检测试剂盒,其基本组成如下:
本发明的抗原组合物;
抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体(一抗);
酶标试剂:辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的的另一种小 鼠IgG单克隆抗体(二抗);
校准品:含IFN-γ的阳性原料;
培养管:测试培养管中含人工合成的抗原组合物,阳性对照培养管中含结核 非特异性刺激抗原,本底对照培养管中含基质液;
其他ELISA检测所需试剂及耗材。
优选地,一抗固定在反应板上。
本发明采用的是双抗体夹心原理检测抗原的ELISA检测方法。基本过程为: 反应板上包被的一抗捕捉样本中的IFN-γ,而同一IFN-γ分子进而又被酶标的二 抗捕获、显色。虽然反应板上固定的一抗和酶标的二抗均为IFN-γ单克隆抗体, 但这两种抗体为识别IFN-γ上不同的抗原表位的单克隆抗体,因此不会相互影 响。
本发明的第三方面提供了一种结核疫苗候选材料,其特征在于含有所述的抗 原及其表位多肽组合物、DNA分子、重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或 重组菌。
本发明相对于现有技术有以下优点:本发明组合了能被T细胞识别的结核 分枝杆菌特异抗原Rv3873的表位肽抗原,与以往采用完整抗原的检测手段相比, 能够减少由于冗余的非表位识别区域对特异性T细胞造成的干扰,从而提高检 测灵敏度;另一方面由于组合了多个敏感的抗原表位序列,单检测孔的反应强度 明显增加,与单一的完整抗原相比检测结果的判断更加容易;第三,本发明中所 采用的全部衍生表位肽均已被研究证明能够刺激机体产生较强的T细胞免疫反 应,因此当使用上述表位肽作为刺激物进行体外T细胞γ干扰素释放试验时,检 测结果真实可靠;第四,人工合成的氨基酸表位作为检测试剂,可以人为地调整 各表位的混合浓度进而增强检测反应的强度;第五,采用固相合成的方法合成抗 原表位肽,有利于质量控制,且成本较低,适合大规模商业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条 件。
实施例1抗原表位肽组合物的构成
用于结核检测的抗原表位肽组合物由Rv3873抗原衍生的表位肽构成。所述 抗原Rv3873的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述Rv3873抗原衍生的表位 肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2~59所示。
实施例2抗原表位肽组合物应用于检测试剂盒的开发
本发明的抗原表位肽组合物可用于结核感染的检测,形成临床或实验室诊断 用试剂盒。
检测试剂盒包括:
1)实施例1中所述的抗原表位肽组合物;
2)抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体(一抗),所述一抗固定于反应板 上;
3)酶标试剂:辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠 IgG单克隆抗体(二抗);
4)校准品:含IFN-γ的阳性原料;
5)培养管:测试培养管中含人工合成的多种抗原衍生的表位多肽,阳性对照培 养管中含结核非特异性刺激抗原,本底对照培养管中含基质液
6)其他ELISA检测所需试剂及耗材。
实施例3抗原表位多肽应用于结核感染临床检测
A.外周血淋巴细胞的分离:
本发明所涉及志愿者病例的筛选标准为:
根据卫生部发布的《肺结核诊断标准》国家标准(WS288-2008),临床表现 症状、体征及胸部影像学检查诊断为肺结核的患者,其中细菌学阳性或阴性结核 病患者是指临床诊断为结核病的患者中,经细菌学检查(痰涂片抗酸染色显微镜 检查和/或罗氏固体培养基细菌固体培养)阳性或阴性的结核病患者;以及肺外 结核(如骨结核、肾结核、肠结核、淋巴结核等)患者。
健康志愿者的筛选标准为:
无结核临床症状、无其他疾病或感染。
入选的结核病患者为自到结核病院就诊的连续时间样本中随机选取;志愿者 为健康的在校学生;结核病患者和志愿者年龄在18~60岁之间。
本发明所用的T淋巴细胞来自个体的外周静脉血。试验开始前,由试验者 告知志愿者/结核病患者具体项目的目的、意义、试验流程及所需采集标本及其 数量,经同意并签署知情同意书,由临床检验师对其进行采血。最终本项目筛选 了138例结核病志愿者及32例健康志愿者,采血时使用无内毒素的肝素抗凝真 空采血管采集新鲜全血,每名志愿者采血约20ml。之后:
1)在2小时之内将全血标本轻柔颠倒混匀3~5次后分装到不同的培养管 中(空白对照管、样本培养管、阳性对照管),1ml/管。
2)将培养管轻柔颠倒混匀迅速放入37℃培养箱培养22±2小时,培养过程 中保持培养馆直立。
3)培养后的全血以3000~5000转/分钟离心10分钟,取血浆进行ELISA 检测。注意不可吸到细胞层。
B.抗原表位肽的制备
以固相合成的方法化学合成抗原表位肽。将各合成肽以DMSO溶解。之后 按实施例1中SEQ ID NO:2~59共计58条表位肽等摩尔混合,形成抗原表位肽 库(Rv3873);表位肽库用含10%胎牛血清的RPIM1640培养基稀释至终浓度。
C.ELISA检测抗原表位肽库特异性T细胞
ELISA板提前12小时以上用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释的抗人IFN-γ的 小鼠IgG单克隆抗体包被,4℃平放,在加入检测样品前用含10%胎牛血清的 RPIM1640培养基室温条件下封闭1小时。
分别在加样孔中加入稀释液20μl(空白对照孔除外),然后再加入待测样品 50μl(空白对照孔除外),每个表位肽库刺激设双孔,另设阳性对照孔、本底对 照孔;校准品梯度稀释后各加双孔检测。
用封板膜封板后,置于37℃培养箱温育60分钟(温育后保留微孔内液体, 不洗涤)。
D.ELISA洗板及结果获取:
1)每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外,轻轻震荡混匀。
2)用封板膜封板后,置于37℃培养箱温育60分钟。
3)小心揭掉封板膜,用洗板机洗涤5遍,最后一次尽量扣干。
4)显色:每孔加显色液后轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。
5)每孔加终止液50μl,轻轻震荡混匀,10分钟内用酶标仪波长为 450nm/600-650nm检测。
以校准品的抗原含量及其对应的吸光度均值做乘幂拟合曲线即标准曲线,求 出线性回归方程,将空白对照管(N)、样本培养管(T)、阳性对照管(P)三种 培养管培养后血浆标本的吸光度值分别代入回归方程,求得三种管中血浆标本相 应的IFN-γ含量。
E.结果分析:
本研究中共涉及经过严格按照标准筛选的结核病患者共计138例、健康志愿 者32例。
现有的基于IGRA原理进行结核分枝杆菌感染检测的主要抗原是结核分枝 杆菌RD1区域基因所编码的ESAT-6和CFP-10抗原。本发明使用抗原表位肽库 (Rv3873)检测138例结核病人,其中91例呈阳性反应,检测灵敏度为65.94%: 检测32例健康志愿者,其中27例呈阴性反应,特异性为84.38%(如表1所示)。
表1.各抗原表位多肽库检测特异性和灵敏度统计
注:检测灵敏度表示为:(结核病患者检测阳性数/结核病患者总数)×100%;检测特异性表示为:(1-健康志 愿者检测阳性数/健康志愿者总数)×100%。
因此应用本发明中的抗原表位多肽库(Rv3873)在结核病例的检测中呈现 较高的灵敏度和特异性。
阳性反应判断标准:测试培养管(T)含量值=T、本底对照培养管(N)含 量值=N、阳性对照培养管(P)含量值=P。(如表2所示)
表2.阳性反应判断标准
机译: 通过比较ESAT-6的T细胞抗原性和表位来诊断最近的肺结核感染
机译: 分离的多肽,融合蛋白,核酸序列,表达载体或病毒,重组细胞,产生可溶性胞外域多肽或融合蛋白或其片段的方法,药物组合物,单克隆抗体或其多克隆或抗原结合片段的用途,使用抗体或抗原结合片段,使用任何分离的多肽,调节细胞因子的方法,诱导t细胞扩增,促进细胞免疫抗原特异性t并促进cd4 +和/或cd8 + t细胞活化受试者,在患者中增强继发于抗原的免疫应答的方法,使用以下至少一种的方法:分离的多肽,用于治疗或预防与免疫系统有关的病症的方法,用于治疗或预防传染病的方法,用于诊断受试者疾病的方法,产生可溶性胞外域多肽tmem25,vsig10,ly6g6f或其融合蛋白或片段的方法
机译: 诱导人类患者针对至少一种抗原的记忆性T细胞免疫应答的方法,包含表达分枝杆菌ag85a基因翻译产物的非复制或复制匹配的强毒感染病毒载体的免疫原性组合物的用途,通过诱导中枢记忆t细胞免疫应答和载体疫苗生产用于治疗患者疾病的药物中的抗原