一种由肝素钠粗品生产依诺肝素钠的方法

摘要

本发明公开了一种由肝素钠粗品生产依诺肝素钠的方法。该方法以肝素钠粗品为原料，采用盐解工艺进行预处理，然后经氧化、离子交换树脂吸附、洗涤、洗脱，最后经超滤、冻干得肝素钠精品，肝素钠精品再经成盐、酯化、解聚、氧化、醇沉、冻干处理得到依诺肝素钠。发明优点在于从源头和工艺来控制依诺肝素钠质量，生产周期短、生产能耗低、产品质量高，适合于大规模的工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于生化原料药生产技术领域，具体涉及一种由肝素钠粗品生产依诺肝素钠的方法。

背景技术

依诺肝素钠是一种低分子肝素钠盐，通过对猪肠粘膜来源的肝素的苄基酯衍生物进行碱解聚而获得。由一系列未能完全定性的复杂寡糖组成，非还原端主要由4-烯醇式吡哺糖醛酸组成，15％～25％的组分在还原端包含有1，6-脱水衍生物结构。其重均分子量为3800～5000。按干燥品计算，抗Xa因子活性效价为90IU/mg～125IU/mg，抗IIa因子效价为20.0IU/mg～35.0IU/mg，抗Xa因子效价与抗IIa因子效价比为3.3～5.3。依诺肝素钠的抗凝作用与天然肝素相当或更优，而出血的发生比应用天然肝素更少，加之生物利用度高，因而备受临床青睐。目前依诺肝素钠已用于预防静脉栓塞性疾病(防止静脉内血栓形成)，特别是与某些手术有关的栓塞；治疗深静脉栓塞，伴或不伴有肺栓塞；治疗不稳定性心绞痛及非Q波心梗，与阿司匹林同用；用于血液透析体外循环中，防止血栓形成等。

目前国内外对依诺肝素钠的制备方法较多，大多采用直接从肝素钠通过成盐、酯化、氧化、超滤、干燥等步骤获得[CN102050888B、CN 103342761A]。在生产过程中，肝素钠的质量对依诺肝素钠终产品有很大影响。这是因为肝素钠分子结构异常复杂，分子量难以固定，不同工艺来源的肝素钠直接影响依诺肝素的产品质量。依诺肝素钠的结构与组成比较复杂，在结构确认和质量标准控制上存在一定的不确定性，因而起始原料和生产过程的研究与控制就必须严格，且原料对后期依诺肝素钠成品的分子量分布有直接影响。因此开发从肝素钠粗品直接生产依诺肝素钠的新工艺可以从源头和工艺控制原料质量，更有效保证产品质量。在此前提下，尽可能降低能耗、减少环保压力仍是本领域技术人员需要解决的问题。CN102603925B提供一种由肝素钠粗品直接生产依诺肝素钠的方法，肝素钠粗品先经醇沉、氧化、醇沉得到沉淀物，此沉淀物用于制备依诺肝素钠；该沉淀物经成盐、酯化、降解、树脂、氧化、醇沉，最后溶解过滤、喷雾干燥得依诺肝素钠成品。该方法中的肝素钠除杂步骤仅依靠有机溶剂的使用和采用氧 化，不利于获得高质量的终产品；由肝素钠沉淀物制备依诺肝素钠时，在醇沉步骤即可去除硫酸根，而专利中使用树脂去除硫酸根，步骤繁琐。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种从肝素钠粗品直接生产依诺肝素钠的制备工艺，生产周期短、生产耗能低、产品质量高的制备方法。本发明以肝素钠粗品为原料，采用盐解工艺进行预处理，然后加入过氧化氢，经离子交换树脂吸附、洗涤、洗脱，最后经超滤、冻干得肝素钠精品，肝素钠精品再经成盐、酯化、解聚、氧化、醇沉、冻干处理得到依诺肝素钠。工艺简单易行，适于工业化规模生产。

下面对本发明方法进行以下具体描述：

一种由肝素钠粗品生产依诺肝素钠的方法，该方法包括以下步骤：

1)肝素钠精品的制备：肝素钠粗品用纯化水溶解后加入氯化钠，同时调节pH值为8.5～9.0，进行盐解，盐解液离心，得肝素钠预处理液；所得肝素钠预处理液温度降至28～32℃，加入双氧水，然后加至强碱型阴离子交换树脂柱中吸附、洗涤、洗脱，收集肝素钠洗脱液；洗脱液调节pH值至5.5～6.0后经超滤、冻干得到肝素钠精品；

2)成盐：将肝素钠精品溶于纯化水制成肝素钠精品水溶液，将苄索氯铵溶于纯化水制成苄索氯铵水溶液，将两种溶液以1∶2～3∶4的体积比混合后在室温进行反应，反应结束后离心，洗涤沉淀物、干燥得肝素季铵盐；

3)酯化：将肝素季铵盐用二氯甲烷溶解后加入氯化苄，在30～35℃下进行酯化，酯化结束后冷却至室温，加入甲醇沉淀，分离沉淀并用甲醇洗涤、干燥得肝素苄酯；

4)解聚：肝素苄酯用水溶解，向溶液中加入氢氧化钠，在50～60℃下进行解聚反应，反应结束加入甲醇沉淀，分离沉淀得肝素解聚产物；

5)氧化：肝素解聚产物用纯化水溶解，调节pH为8.5～10.0，加入双氧水进行氧化脱色；

6)醇沉、冻干：将氧化脱色后的溶液用甲醇沉淀，分离沉淀，沉淀用纯化水溶解后冻干得依诺肝素。

其中步骤1)中所述纯化水，纯化水加入体积和肝素钠粗品重量的比为8～10ml/g；所述氯化钠加入量和纯化水用量体积的比为1/100～2/100g/ml；盐解温度为50℃～60℃，盐解时间为2～3小时。

其中步骤1)中所述双氧水，加入量为肝素钠预处理液体积的1％～2％，为体积与体积比。

其中步骤1)中所述强碱型阴离子交换树脂为OC1074或FPA-98。

其中步骤1)中所述吸附，吸附速度为每小时0.05～0.06倍树脂柱体积(0.05～0.06BV/h)；所述洗涤，洗涤所用溶液为5.5％～6.0％的氯化钠溶液，洗涤速度为每小时0.5倍树脂柱体积(0.5BV/h)；所述洗脱，洗脱所用溶液为12％的氯化钠溶液，洗脱速度为每小时0.05～0.06倍树脂柱体积(0.05-0.06BV/h)。

其中步骤2)中所述肝素钠精品水溶液是按每克肝素钠精品加入10-12ml纯化水溶解所得，苄索氯铵水溶液是按每克苄索氯铵加入8～10ml纯化水溶解所得；成盐反应时间为1～2小时。

其中步骤2)中所述干燥为减压干燥，温度50℃～55℃，真空度为-0.1～-0.09Mpa，干燥时间40～60小时。

其中步骤3)中二氯甲烷用量为每克肝素季铵盐加入3～5毫升二氯甲烷，氯化苄加入量为每克肝素季铵盐加入1毫升氯化苄；酯化时间为25～30小时；所述干燥是指干燥温度为40℃～45℃的减压干燥，真空度为-0.1～-0.09Mpa，干燥时间10小时～15小时。

其中步骤4)中所述肝素苄酯用20倍水溶解，即按每克肝素苄酯加入20ml水溶解，氢氧化钠用量为肝素苄酯重量的8～10％，解聚时间为1～1.5小时。

其中步骤5)中所述双氧水用量体积为纯化水体积的1％～1.5％。

其中步骤6)中加入甲醇在溶液中浓度为75％～80％。

本发明以肝素钠粗品为原料，首先通过步骤1)得到肝素钠精品。肝素钠粗品通过盐解使蛋白和肝素钠分离，并离心去除杂质。获得的肝素钠预处理液中加入1％～2％的双氧水，在树脂吸附时同时氧化，在树脂纯化时同时脱色。在离子交换时采用梯度洗脱工艺，可以除去蛋白质、核酸、类肝素等杂质，且一步完成除杂脱色。与现有肝素钠精制工艺比较，可免除多次氧化、多次醇沉步骤，耗能低，不使用有机溶剂，经济环保。制备得到的肝素钠精品进一步用于依诺肝素钠的生产，可以有效保证依诺肝素钠的产品质量。

在从肝素钠精品制备依诺肝素钠的工艺部分，经成盐、酯化、解聚得到肝素解聚物后，只需一次氧化、醇沉，冻干即可得到依诺肝素钠，产品质量符合欧洲药典标准和美国药典标准。

本发明具有的有益效果：

1、肝素钠精品制备工艺简洁。离子交换步骤中，肝素钠预处理液中加入双氧水，在树脂吸附时同时氧化，在树脂纯化时同时脱色；在离子交换时采用梯度洗脱工艺，可以除去蛋白质、核酸、类肝素等杂质，且一步完成除杂脱色。与现有工艺比较，减少了多次氧化、多次醇沉步骤，耗能低，不使用有机溶剂，具有重要的经济价值。

2、制备得到的肝素钠精品进一步用于依诺肝素钠的生产，可以有效保证依诺肝素钠的产品质量。

3、由该肝素钠精品制备依诺肝素钠的工艺也相应简洁。得到肝素解聚产物后，只需一次氧化、醇沉，冻干即可得依诺肝素钠。

4、制备得到的依诺肝素钠产品质量符合欧洲药典和美国药典标准。

5、本发明以肝素钠粗品为原料，得到肝素钠精品，再用于生产依诺肝素钠，整个制备工艺简洁，生产周期短，且能从源头和工艺有效保证依诺肝素钠的产品质量。

具体实施例

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制，所有基于本发明的思路作出的修改和变化都应归于本发明的保护范围。

本发明所使用的肝素钠粗品为华北制药华坤河北生物技术有限公司所制；双 氧水(市售，30％含量)、氢氧化钠、氯化钠、苄索氯铵、二氯甲烷、氯化苄、甲醇、乙醇等为市售；离子交换树脂OC1074为德国朗盛公司产品、FPA-98为美国罗门哈斯产品。

实施例1

取肝素钠粗品1公斤，用8L纯化水溶解，加入80g氯化钠，升高温度至50℃，同时用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为8.5，在此条件下盐解2小时，盐解液离心得肝素钠预处理液。将肝素钠预处理液温度降至28℃，加入双氧水，其体积为肝素钠预处理液的1％，搅拌均匀后加至装有15L OC1074树脂的树脂柱中进行吸附，控制吸附速度为0.05BV/h，吸附完毕后的树脂先用5.5％氯化钠溶液洗涤，流速0.5BV/h，洗涤至吸光度A_260nm≤0.20、A_280nm≤0.20时，用12％氯化钠溶液洗脱，洗脱速度0.05BV/h，检测下柱液折光，当折光大于5.5时开始收集洗脱液，约收集1BV。收集的洗脱液用2mol/L盐酸溶液调节pH为5.5，经超滤、冻干得肝素钠精品340g。肝素钠精品用10倍水(3.4L)溶解后与苄索氯铵水溶液(680g溶于6.8L水)混合，室温进行反应1小时，反应结束后离心，用水洗涤沉淀物，然后干燥得肝素季铵盐1020g(控制干燥温度55℃，真空度-0.1Mpa，干燥时间40小时)；肝素季铵盐用3倍(3060ml)二氯甲烷溶解后加入1020ml氯化苄，在30℃下进行酯化，酯化25小时后结束，冷却至室温，加入甲醇沉淀，分离沉淀并用甲醇洗涤，干燥得肝素苄酯(控制干燥温度为40℃，真空度-0.092Mpa，干燥时间15小时)；肝素苄酯用20倍水溶解，加入肝素苄酯重量8％的氢氧化钠，50℃下进行解聚反应1.5小时，反应结束加入甲醇沉淀，分离沉淀为肝素解聚产物；肝素解聚产物用纯化水溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为8.5，加入1％双氧水进行氧化脱色；将氧化脱色后的溶液用甲醇沉淀，所加入甲醇的量为使甲醇在溶液中浓度为75％，分离沉淀，沉淀用纯化水溶解后冻干得依诺肝素钠253.2g。其检测结果见表1。

实施例2

取肝素钠粗品1公斤，用10L纯化水溶解，加入200g氯化钠，升高温度至60℃，同时用3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9.0，在此条件下盐解3小时，盐解液离心得肝素钠预处理液。将肝素钠预处理液温度降至32℃，加入双氧水， 其体积为肝素钠预处理液的2％，搅拌均匀后加至装有15L FPA98树脂的树脂柱中进行吸附，控制吸附速度为0.06BV/h，吸附完毕后的树脂先用6％氯化钠溶液洗涤，流速0.5BV/h，洗涤至吸光度A_260nm≤0.20、A_280nm≤0.20时，用12％氯化钠溶液洗脱，洗脱速度0.06BV/h，检测下柱液折光，当折光大于6时开始收集洗脱液，约收集1BV。收集的洗脱液用6mol/L盐酸溶液调节pH为6.0，再经超滤、冻干得肝素钠精品310g。肝素钠精品用12倍水(3.72L)溶解后与苄索氯铵水溶液(620g溶于8倍水，合4.96L水)混合，室温进行反应1小时，反应结束后离心，用水洗涤沉淀物，然后烘干得肝素季铵盐900g(减压干燥，温度50℃，真空度-0.093Mpa，干燥时间45小时)；肝素季铵盐用5倍(4.5L)二氯甲烷溶解后加入900ml氯化苄，在30℃下进行酯化，酯化28小时后结束，冷却至室温，加入甲醇沉淀，分离沉淀并用甲醇洗涤，干燥得肝素苄酯(干燥温度为45℃，真空度-0.1Mpa，干燥时间10小时)；肝素苄酯用20倍水溶解，加入肝素苄酯重量9％的氢氧化钠，50℃下进行解聚反应1小时，反应结束加入甲醇沉淀，分离沉淀为肝素解聚产物；肝素解聚产物用纯化水溶解，用3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH10.0，加入1.0％双氧水进行氧化脱色；将氧化脱色后的溶液用甲醇沉淀，加入甲醇使甲醇在溶液中浓度为80％，分离沉淀，沉淀用纯化水溶解后冻干得依诺肝素钠234.4g。其检测结果见表1。

实施例3

取肝素钠粗品1公斤，用10L纯化水溶解，加入200g氯化钠，升高温度至50℃，同时用6mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为8.5，在此条件下盐解2小时，盐解液离心得肝素钠预处理液。将肝素钠预处理液温度降至30℃，加入双氧水，其体积为肝素钠预处理液的1.5％，搅拌均匀后加至装有15L FPA98树脂的树脂柱中进行吸附，控制吸附速度为0.05BV/h，吸附完毕后的树脂先用5.5％氯化钠溶液洗涤，流速0.5BV/h，洗涤至吸光度A_260nm≤0.20、A_280nm≤0.20时，用12％氯化钠溶液洗脱，洗脱速度0.05BV/h，检测下柱液折光，当折光大于5.5时开始收集洗脱液，约收集1BV。收集的洗脱液用8mol/L盐酸溶液调节pH为5.5，经超滤、冻干得肝素钠精品349g。肝素钠精品用11倍水(3.84L)溶解后与苄索氯铵水溶液(698g溶于9倍水，合6.28L水)混合，室温进行反应1.5小时，反应结束 后离心，用水洗涤沉淀物，然后烘干得肝素季铵盐1025g(减压干燥，温度50℃，真空度-0.09Mpa，干燥时间60小时)；肝素季铵盐用4倍二氯甲烷(4.1L)溶解后加入1025ml氯化苄，在30℃下进行酯化，酯化25小时后结束，冷却至室温，加入甲醇沉淀，分离沉淀并用甲醇洗涤，干燥得肝素苄酯(干燥温度为43℃的减压干燥，真空度-0.096Mpa，干燥时间45小时)；肝素苄酯用20倍水溶解，加入肝素苄酯重量8％的氢氧化钠，50℃下进行解聚反应1.5小时，反应结束加入甲醇沉淀，分离沉淀为肝素解聚产物；肝素解聚产物用纯化水溶解，用6mol/L氢氧化钠溶液调节pH9.5，加入1.5％双氧水进行氧化脱色；将氧化脱色后的溶液用甲醇沉淀，加入甲醇使甲醇在溶液中浓度为80％，分离沉淀，沉淀用纯化水溶解后冻干得依诺肝素钠261.1g。其检测结果见表1。

实施例4

取肝素钠粗品1公斤，用9L纯化水溶解，加入135g氯化钠，升高温度至55℃，同时用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为9.0，在此条件下盐解2.5小时，盐解液离心得肝素钠预处理液。将肝素钠预处理液温度降至30℃，加入双氧水，其体积为肝素钠预处理液的1％，搅拌均匀后加至装有15L OC1074树脂的树脂柱中进行吸附，控制吸附速度为0.06BV/h，吸附完毕后的树脂先用5.5％氯化钠溶液洗涤，流速0.5BV/h，洗涤至吸光度A_260nm≤0.20、A_280nm≤0.20时，用12％氯化钠溶液洗脱，洗脱速度0.06BV/h，检测下柱液折光，当折光大于5.5时开始收集洗脱液，约收集1BV。收集的洗脱液用1mol/L盐酸溶液调节pH为5.8，再经超滤、冻干得肝素钠精品325g。肝素钠精品用10倍水溶解后与苄索氯铵水溶液(650g溶于10倍水，合6.5L)混合，室温进行反应2小时，反应结束后离心，用水洗涤沉淀物，然后烘干得肝素季铵盐940g(减压干燥，温度50℃，真空度-0.096Mpa，干燥时间50小时)；肝素季铵盐用4倍二氯甲烷溶解(3760ml)后加入940ml氯化苄，在30℃下进行酯化，酯化30小时后结束，冷却至室温，加入甲醇沉淀，分离沉淀并用甲醇洗涤，干燥得肝素苄酯(干燥温度为40℃的减压干燥，真空度-0.09Mpa，干燥时间12小时)；肝素苄酯用20倍水溶解，加入肝素苄酯重量10％的氢氧化钠，50℃下进行解聚反应1小时，反应结束加入甲醇沉淀，分离沉淀为肝素解聚产物；肝素解聚产物用纯化水溶解，用4mol/L氢氧 化钠溶液调节pH10.0，加入1.5％双氧水进行氧化脱色；将氧化脱色后的溶液用甲醇沉淀，加入甲醇使甲醇在溶液中浓度为75％，分离沉淀，沉淀用纯化水溶解后冻干得依诺肝素钠240.0g。其检测结果见表1。

表1 实施例1～4所得依诺肝素钠成品的检测结果