还原型氧化石墨烯催化银沉积的电化学检测方法及其应用

摘要

本发明提供一种基于还原型氧化石墨烯催化银沉积的电化学检测方法及其应用。所述方法包括：在金电极上修饰可被待检测物特异性识别的DNA探针，得到工作电极；将工作电极与含已知比活力的待检测物、能够将被待测物特异性识别的所述DNA探针切割成寡核苷酸单链的物质的标准样品溶液反应，将反应后电极负载上还原型氧化石墨烯，再与含银离子的溶液发生银沉积反应，将沉积在工作电极上的银单质溶出，并利用线性扫描伏安法测定银单质的溶出伏安电流值，绘制标准曲线；根据标准曲线，计算得到待测样品的比活力。本发明建立的电化学检测方法具有免标记、检测过程安全、操作简单、易于微型化、应用广泛等优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于还原型氧化石墨烯催化银沉积 的电化学检测方法及其应用。

背景技术

石墨烯是一种二维碳纳米材料，独特的电子结构使其具有电子迁移率高、比表面 积大，优异的力学、热学及催化性能，被广泛用于生物小分子、核酸、酶、蛋白质、 细胞、金属离子等目标物的检测中。还原型氧化石墨烯(rGO)作为石墨烯衍生物的 一种，由于其表面含氧基团较少，更易通过π-π共轭作用结合寡核苷酸单链。Lin等 (Biosensors and Bioelectronics 52(2014)153–158)报道了一种在玻碳电极表面通过电 化学还原法修饰还原型氧化石墨烯，利用其量子隧道效应及纳米金介导的银沉积反应 检测癌胚抗原的方法。该方法能实现对低浓度癌胚抗原的检测，但操作繁琐，且需金 属纳米颗粒介导才能进行银沉积。还需建立更便捷的基于石墨烯的银沉积方法，并将 其应用于生物标志物的检测中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何利用还原型氧化石墨烯催化银沉积的性质，发 展一种直接电化学检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于还原型氧化石墨烯催化银沉积的 电化学检测方法。

本发明所提供的基于还原型氧化石墨烯催化银沉积的电化学检测方法，包括下述：

1)工作电极的制备

在金电极上修饰可与待测物特异性识别的DNA探针，得到工作电极；

2)标准曲线的绘制

A、将多个所述工作电极分别与多个不同组成的标准样品溶液中的每一个进行反 应，得到多个经标准样品溶液处理后的工作电极；

所述多个不同组成的标准样品溶液中的每一个均为含下述组分的溶液：已知比活 力的待检测物和能够将被待测物特异性识别的所述DNA探针切割成寡核苷酸单链的 物质；

所述多个不同组成的标准样品溶液中的每一个中的所述能够将被待测物特异性识 别的所述DNA探针切割成寡核苷酸单链的物质的含量均相等；

B、将所述多个经标准样品溶液处理后的工作电极中的每一个分别与还原型氧化 石墨烯进行孵育，得到多个负载有还原型氧化石墨烯的工作电极，将所述多个负载有 还原型氧化石墨烯的工作电极中的每一个与含银离子的溶液发生银沉积反应，得到多 个沉积有银单质的工作电极；

C、用含有硝酸根离子的溶液将所述多个沉积有银单质的工作电极中的每一个沉 积有银单质的工作电极上的银单质溶出，在此溶出过程中，利用线性扫描伏安法测定 银单质的溶出伏安电流值，以所述多个标准样品的比活力为横坐标，测得的银单质溶 出伏安电流值为纵坐标，绘制样品比活力测定的标准曲线；

3)待测样品的检测

a、将所述工作电极与待测样品溶液进行反应，得到经待测样品溶液处理后的工作 电极；

所述待测样品溶液为含下述组分的溶液：未知比活力的待检测物和所述能够将被 待测物特异性识别的所述DNA探针切割成寡核苷酸单链的物质；

其中，所述待测样品溶液中的所述能够将被待测物特异性识别的所述DNA探针 切割成寡核苷酸单链的物质的含量与所述多个不同组成的标准样品溶液中的每一个中 的所述能够将被待测物特异性识别的所述DNA探针切割成寡核苷酸单链的物质的含 量相等；

b、将所述经待测样品溶液处理后的工作电极与所述还原型氧化石墨烯进行反应， 得到负载有还原型氧化石墨烯的工作电极，将所述负载有还原型氧化石墨烯的工作电 极与所述含银离子的溶液发生银沉积反应，得到沉积有银单质的工作电极；

c、用所述含有硝酸根离子的溶液将所述沉积有银单质的工作电极上的银单质溶 出，在此溶出过程中，利用线性扫描伏安法测定银单质的溶出伏安电流值，根据所述 标准曲线，得到所述待测样品溶液中待测样品的比活力。

上述1)中，所述待检测物为酶、核酸或蛋白质。

当所述待检测物为dam甲基化酶时，所述巯基化的DNA探针为 5'-CTCCCTAATAACAATGATCACTATTCCT-SH-3'，其中，加粗部分为探针序列(如 序列表中序列1所示)，在所述探针序列3'端连有巯基。

上述1)中，所述工作电极的制备为：先用巯基化的DNA探针对金电极表面进行 修饰，然后用巯基己醇封闭所述电极，最后用互补链对所述DNA探针进行杂交，得 到工作电极。

所述金电极在修饰前经过抛光处理。

所述修饰的温度为0-8℃，时间为12-16小时。

所述杂交的温度为室温，时间为1-6小时。

所述2)A中，所述多个为大于2个，如10个。

所述已知比活力为0-80.0U/mL，其中，U的定义为：1U指在10μl反应体系中， 37℃条件下，1小时能保护1μgλDNA不被MboI限制性内切酶切割所需要的酶量。

所述能够将被待测物特异性识别的所述DNA探针切割成寡核苷酸单链的物质为 限制性内切酶。

所述2)A中，当所述待检测物为dam甲基化酶时，所述能够将被待测物特异性 识别的所述DNA探针切割成寡核苷酸单链的物质为DpnⅠ限制性内切酶和S-腺苷甲 硫氨酸的混合物。

所述2)B中，所述还原型氧化石墨烯是按照包括下述步骤的方法制备得到的： 将氧化石墨烯分散在水中，得到分散均匀的氧化石墨烯水溶液；将所述氧化石墨烯水 溶液与水、氨水和水合肼混合，反应后得到还原型氧化石墨烯，将所述还原型氧化石 墨烯分散在水中，得到还原型氧化石墨烯溶液。

其中，在所述氧化石墨烯水溶液中，氧化石墨烯与水的配比为5-10mg:5-10mL。

所述氧化石墨烯与氨水、水合肼的配比为5-10mg:0.5-2mL:15-45μL，具体可为 10mg:1mL:30μL。

所述反应的温度为50-60℃，时间为4-6小时。

所述还原型氧化石墨烯溶液中，还原型氧化石墨烯的质量浓度为0.1-0.5mg/mL。

所述2)A和3)a中，所述反应的温度为25℃-45℃，时间为1-4小时。

所述2)B和3)b中，所述孵育的温度为室温(20℃-25℃)，时间为4-6小时

所述含银离子的溶液由下述组分组成：甘氨酸、硝酸银和双氧水。

所述银沉积反应的温度为室温(具体为25℃)，时间为1-5分钟。

所述2)C和3)c中，所述含有硝酸根离子的溶液具体可为含有硝酸钾的硝酸溶 液。

所述2)C和3)c中，所述线性扫描伏安法(LSV)的电压范围为-0.4-1.0V，扫 描速率为50-100mV/s。

本发明与现有技术相比具有如下优点：rGO与巯基化寡核苷酸单链的结合是通过 π-π共轭作用，结合效率高；rGO能快速催化Ag沉积反应，室温下3分钟即可完成， 有利于快速检测的实现；利用直接电化学方法检测Ag溶出电流，避免了传统阳极溶 出伏安法中，需先进行恒电位富集再溶出的复杂过程；本发明建立的还原型氧化石墨 烯催化银沉积电化学检测方法具有免标记、检测过程安全、操作简单、易于微型化、 应用广泛等优点。

附图说明

图1为本发明的基于还原型氧化石墨烯催化银沉积的电化学检测方法用于甲基化 酶检测的原理图。

图2为氧化石墨烯和rGO的红外光谱图。

图3为rGO催化银沉积反应(无rGO存在为对照)随时间变化的响应图。

图4为本发明方法中测得的银溶出电流对甲基化酶比活力测定的标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所 用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所采用的巯基化DNA探针为生工生物工程(上海)股份有限公司的 产品(5'-CTCCCTAATAACAATGATCACTATTCCT-SH-3')，其中，加粗部分为探针 序列，在所述探针序列3'端连有巯基。

实施例1、基于还原型氧化石墨烯催化银沉积的电化学检测方法对dam甲基化酶 的比活力的定量检测

图1为本发明的基于还原型氧化石墨烯催化银沉积的电化学检测方法用于甲基化 酶检测的原理图。

1)rGO的制备

称取10mg氧化石墨烯分散在10mL水中，强力超声1小时，得到分散均匀的氧 化石墨烯溶液。在该溶液中加入10ml水、1mL氨水和30μL水合肼混合均匀，60℃ 水浴反应4小时。产物离心水洗两次后，重分散在10mL水中，即得rGO溶液(浓度 为1mg/mL)。

图2为氧化石墨烯和rGO的红外光谱图。

2)工作电极的制备

将20μL含有2μM巯基化DNA探针的磷酸缓冲液滴在已抛光处理的金电极表 面，于4℃修饰12小时后，用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.3)清洗电极。巯基己醇封闭 电极10分钟后，用超纯水将电极冲洗干净，氮气吹干。在该电极表面滴加20μL互补 链，室温下杂交2小时，用磷酸缓冲液冲洗干净，即得工作电极。

3)标准曲线的绘制

A、甲基化反应：将多个所述工作电极分别浸入到20μL含有dam甲基化酶(比 活力为0U/mL、0.1U/mL、0.2U/mL、0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL、 40U/mL、80U/mL)、Dpn I限制性内切酶(50U/mL)、S-腺苷甲硫氨酸(320μM)的 Tris-EDTA缓冲液中，于37℃反应2小时，得到多个处理后的工作电极；

B、分别在所述处理后的工作电极表面滴加20μL所述rGO溶液，潮湿环境下室 温孵育4小时，用超纯水冲洗干净并用氮气吹干，分别浸入300μL银沉积溶液(0.1M 甘氨酸，10mM AgNO₃，5mM H₂O₂)中进行避光室温下银沉积反应3分钟，(图3为 rGO催化银沉积反应(无rGO存在为对照)随时间变化的响应图，由此确定银沉积反 应时间为3分钟)，反应完成后立即将电极取出并用PBS清洗，得到多个沉积有银单 质的工作电极；

C、将所述多个沉积有银单质的工作电极中的每一个放置于HNO₃-KNO₃溶液(0.6 M KNO₃，0.1M HNO₃)中，将银单质溶出，并直接进行线性扫描LSV，电压范围为 -0.4～1.0V，扫描速率为100mV/s，记录银单质的溶出伏安电流值。以所述多个标准样 品的比活力为横坐标，测得的银单质溶出伏安电流值为纵坐标，绘制样品浓度测定的 标准曲线(图4所示)；

由图4可知，该方法检测dam甲基化酶比活力的线性范围为0.1到10.0U/mL， 回归方程为：I(A)＝0.3883X+1.8528，相关系数为0.9969。

4)实际样本中dam甲基化酶的检测

将步骤2)处理的工作电极浸入20μL含有dam甲基化酶(标准比活力为5.0 U/mL)，Dpn I限制性内切酶(50U/mL)，S-腺苷甲硫氨酸(320μM)的Tris-EDTA 缓冲液中，于37℃反应2小时，得到处理后的工作电极；

依次按照步骤3)中的B和C的操作进行检测，得到银溶出电流响应值为3.8μA。 根据标准曲线I(μA)＝0.3883X+1.8528，可得到对应的实际样本溶液中dam甲基化酶 的比活力为5.01U/mL。

测得的dam甲基化酶的比活力(5.01U/mL)与标准比活力5.0U/mL相近。这表 明本发明所提供的基于还原型氧化石墨烯催化银沉积的电化学检测方法能准确地测定 dam甲基化酶的比活力。

实施例2、

按照实施例1中的方法建立标准曲线，不同之处在于：

将步骤2)处理的工作电极浸入20μL含有dam甲基化酶(标准比活力为1U/mL)， Dpn I限制性内切酶(50U/mL)，S-腺苷甲硫氨酸(320μM)的Tris-EDTA缓冲液中， 于37℃反应2小时，得到处理后的工作电极；

依次按照步骤3)中的B和C的操作进行检测，得到银溶出电流响应值为2.2μA。 根据标准曲线I(μA)＝0.3883X+1.8528，可得到对应的实际样本溶液中dam甲基化酶 的比活力为0.89U/mL。

测得的dam甲基化酶的比活力(0.89U/mL)与标准比活力1U/mL相近。这表明 本发明所提供的基于还原型氧化石墨烯催化银沉积的电化学检测方法能准确地测定 dam甲基化酶的比活力。

实施例3、按照实施例1中的方法建立标准曲线，不同之处在于：

将步骤2)处理的工作电极浸入20μL含有dam甲基化酶(标准比活力为0.5 U/mL)，Dpn I限制性内切酶(50U/mL)，S-腺苷甲硫氨酸(320μM)的Tris-EDTA 缓冲液中，于37℃反应2小时，得到处理后的工作电极；

依次按照步骤3)中的B和C的操作进行检测，得到银溶出电流响应值为2.08μA。 根据标准曲线I(μA)＝0.3883X+1.8528，可得到对应的实际样本溶液中dam甲基化酶 的比活力为0.59U/mL。

测得的dam甲基化酶的比活力(0.59U/mL)与标准比活力0.5U/mL相近。这表 明本发明所提供的基于还原型氧化石墨烯催化银沉积的电化学检测方法能准确地测定 dam甲基化酶的比活力。