一种用于结核分枝杆菌及其抗原双重染色的试剂盒及其方法

摘要

本发明公开了一种结核分枝杆菌及其表达蛋白染色的试剂盒及其方法。本发明提供了一种染色结核分枝杆菌及其表达蛋白的方法，包括如下步骤：1)对含有结核分枝杆菌的待测样本依次进行一抗孵育和二抗孵育，得到抗体结合产物；2)将所述抗体结合产物依次经DAB染色液染色、石碳酸复红染色液染色和苏木素染色液染色，实现染色结核分枝杆菌及其表达蛋白。本发明的实验证明，本发明开发了一种能用于结核病病理学诊断的新试剂盒，该试剂盒可以实现在一张组织标本切片中同时检测结核分枝杆菌菌体及其表达的蛋白，从而提高结核病病理学诊断敏感性。该试剂盒使用方法简便，适用于病理科开展常规检测，具有良好的临床推广价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于结核分枝杆菌及其抗原双重染色的 试剂盒及其方法。

背景技术

结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病，全球有1/3的人口感染了结核分枝杆 菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，每年有200万人死于结核病，其死亡率在 传染性疾病中仅低于艾滋病排第二。目前结核病诊断的金标准是痰细菌学检测。但是 痰涂片阳性率低，痰培养需要一个月的时间才能出结果，因此最常用的痰细菌学检测 手段无法满足临床确诊的需求。此外，近年来基于免疫学的ELISPOT以及基于核酸检 测的PCR等新技术也应用到了结核病诊断中。但是ELISPOT技术无法分辨潜伏感染者 与真正的结核病患者，因此在MTB感染率非常高的中国诊断价值非常有限。而多种PCR 技术由于对设备、技术人员的要求高，且测试成本高等原因无法普及到各级医疗机构。 病理学诊断是结核病确诊的重要途径，尤其是对于痰细菌学阴性的结核病患者及肺外 结核患者的诊断。结核病组织病理学特征是肉芽肿性炎症，病变内可见类上皮细胞、 朗汉斯巨细胞以及干酪样坏死等。由于其他感染性或非感染性疾病也可能会出现类似 病理变化，临床上确诊结核病还需要在组织标本中检测到MTB的存在。目前使用最广 泛的MTB检测方法是萋尼氏(Ziehl-Neelsen)染色法，但存在敏感性低，寻找MTB 费时费力等缺点。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色方法。

本发明提供的用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色方法，包括如下步骤：

1)将待检测组织切片与抗MTB抗原抗体溶液反应，得到一抗结合切片；

2)将所述一抗结合切片与二抗溶液反应，得到二抗结合切片；

3)用DAB染色液对所述二抗结合切片进行染色，得到DAB染色切片；

4)用石碳酸复红染色液对所述DAB染色切片染色，得到石碳酸复红染色切片；

5)用苏木素染色液对所述石碳酸复红染色切片染色，得到染色切片，实现组织 切片染色。

上述方法中，所述抗MTB抗原抗体为抗MTB抗原多克隆抗体；

所述MTB抗原的氨基酸序列为序列表中序列1；

所述二抗溶液的二抗为羊抗兔IgG抗体；所述羊抗兔IgG抗体具体HRP标记的羊 抗兔IgG抗体。二抗溶液采用羊抗兔-HRP二抗，迈新生物的产品。

上述方法中，步骤1)中，所述反应的温度为23-28℃，所述反应的时间为0.5-2h；

步骤2)中，所述反应的温度为23-28℃，所述反应的时间为10-20min。

步骤3)中，所述染色时间为1-10min、染色温度为23-28℃；

步骤4)中，所述染色时间为20-90min、染色温度为23-28℃；

步骤5)中，所述染色时间为0.5-2min、染色温度为23-28℃。

上述方法中，在步骤1)-2)之间，还包括如下步骤：洗涤所述一抗结合切片；

在步骤2)-3)之间，还包括如下步骤：洗涤所述二抗结合切片；

在步骤3)-4)之间，还包括如下步骤：洗涤所述DAB染色切片；

在步骤4)-5)之间，还包括如下步骤：先用分化液脱色所述石碳酸复红染色切 片得到脱色后石碳酸复红染色切片，再洗涤所述脱色后石碳酸复红染色切片；所述洗 涤采用的洗涤液具体浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS或水；

在步骤5)中，在所述染色得到染色切片后还包括如下步骤：先分化液脱色所述 染色切片，得到脱色后染色切片，再洗涤所述脱色后染色切片；所述洗涤采用的洗涤 液具体浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS或水。

上述方法中，所述脱色时间均为30秒-60秒。

上述方法中，所述待检测组织切片为石蜡包埋的待检测组织切片。

上述方法中，在所述方法的步骤1)前，还包括如下步骤：

A、将所述石蜡包埋的待检测组织切片进行脱蜡水化，得到脱蜡水化后切片；

B、将所述脱蜡水化后切片在浓度为0.01M、pH值为6.0的柠檬酸缓冲液中高压 修复，得到修复后切片；

所述高压的压力为80-100千帕；

所述修复时间为90s，所述修复的温度为100℃；

本发明的另一个目的是提供一种用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色的试剂 盒。

本发明提供的试剂盒，包括DAB染色液、石碳酸复红染色液和苏木素染色液。

上述试剂盒还包括记载在可读载体上的染色方法，所述染色方法为上述的方法。

所述可读载体具体为说明书。

上述的试剂盒在如下1)或2)至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

1)制备检测或辅助检测或诊断或辅助诊断结核分枝杆菌产品中的应用；

2)制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否含有结核分枝杆菌产品中的应用。

0.01mol/L、pH值为6.0的柠檬酸钠缓冲液:将2.41g柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O) 及0.38g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)溶于1L蒸馏水中。

抗MTB抗原的多克隆抗体溶液：将MTB抗原(氨基酸序列为序列1)免疫新西兰 白兔，收集兔血清，利用proteinG纯化获得抗MTB抗原的多克隆抗体溶液。

DAB染色液：先配置20×DAB染色母液：将0.1g二氨基联苯胺 (3,3’-diaminobenzidine，DAB)倒入10ml蒸馏水中，得到混合液，向混合液中加入 3-5滴10M HCl至混合液变为浅棕色则DAB溶解完全，分装，保存于-20℃。

临用前用0.1M PB缓冲液(29g Na₂HPO₄·12H₂O及3g NaH₂PO₄·2H₂O溶于1L蒸馏 水中)将20×DAB染色母液稀释至1×工作液后加入H₂O₂至终浓度0.03％。；

石碳酸复红染色液：先配置10ml碱性复红乙醇饱和液(将1g碱性复红溶于10ml 无水乙醇中)和配置90ml 5％石碳酸溶液(将5g苯酚溶于蒸馏水)，再将这两种溶液 混合即为石炭酸复红液。

分化液：在27ml蒸馏水中加入3ml浓盐酸和70ml无水乙醇，混匀即为分化液。

苏木素染色液：将5g苏木素溶于50ml无水乙醇，得到苏木素无水乙醇液；再将 44g硫酸铝钾放入1L蒸馏水中加热溶解，得到硫酸铝钾溶液；再将苏木素无水乙醇 液和硫酸铝钾溶液混合，得到混合液；等混合液沸腾后搅拌冷却至91℃左右，缓慢 加入2.5g氧化汞，溶解完毕后置于冷水中冷却，得到反应产物，次日过滤反应产物， 收集滤液，再向滤液中加入4g柠檬酸，搅匀即为苏木素染色液。

浓度为0.01M、pH值为7.4PBS配方：2.9g Na₂HPO₄·12H₂O,0.3g NaH₂PO₄·2H₂O 及9gNaCl溶于1L蒸馏水中，调节pH值为7.4。

本发明的实验证明，本发明开发了一种用于结核分枝杆菌及其抗原双重染色的试 剂盒，该试剂盒可以实现在一张组织标本切片中同时检测MTB及其表达的蛋白，从而 提高病理学诊断结核病的敏感性。该试剂盒使用方法简便，适用于病理科开展常规检 测，具有良好的临床推广价值。

附图说明

图1为在结核病组织切片中按照4种不同染色方法进行染色的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、结核病组织标本染色方法

一、试剂的配置：

0.01mol/L、pH值为6.0的柠檬酸钠缓冲液:将2.41g柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O) 及0.38g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)溶于1L蒸馏水中。

浓度为0.01M、pH值为7.4PBS配方：2.9g Na₂HPO₄·12H₂O,0.3g NaH₂PO₄·2H₂O 及9gNaCl溶于1L蒸馏水中，调节pH值为7.4。

抗MTB抗原的多克隆抗体：将MTB抗原(氨基酸序列为序列1)免疫新西兰白兔， 收集兔血清，利用proteinG纯化获得抗MTB抗原的多克隆抗体。

DAB染色液：先配置20×DAB染色母液：将0.1g二氨基联苯胺 (3,3’-diaminobenzidine，DAB)倒入10ml蒸馏水中，得到混合液，向混合液中加入 3-5滴10M HCl至混合液变为浅棕色则DAB溶解完全，分装，保存于-20℃。

临用前用0.1M PB缓冲液(29g Na₂HPO₄·12H₂O及3g NaH₂PO₄·2H₂O溶于1L蒸馏 水中)将20×DAB染色母液稀释至1×工作液后加入H₂O₂至终浓度0.03％。；

石碳酸复红染色液：先配置10ml碱性复红乙醇饱和液(将1g碱性复红溶于10ml 无水乙醇中)和配置90ml 5％石碳酸溶液(将5g苯酚溶于蒸馏水)，再将这两种溶液 混合即为石炭酸复红液。

分化液：在27ml蒸馏水中加入3ml浓盐酸和70ml无水乙醇，混匀即为分化液。

苏木素染色液：将5g苏木素溶于50ml无水乙醇，得到苏木素无水乙醇液；再将 44g硫酸铝钾放入1L蒸馏水中加热溶解，得到硫酸铝钾溶液；再将苏木素无水乙醇 液和硫酸铝钾溶液混合，得到混合液；等混合液沸腾后搅拌冷却至91℃左右，缓慢 加入2.5g氧化汞，溶解完毕后置于冷水中冷却，得到反应产物，次日过滤反应产物， 收集滤液，再向滤液中加入4g柠檬酸，搅匀即为苏木素染色液。

二、染色方法

为获得最佳染色效果，在抗原修复、石碳酸复红染色、一抗和二抗孵育、苏木素 染色等步骤的不同组合方式，具体如下：

1、染色方法1

1)准备4μm厚的石蜡组织(结核病组织标本)切片，常规二甲苯脱蜡(二甲苯 各10min/次，2次)、梯度酒精水化(100％以乙醇，90％乙醇水溶液，50％乙醇 水溶液，50％乙醇水溶液，各8min)，得到脱蜡水化后切片；

2)在浓度为0.01M、pH值为6.0的柠檬酸缓冲液中高压(80千帕)修复90s，得 到修复后切片，具体如下：

将1000ml 0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡 水化后切片置于不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力 阀，继续加热至喷气，80千帕保持90s后，压力锅离开热源，冷却至室温(稍冷 后，可在自来水龙头下加速冷却)，取出切片，得到修复后切片；

先用蒸馏水冲洗修复后切片两次，之后用0.01M、pH值为7.4的PBS冲洗两次， 每次3分钟；

3)向上述2)得到的修复后切片上滴加抗MTB抗原多克隆抗体溶液，覆盖切片上 待测组织，室温(25℃)孵育1h，得到一抗结合切片；pH值为7.4浓度为0.01M PBS洗3次，每次洗5min；

4)向上述3)中经过洗涤后的一抗结合切片上滴加HRP标记的羊抗兔IgG抗体溶 液(羊抗兔-HRP二抗，迈新生物的产品)，覆盖切片上待测组织，室温孵育15min， 得到二抗结合切片；pH值为7.4、0.01M PBS洗3次，每次洗5min；

5)向上述4)中经过洗涤后的二抗结合切片上滴加DAB染色液，覆盖切片上待测 组织，室温孵育3min，得到DAB染色切片；用水洗5min，终止反应；

6)向上述5)中经过洗涤后的DAB染色切片上滴加石碳酸复红染色液，覆盖切片 上待测组织，室温孵育1h；得到石碳酸复红染色切片；用水洗5min，终止反 应；

7)向上述6)中经过洗涤后的石碳酸复红染色切片上滴加分化液片刻至不再脱色 (脱色时间为30S)；得到分化液处理后切片；用水涮洗1次；

8)将上述7)中经过洗涤后的分化液处理后切片浸入苏木素染色液中染色1min， 得到苏木素染色切片；用水涮洗1次；再置于分化液中涮一下(脱色时间为 60S)，再用水浸泡5min，得到染色切片。

9)将上述8)得到的染色切片常规梯度酒精脱水、二甲苯透明后，中性胶封片， 镜检。

2、染色方法2

1)准备4μm厚的石蜡组织切片，常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化(与染色方法 1的1)相同)。

2)滴加石碳酸复红染色液，覆盖待测组织，室温孵育1h(与染色方法1的6) 相同)；

3)滴加分化液片刻至不再脱色，用水涮洗1次(与染色方法1的7)相同)；

4)在浓度为0.01M、pH值为6.0的柠檬酸缓冲液中高压修复90s(与染色方法 1的2)相同)；

5)滴加抗MTB抗原的多克隆抗体，覆盖待测组织，室温孵育1h；0.01M PBS(2.9g Na₂HPO₄·12H₂O,0.3g NaH₂PO₄·2H₂O及9gNaCl溶于1L蒸馏水中)洗3次， 每次洗5min(与染色方法1的3)相同)；

6)滴加羊抗兔-HRP二抗(购自迈新生物)，覆盖待测组织，室温孵育15min。0.01M PBS洗3次，每次洗5min(与染色方法1的4)相同)；

7)滴加DAB染色液，覆盖待测组织，室温孵育3min。用水洗5min，终止反应(与 染色方法1的5)相同)；

8)浸入苏木素染色液中染1min，用水涮洗1次；在分化液中涮一下，再用水浸 泡5min(与染色方法1的8)相同)。

9)常规梯度酒精脱水、二甲苯透明后，中性胶封片，镜检。

3、染色方法3

1)准备4μm厚的石蜡组织切片，常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化(与染色方 法1的1)相同)。

2)在浓度为0.01M、pH值为6.0的柠檬酸缓冲液中高压修复90s(与染色方法 1的2)相同)；

3)滴加抗MTB抗原的多克隆抗体，覆盖待测组织，室温孵育1h；0.01M PBS(2.9g Na₂HPO₄·12H₂O,0.3g NaH₂PO₄·2H₂O及9gNaCl溶于1L蒸馏水中)洗3次， 每次洗5min(与染色方法1的3)相同)；

4)滴加羊抗兔-HRP二抗(购自迈新生物)，覆盖待测组织，室温孵育15min。 0.01M PBS洗3次，每次洗5min(与染色方法1的4)相同)；

5)滴加DAB染色液，覆盖待测组织，室温孵育3min。用水洗5min，终止反应 (与染色方法1的5)相同)；

6)浸入苏木素染色液中染1min，用水涮洗1次；在分化液中涮一下，再用水浸 泡5min(与染色方法1的8)相同)。

7)滴加石碳酸复红染色液，覆盖待测组织，室温孵育1h(与染色方法1的6) 相同)；

8)滴加分化液片刻至不再脱色，用水涮洗1次(与染色方法1的7)相同)；

9)常规梯度酒精脱水、二甲苯透明后，中性胶封片，镜检。

4、染色方法4

1)准备4μm厚的石蜡组织切片，常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化(与染色方 法1的1)相同)。

2)在浓度为0.01M、pH值为6.0的柠檬酸缓冲液中高压修复90s(与染色方法 1的2)相同)；

3)滴加抗MTB抗原的多克隆抗体，覆盖待测组织，室温孵育1h；0.01M PBS(2.9g Na₂HPO₄·12H₂O,0.3g NaH₂PO₄·2H₂O及9gNaCl溶于1L蒸馏水中)洗3次， 每次洗5min(与染色方法1的3)相同)；

4)滴加石碳酸复红染色液，覆盖待测组织，室温孵育1h(与染色方法1的6) 相同)；

5)滴加分化液片刻至不再脱色，用水涮洗1次；

6)滴加羊抗兔-HRP二抗(购自迈新生物)，覆盖待测组织，室温孵育15min。 0.01M PBS洗3次，每次洗5min(与染色方法1的4)相同)；

7)滴加DAB染色液，覆盖待测组织，室温孵育3min。用水洗5min，终止反应 (与染色方法1的5)相同)；

8)浸入苏木素染色液中染1min，用水涮洗1次；在分化液中涮一下，再用水浸 泡5min(与染色方法1的8)相同)。

9)常规梯度酒精脱水、二甲苯透明后，中性胶封片，镜检。

用光学显微镜在不同放大倍数下观察上述4种方法的染色结果，如图1所示，A、 D、G、J是在4倍物镜下获得的染色结果；B、E、H、K是在40倍物镜下获得的染色结 果；C、F、I、L是在100倍油镜下获得的染色结果。A、B、C图是按照染色方法1进 行染色的结果，结果显示，MTB菌体、MTB表达蛋白、还有细胞核染色均非常清楚。D、 E、F图是按照染色方法2进行染色的结果，结果显示，MTB表达蛋白及细胞核染色非 常清楚，但是MTB菌体染色为阴性。G、H、I图是按照染色方法3进行染色的结果， 结果显示，MTB菌体、MTB表达蛋白染色清楚，但细胞核染色为阴性。J、K、L图是按 照染色方法4进行染色的结果，显示MTB菌体及细胞核染色清楚，但MTB表达蛋白染 色很弱。染色方法1够取得最佳染色效果，能实现MTB菌体、MTB表达蛋白及组织细 胞核的清晰染色效果，在高倍镜(×40物镜)下可以清晰看到MTB蛋白的表达，在油 镜(×100物镜)下可以清晰判别MTB菌体。

因此，上述DAB染色液、石碳酸复红染色液、苏木素染色液可以作为试剂盒的主 要组分，该试剂盒还可以包括记载上述方法的说明书。该试剂盒可以用于染色结核病 组织标本或MTB菌体或MTB菌体表面蛋白或染色结核病组织细胞核。

实施例2、结核病组织标本染色方法

为了探索实施例1制备的试剂盒的临床应用价值，收集了212例临床确诊的结核 病组织标本(由首都医科大学附属北京胸科医院提供，且患者知情)及63例对照疾病 组织标本(临床确诊的非结核病组织标本，由首都医科大学附属北京胸科医院提供， 且患者知情)。

将上述样本按照实施例1所示的染色方法1进行试验；

同时采用传统萋尼氏染色为对照。

传统萋尼氏染色方法：

1)准备4μm厚的石蜡组织切片，常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化。

2)滴加石碳酸复红染色液，覆盖待测组织，室温孵育1h；

3)滴加分化液片刻至不再脱色，用水涮洗1次；

4)滴加0.1％亚甲蓝溶液(0.1g亚甲蓝溶于100ml蒸馏水)，覆盖待测组织，室温 孵育20秒，用水涮洗1次；

5)常规梯度酒精脱水、二甲苯透明后，中性胶封片，镜检。

计算染色阳性率，结果如表1所示，在212例结核病组织标本中用实施例1的染 色方法1的是染色阳性率为65.6％(139例阳性)，显著高于萋尼氏染色的阳性率34.4％ (73例阳性)(p<0.001)。在对照疾病组织标本中两种方法均没有出现阳性结果，特 异性都非常好。

表1为2种染色方法的敏感性和特异性

因此，实施例1的试剂盒和方法可以用来鉴定或辅助鉴定待测样本是否含有结核 分枝杆菌及其表达蛋白或检测或辅助检测或诊断或辅助诊断结核病，具体方法如下：

用实施例1的试剂盒按照实施例1的方法对待测样本进行染色，若待测样本能染 色，则待测样本为或候选为含有结核分枝杆菌的样本；若待测样本不能染色，则待测 样本不为或候选不为含有结核分枝杆菌的样本。