细菌菌株的组合物、生物除污混合物和该组合物用于从土壤中去除污染物的用途以及用于净化土壤污染物的方法

摘要

本发明的目标是以编号KKP？2041p(IAFB工业微生物保藏中心–波兰农业及食品生物科技研究所)保藏的包含寡养单胞菌属种菌株2L、寡养单胞菌属种菌株5L、寡养单胞菌属种菌株6L、寡养单胞菌属种菌株3N、无色杆菌属种菌株4P、节杆菌属种菌株1N、短波单胞菌属种菌株2N、短波单胞菌属种菌株5N、短波单胞菌属种菌株6N、假单胞菌属种菌株3G、和假单胞菌属种菌株4的细菌菌株的组合物，包含这些菌株的组合物的生物除污菌苗(生物除污混合物)，菌苗在从土壤中去除污染物中的用途，以及处理污染土壤的方法。

说明书

说明书。

技术领域

本发明涉及以编号KKP 2041p保藏的由11种菌株组成的组合物：寡养单胞菌属种(Stenotrophomonas sp.)菌株2L、寡养单胞菌属种菌株5L、寡养单胞菌属种菌株6L、寡养单胞菌属种菌株3N、无色杆菌属种(Achromobacter sp.)菌株4P、节杆菌属种(Arthrobacter sp.)菌株1N、短波单胞菌属种(Brevundimonas sp.)菌株2N、短波单胞菌属种菌株5N、短波单胞菌属种菌株6N、假单胞菌属种(Pseudomonas sp.)菌株3G、和假单胞菌属种菌株4G，包含这些菌株的组合物的生物除污菌苗(生物除污混合物)，其从土壤中去除污染物的用途，以及土壤处理的方法。

背景技术

工业的不断发展涉及在正常条件下在那里不会存在的化合物在环境中的出现。目前，硝基化合物属于主要类型的人为污染，其中硝基苯、2-和4-硝基甲苯、3-硝基甲苯、4-硝基苯酚、3-硝基苯酚和对硝基苯胺值得特别注意。它们用于制造炸药，用于杀虫剂和除草剂生产，作为染料、塑料、涂料的合成以及制药工业中的底物。据估计，世界上每年生产约10⁸吨有机硝基化合物，并且多于8.5吨的硝基苯单独地被释放到环境中。近80年来，这些化合物在许多工业分支以及在上世纪前半世纪连同两次世界大战中大量军事材料和弹药的生产中的广泛使用已经导致硝基化合物对环境的严重污染。前述类型的化合物和它们的代谢物对人具有高度毒性和危险性。它们中的一些是烈性毒药，经常伴有强烈致突变和致癌特性。大多数芳香族硝基化合物的特征在于它们在生物系统中的稳定性和持久性和它们对降解的相当抗性(Kulkarni和Chaudhari, 2007)。

额外关注是，硝基化合物对土壤的污染还直接威胁地下水，并且因此可导致这些污染物渗入流水中这一事实。来自各个工业分支的有机化合物污染土壤和地下水的问题，不仅涉及波兰和其它欧盟国家，而且实际上涉及世界上所有工业化国家。在波兰和世界各地，这些化合物污染环境的问题主要涉及化工厂(在那里它们被用作有机合成中的底物)周围的区域，以及军事基地(在那里它们被保持和储存)的区域。

存在几种物理-化学中和硝基化合物的常规方法，诸如氧化和光氧化，水解，蒸发，燃烧，吸附等(Kanekar等人，2003)。然而，此类方法具有许多缺点和限制。燃烧不是成本节约的，且不是环境友好的。此外，其伴随相当量的毒性气体释放到环境中。在此类程序诸如过滤、萃取或吸附在树脂上的过程中，仅分离不需要的化合物，并且这不会导致其降解。同时，氧化过程使得形成毒性衍生物，且与高成本相关(Kulkarni和Chaudhari, 2007)。

开发了基于物理、化学和生物方法的几种土地除污策略。然而，据信，最便宜且最有效的并因此是安全的生物除污技术是利用微生物的代谢潜能的技术。

生物除污是修复的过程，其中，微生物诸如细菌、酵母和丝状真菌用于将有害物质分解为低毒性或无毒性化合物。

为了生物除污过程的目的，微生物分离自污染环境中存在的天然微生物区系(再接种)，或通过基因工程的方法获得。在实践中，在生物降解过程中，涉及显示降解某些烃基的特定能力的专门试剂盒(微生物的共生体(consortia))。此类共生体，除了高解毒活性，必须迅速适应被污染的环境，与土著微生物区系合作，且不积累毒性分解中间体。

可以区分两种类型的微生物制剂：含有外部来源菌株的制剂，和含有使用各种方法从处理的土壤分离的有效土著菌株的自身菌苗(autovaccine)。

专利PL 180 141公开了微生物除污石油污染的土壤的方法，其中利用从意欲经历处理的土壤分离的土著微生物。使分离的细菌菌株在补充石油烃的液体矿物培养基中在有氧条件下生长，并且鉴定之后，选择在降解这些污染物中具有最高活性的细菌。使选择的5至10种不同种类的细菌在26℃生长48至72小时。通过以大于10⁵个细胞/1 g干燥土壤用细菌的含水悬浮液喷洒而将繁殖的培养物引入污染的土壤。

专利PL 189 586公开了制备加速被石油污染的土壤和废水的处理的自身菌苗的方法，其依赖于通过稀释和在富含作为唯一碳源的无菌原油或萘的培养基中选择性培养而从土壤和废水中分离细菌。

土壤中芳香族硝基化合物，特别是硝基苯胺、硝基苯和硝基苯酚的延长存在起始了自然适应和在污染区域中选择微生物的过程，其影响微生物的质量以及土著(对于给定生态系统是天然的)组的物种组成。除了负责降解给定芳香族硝基化合物的微生物的精确知识，有效的生物除污需要，在生理、生化和分子水平上理解这些化合物的降解途径，以及关于流畅运行生物除污过程必要的条件优化的研究。本技术方案的作者已经实施了此类研究。

在来自军事用地(如军事训练场地)和工业化地区的土壤中，非常经常报道不仅各种有机异生素，而且还有重金属，诸如砷、镉、铬、铜、铅、汞、镍、锌等的高浓度(Bahig和Altalhi，2009年)。重金属被认为是有机异生素生物降解过程的有效抑制剂(Silva等人，2007)。据认为，工业废水中重金属的存在是限制使用生物除污方法的主要因素之一(Kulkami和Chaudhari, 2007)。然而，环境中这些污染物的长期存在，导致细菌发展出解毒这些化合物的机制。此外，暗示微生物对重金属的耐受性可以通过增加环境的选择压力而影响细菌之间的抗生素抗性基因的维持和传递(Spain, 2003)。还存在细菌对许多临床上重要种类的抗菌药物、重金属和用作消毒剂的季铵化合物的抗性之间的关联的证据。在许多情况下，这涉及在相同细菌质粒上密切邻近的确定这些抗性的基因的位置，这表明通过水平基因转移传递整个基因簇的可能性(Schluter等人, 2007)。

存在许多关于生物除污各种异生素(例如原油及其衍生物)污染土壤的过程的研究，但是，在本领域的当前状态中，没有关于使用被芳香族硝基化合物污染的区域的原地生物除污的的研究。在关于环状硝基化合物的生物降解的专业文献中，仅仅已经在实验室规模上考虑和分析了该问题。硝基化合物(特别是硝基苯胺)生物降解的有效方法的应用似乎是许多方面中的最佳技术方案，这主要是因为这些是环境中天然存在的过程，而且，非常重要的是，它们是非常有效的并且与比传统方法诸如物理-化学技术更低的成本相关。

波兰专利PL 380 007公开了土壤生物除污和预防具有有机物质的污染传播的方法，其基于将固定化形式的酵母种解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)引入土壤中。以有机介质(其是海藻酸钠、琼脂、明胶、胶原蛋白或鸟羽毛)上菌苗(生物制剂)的形式使用原地方法将酵母直接引入污染区域或它们周围。液体或干燥形式的菌苗可以作为颗粒剂或生物膜或生物胶引入，且酵母构成菌苗的5至50%(以质量计)，其中菌苗可以构成引入土壤中的材料的10至100％。在保护水体的情况下，在海岸线附近、超出波浪到达之处，根据地下水流的方向，将菌苗以0.1至2 m的深度置于直径为0.1至1.0 m的孔中，而它们的分布可以是直线的或横向重叠或同轴或环绕给定区域或位于其最低点。本发明尤其可用于被石油化合物、石油工业废弃物、植物和矿物油污染的地区。

发明的公开

本技术方案是从环境去除有害污染物而不向其中引入任何合成产品的自然方法。原地生物除污基于在环境中发生的自然过程，这与比常规物理-化学方法低得多的成本相关。开发且保藏的菌株组合物(菌苗)促进在短时间内快速获取适当量的制剂和进行生物除污。

作为生物除污菌苗组合物(这是本发明的目标)的部分的细菌菌株能够降解/代谢芳香族硝基化合物和，通常，芳香族化合物，诸如酚类、氨基苯酚、硝基苯酚以及多环芳香族化合物，其可以由这些微生物用作碳和能量的唯一来源。此外，所述菌株能够在高浓度的重金属存在的情况下生长(并且在被有机硝基化合物或石油污染的土壤的情况下也存在重金属)。它们同时，能够在高浓度的抗生素存在的情况下生长(在制药公司附近或额外被抗生素或它们的代谢物污染的区域的生物除污的情况下，这是非常显著的)；抗生素来自以下组：大环内酯类(红霉素)、氨基糖苷类(链霉素)、氟喹诺酮类(环丙沙星)、四环素类(四环素)、β-内酰胺类(青霉素)、糖肽类(万古霉素)。

本发明的目的是通过使用微生物生物除污混合物(菌苗)去除毒性芳香族硝基化合物用于生物除污被芳香族硝基化合物污染的土壤的有效方法。

本发明的目标是包含以下的菌株的组合物：寡养单胞菌属种菌株 2L、寡养单胞菌属种菌株 5L、寡养单胞菌属种菌株 6L、寡养单胞菌属种菌株 3N、无色杆菌属种菌株 4P、节杆菌属种菌株 1N、短波单胞菌属种菌株 2N、短波单胞菌属种菌株 5N、短波单胞菌属种菌株 6N、假单胞菌属种菌株 3G、和假单胞菌属种菌株 4G，其以编号KKP 2041p保藏。(IAFB工业微生物保藏中心 - 波兰农业及食品生物科技研究所，波兰)。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对来自以下组的抗生素的抗性：氨基糖苷类、氟喹诺酮类、糖肽类、大环内酯类、青霉素类、磺胺类、四环素类。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对环丙沙星的抗性。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对红霉素的抗性。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对庆大霉素的抗性。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对青霉素的抗性。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对链霉素的抗性。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)的抗性。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对四环素的抗性。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对万古霉素的抗性。

优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对重金属(诸如As (III)、Cu (II)、Cr (VI)、Zn (II) 和Ni (II))的抗性。

本发明的另一个目标是包含如上所述的菌株的组合物的生物除污菌苗(生物除污混合物)。

优选地，所述菌苗在1 ml培养基中包含10⁵个细菌细胞。

优选地，除了11种菌株的组合物以外，所述菌苗还包含补充有作为唯一碳源的硝基化合物的液体矿物培养基。

优选地，除了11种菌株的组合物以外，所述菌苗还包含补充有作为唯一碳源的硝基化合物的固体矿物培养基。

优选地，培养基中的硝基化合物是硝基苯、对硝基苯胺、2-硝基甲苯、4-硝基甲苯、二硝基甲苯、三硝基甲苯、单硝基苯酚或多硝基苯酚。

优选地，培养基中的碳源是上述硝基化合物中的至少一种。

优选地，根据土壤的污染程度，以50-200 mg/L的量向培养基添加硝基化合物。

本发明的另一个目标是使用生物除污菌苗以便从土壤中去除芳香族硝基化合物形式的污染物。

本发明的另一个目标是用于通过使用菌苗处理污染土壤的方法，其基于从污染土壤中分离土壤微生物，培养它们，选择/鉴定微生物，然后使选择的土壤微生物生长，此后将繁殖的培养物引入污染土壤，所述土壤经机械充氧且将其水分保持在适当水平，其特征在于这一事实，将所述芳香族硝基化合物从污染土壤去除，且土壤微生物是如上所述菌株组合物的一部分。

优选地，所述方法在原地(in situ)进行。

优选地，所述方法在异地(ex situ)进行。

优选地，将所述培养物在补充有作为唯一碳源的硝基化合物的液体矿物培养基上繁殖。

优选地，将所述培养物在补充有作为唯一碳源的硝基化合物的固体矿物培养基上繁殖。

优选地，培养基中的硝基化合物是硝基苯、对硝基苯胺、2-硝基甲苯、4-硝基甲苯、二硝基甲苯、三硝基甲苯、单硝基苯酚或多硝基苯酚。

优选地，培养基中的碳源是上述硝基化合物中的至少一种。

优选地，根据土壤的污染程度，以50 – 200 mg/L的量将硝基化合物添加至培养基。

优选地，所述培养物在20-25℃之间的温度繁殖。

优选地，以范围为1:10至3:10的菌苗与土壤体积比用细菌悬浮液(生物除污菌苗)喷洒污染土壤。

附图简述

图1呈现细菌的混合培养物(11种菌株)在补充芳香族硝基化合物的液体培养基(M9)中的生长。

实施方案的描述

作为本发明目标的组合物的使用是一种天然方法，其不向环境中引入任何合成产物。本技术方案的目标由土著生物体构成的事实缩短了生物降解所需的时间。此外，该方法基于环境中天然存在的过程，这是有效的，且比例如物理-化学方法更有效。

微生物分离自被硝基化合物污染的土壤(波美拉尼亚中的前军事训练场)。

为了该技术方案的目的，菌株命名如下：

表1. 菌株命名

2L寡养单胞菌属种5L寡养单胞菌属种6L寡养单胞菌属种4P无色杆菌属种3G假单胞菌属种4G假单胞菌属种1N节杆菌属种2N短波单胞菌属种3N寡养单胞菌属种5N短波单胞菌属种6N短波单胞菌属种

本发明的目标已经在以下非限制性实施方案中呈现。

实施例

实施例1.构成组合物的菌株的相互拮抗作用的测定

为了确定各个菌株是否不对彼此施加拮抗作用(作为细菌素分泌至环境中的结果，其它菌株对一些菌株的生长的抑制)，使用无菌接种环将细菌接种到具有补充200 mg/L浓度的2-硝基苯酚(变体I)或营养琼脂(变体II)的M9培养基(Na₂HPO₄ x H₂O – 0.134 g; KH₂PO₄ – 0.03g; NaCl – 0.5 g; MgSO₄ x 7H₂O – 2.47 g; CaCl₂ – 111 mg, 蒸馏H₂O至1000 ml的体积)的Petri皿上。将具体细菌菌株以固定配置分开约2 mm接种。指定生成的排列，以验证每种菌株是否能够在其它菌株的直接邻近处生长。在30℃孵育24小时后阅读结果。每种测试菌株都能够在其它菌株的直接邻近处生长。在此基础上，可以得出结论：在测试的微生物之间没有拮抗作用，即没有任何研究的菌株以使得例如通过产生细菌素抑制任何其它菌株的生长的方式改变环境。在两种实验变体中都获得了相同的结果，这证明了同样在使用的异生素存在的情况下，研究的菌株不产生将导致抑菌作用的生物活性物质。

实施例2.构成组合物的菌株对抗生素的敏感性的测定

进行纸片扩散法以测定细菌对所选抗生素的敏感性。我们使用用良好定义浓度的抗生素(BioMerioux)(表2)浸泡的纸片，并使用E-测试(Oxoid)(表3)实施最小抑制浓度测试。

表2. 在研究中使用的抗生素纸片

抗生素浓度[μg/ml]环丙沙星(CIP)5红霉素(E)15庆大霉素(CN)30青霉素G (P)10链霉素(S)25磺胺甲噁唑(RL)25四环素(TE)30万古霉素(VA)30

表3. 在研究中使用的E-测试

E-测试(抗生素)E-测试范围[μg/ml]环丙沙星(CI)32 - 0.002红霉素(EM)256 - 0.016庆大霉素(GM)256 - 0.016诺氟沙星(NX)256 - 0.016青霉素G (PG)32 - 0.002链霉素(SM)1024 - 0.064磺胺甲噁唑(SX)1024 - 0.064四环素(TC)256 - 0.016头孢曲松(TX)256 - 0.016万古霉素(VA)256 - 0.016

进行研究的目的是确定分离的细菌菌株在何种程度上对所选抗生素是敏感的。以以下方式选择抗生素，使得它们分别属于不同组：氨基糖苷类(庆大霉素、链霉素)；第二代氟喹诺酮类(环丙沙星)；糖肽类(万古霉素)；大环内酯类(红霉素)；青霉素类(青霉素)；磺胺类(磺胺甲噁唑)；四环素类(四环素)。

使用密度计(EMO)从每种菌株培养物制备McFarland’s 0.5接种物。然后，使用无菌棉签，将细菌细胞的悬浮液涂布在具有即用型MHA培养基(Oxoid)的皿上，且在15分钟后，将以定义浓度的抗生素浸泡的纸片置于它们上。

将皿在25-30℃孵育，并且在24和48小时后阅读结果。测试菌株对给定抗生素的敏感性的量度是在用抗生素浸泡的纸片周围形成的抑菌圈的尺寸。将阅读的结果(以mm测量的区域尺寸)与2010年欧洲抗微生物敏感性测试委员会(EUCAST)标准(表4)中含有的数据比较。

表4. 根据EUCAST标准, 2010年的生长抑制区的限值

* S – 敏感；R – 抗性。

测试细菌菌株对给定抗生素的敏感性的量度是在纸片周围形成的抑菌圈的尺寸(表5)。

表5. 通过纸片扩散法测定的测试细菌菌株对给定抗生素的敏感性

。

在研究的下一阶段，测定给定抗生素对研究菌株的MIC值，这意味着药物的最低浓度，以mg/L表示，在体外测定，其在给定时间内抑制以定义接种密度的细菌的生长(Hryniewicz等人，2001)。这些研究允许更严密地测定细菌对应用的抗生素的敏感性的程度。

将细菌悬浮液均匀地分布在具有即用型MHA培养基(Oxoid)的皿上，然后将用浓度梯度的抗生素浸泡的塑料测试条(E-测试)置于其上。将皿在25-30 ℃孵育24 h，并且在该时间后阅读测试结果。

在测试条周围出现的抑制的椭圆形区域与条的梯度刻度上的值指示的相互交叉，确定了抑制微生物的生长的抗生素的最低浓度(MIC)。与纸片扩散法中类似，将获得的结果与相关标准中含有的准则比较。获得的结果显示在表6中。

表6.使用E-测试测定的给定抗生素对于研究菌株的MIC值

。

表7. 根据EUCAST标准, 2010年的E-测试范围和MIC阈值

* S – 敏感； R – 抗性。

本研究中测定的MIC值与通过纸片扩散法获得的结果相关。当与其它菌株相比时发现用具体抗生素浸泡的纸片周围的生长抑制区更大的菌株被表征为较低MIC值，这意味着较低的抑制微生物生长的抗生素浓度，和因此较高的菌株对该药物的敏感性。

MIC值与通过纸片扩散法获得的结果的比较显示它们之间的高收敛度。关于已经证明高MIC值的细菌菌株，抗生素纸片周围的生长抑制区没有观察到或非常小。此类结果证明研究的菌株对于给定的抗生素是抗性的。将获得的MIC值与EUCAST准则(2010)中含有的MIC阈值(表7)比较。在此基础上，可以说，所有11种研究的菌株对于本研究中使用的抗生素都是抗性的。

实施例3.构成组合物的菌株对重金属的敏感性的测定

表8. 在水中可溶的重金属盐

。

为了获得金属储存溶液(浓缩的)(表8)：

● 以下盐的100 mM水溶液：As(III)、Cd(II)、Cr(VI)、Ni(II)、Zn(II)，

● Cu(II)的1 M水溶液

将金属盐的等分试样溶解在蒸馏水中，然后过滤通过孔径为0.22 μm的注射滤器。将制备的溶液储存在4℃。在该研究中，使用0.2 - 30 mM的范围内的重金属浓度。为了该目的，在临使用前，用适当体积的浓缩储存溶液补充液体培养基(营养液体培养基)至表9中对每种金属指定的终浓度。

表9. 营养液体培养基中金属盐溶液的浓度范围

。

通过MIC值的测定测试分离的菌株对重金属的敏感性。为了该目的，使用96孔滴定板(ROTH)。将150 μl NB中的金属盐溶液移液至每个孔，以便生成一系列渐增浓度的各金属(梯度)，然后以0.5 McFarland的密度用150 μl从每种菌株培养物获得的接种物接种它们。在8行的每一行(12个孔)中，存在不同浓度的根据表9的给定金属，而微量管的最后一行是阴性对照(具有盐水溶液的NB培养基，或具有金属储存液的NB，没有接种物)。

将板用塑料盖盖上，并额外包裹在玻璃纸薄膜中，从而保护它们免于蒸发。将它们在30℃在摇床(80转/min)中孵育。孵育24小时和48小时之后，在96孔的每个孔中测量培养物的光密度(OD₆₀₀)。使用“Sunrise”分光光度计(TECAN)进行测量。

测定抑制细菌生长的金属的最小浓度值(MIC)。没有观察到细菌生长的最低浓度被认为是MIC值。结果显示于表10中。

表10. 重金属对于研究菌株的MIC值

。

表11. 根据西班牙, 2003年对于模式菌株大肠杆菌(Escherichia coli)测定的MIC值

。

获得的结果说明了各金属的MIC值之间的很大差异。不幸地，在镉的情况下，测定MIC是不可能的。没有任何研究菌株能够甚至在培养基中镉盐的最低浓度下生长，尽管使用具有比其它金属低一个数量级的该元素浓度的溶液。在此基础上，可以得出结论，镉的毒性比实验中使用的其它重金属的毒性高得多。在表10中，使用的最低镉盐浓度作为MIC值给出。

获得的结果表明，研究的细菌菌株对于As(III)、Cu(II)、Cr(VI) 和Zn(II)是抗性的，对于Ni(II)半敏感，且对于Cd(II)敏感。应当强调，在砷和铬的情况下，使用它们被认为对活生物体最有毒性的形式(As III和Cr VI)，并且即使如此，与对于模式菌株的文献数据(表11)(西班牙，2003)相比，对于所有研究的菌株记录到高MIC值。

实施例4. 芳香族硝基化合物污染的土壤的生物除污的方法

细菌在补充有芳香族硝基化合物的液体培养基中的纯培养

本实验的目的是测定每种细菌菌株在补充有作为微生物的唯一碳源的芳香族硝基化合物(2-硝基苯酚)的液体培养基(M9)中的生长效率。将培养基中硝基化合物的初始浓度设定在100 mg/L。所有研究的菌株都显示在补充有还比液体培养物中使用的浓度加倍浓度(200 mg/L)的相同化合物的固体培养基(M9)上的非常良好的生长。

用微生物材料(细菌的纯培养物)接种小体积的培养基(约20 ml)。从环境中分离的细菌菌株在实验室条件下生长慢得多(延长的延滞期)，这是因为未知的营养需求和延长的适应时间。细菌单一培养物在平台摇床上在摇动的情况下在室温培养7天。在实验过程中，以每日间隔测量各培养物的光密度(OD₆₀₀)。结果显示于表12中。

实验后，对于各培养物计算相对于初始值的光密度的百分比变化(表12)，忽略最后结果(第7天，OD₆₀₀的减小)，其中，最可能地，培养基中营养物的耗尽，或者抑制微生物的进一步生长的毒性次级代谢产物的积累已经发生。

表12. 每种细菌菌株在补充有芳香族硝基化合物的液体培养基中的生长

。

结果的分析显示不同菌株的生长速率的显著差异。菌株4G、4P和6N的特征在于OD值的最大百分比增加，因此，可以得出结论，它们最适合于在实验中使用的条件。

在补充有芳香族硝基化合物的液体培养基中的混合的细菌培养物

许多文献数据表明，芳香族硝基化合物(包括单硝基苯酚)的有效降解需要细菌共生体的协同作用(Nielsen等人, 2006)。根据上述，决定应当制备包含分离的细菌菌株的混合培养物。开始基于这些菌株的混合培养物。将样品孵育2周。与先前实验类似，24 h后测量各培养物的光密度(OD₆₀₀)。获得的结果呈现在图1中，其显示细菌的混合培养物(11种菌株)在补充有芳香族硝基化合物的液体培养基(M9)中的生长。

实验生态系统中生物除污效率的测定

土壤制备

本研究中使用的土壤收获自位于距离道路和工厂相当距离且没有被芳香族硝基化合物污染的区域(后花园)的约20 cm的深度。

设置实验生态系统之前，在高压釜(0.7个大气压(atm.), 30 min)中将土壤灭菌三次，以降低土著微生物区系数目，其通过在灭菌处理前后接种土壤提取物的适当稀释度进行控制。

以200 mg/kg土壤的浓度用芳香族硝基化合物(2-硝基苯酚)污染制备的土壤。将土壤的等分试样(0.5 kg)置于椭圆形塑料容器中，并用具有小孔的盖子盖上(提供最佳的氧气条件)。

接种物制备

基于作为本发明目标的从用芳香族硝基化合物污染的环境分离的细菌菌株制备细菌接种物。在将2 ml盐水应用于它们上和用涂布器洗去细菌膜之后，从Petri皿收集细菌细胞的生物量。将细胞悬浮液定量地转移至无菌烧瓶中。测量悬浮液的光密度(OD₆₀₀)。将各自的OD₆₀₀值调整至约0.6的相似值。

土壤的接种

用细菌接种物接种用硝基化合物(浓度为1500 μg/L 的2-硝基苯酚)污染的土壤。接种物与培养基的体积比为1:10，其对应于10⁸个细胞/1 g干燥质量的土壤。将实验生态系统在约20℃的环境温度下在黑暗房间中孵育。不时地，将接种的土壤混合，以便提供适当的氧气条件。在整个30天孵育中，将水分含量保持在约50％的持水能力(WHC)。用足够体积的无菌蒸馏水补充失去的水。

生物除污效率的测定

用芳香族硝基化合物(2-硝基苯酚)污染的土壤的生物除污过程的效率(研究的土壤中硝基苯酚降低的评估)通过实施通过气相色谱-火焰电离检测器GC-FID测量硝基化合物的浓度来检查。将含量测定委托给“WESSLING”环境保护实验室(“WESSLING” Laboratory of Environmental Protection, http://pl.wessling-group.com/pl/uslugi/)，如同细菌数量测定一样。观察到由于污染物的生物降解作用导致的土壤中(实验生态系统中)2-硝基苯酚含量的相当降低。

对照样品(未接种的土壤)含有浓度为1500 μg/L的2-硝基苯酚，并且使其经受使用生物除污菌苗的生物降解过程已经导致应用的硝基芳烃含量的几乎3倍下降。此外，在研究的实验装置(与对照装置分开)中，记录到细菌数量从10⁵个细胞/ml (第1天)增加至约10⁸个细胞/ml (第30天)。

获得的结果表明，该方法的高效率和生物除污在实验室规模上的结果是令人满意的。

此技术方案的主要目标是，基于获得的菌株收集开发微生物菌苗以用于生物除污硝基化合物污染的土壤，以及评价实验生态系统中生物降解过程的效率。

基于用芳香族硝基化合物污染的区域的土著微生物区系，测定用于用这些异生素污染的土地的生物除污菌苗的组成，并且在实验生态系统中验证其效率。在该阶段之前进行研究，这导致选择最有效的单一培养物和细菌群(在补充有作为唯一碳源的芳香族硝基化合物的液体培养基上表现出生长最佳)。

污染土壤的生物除污过程的控制基于物理-化学和微生物学分析。实验生态系统中生物除污的效果是令人满意的。使用细菌接种物(11种菌株的集合)之后，在30天孵育期之后，实现了相对于对照样品(未接种的土壤)的污染的三倍降低。此外，在生物除污过程开始时和其完成后微生物数量的测定显示，使用的微生物的特征在于甚至在不利条件下(培养基中存在硝基芳烃)繁殖的良好能力。

此外，对于生物除污菌苗中包括的11株细菌，证明了在高浓度重金属和抗生素存在的情况下生长的能力，并且基于现有标准，这些菌株被认为是抗性的。考虑到以下事实：在污染土壤中经常报道的不仅有高浓度的多种有机异生素而且还有高浓度的重金属(Bahig和Altalhi, 2009)（重金属被认为是有机异生素生物降解过程的有效抑制剂(Silva等人, 2007)）以及抗生素或它们的代谢物，因此该技术方案对于土壤的生物除污过程的效率是非常有价值和重要的。

参考文献

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