一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保健品

摘要

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物及其制备方法，该组合物由以下重量份的原料制得：当归1～6重量份、牡丹皮1～4重量份、桃仁1～4重量份、杏仁1～4重量份、红花0.5～2重量份、白芷1～4重量份和葡萄籽提取物0.05～1重量份。发明提供的组合物包括当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷和葡萄籽提取物，各组分缺一不可，它们互相配伍，能够有效地降低酪氨酸酶的活性、对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用，使得该组合物的祛黄褐斑效果显著。发明提供了一种祛黄褐斑的保健品，由上述组合物和药学上可接受的辅料制成。发明还提供了一种组合物在制备祛黄褐斑的保健品中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于祛斑技术领域，尤其涉及一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保健品。

背景技术

黄褐斑属中医黧黑斑，是一种颜面部出现局限性淡褐色或褐色色素沉着的皮肤病，皮损为黄褐色或深褐色斑片，常对称分布于面颧部颊部，呈蝴形，或累及前额鼻口周和颏部呈不规则形状，好发于中青年女性。

中医学认为，黄褐斑实质上五脏六腑功能紊乱，气血不和，肝郁气滞，气滞血瘀、气血津液流通不畅及内分泌失调在面部的反映，此类疾病与机体的整体功能状态密切相关；以疏肝理气、养血活血、益肾健脾、清热消斑为治则。黄褐斑的发生与内分泌紊乱有关，且有研究证明，雌激素可刺激黑色素细胞分泌黑色素颗粒，孕激素能促进黑色素体的转运和增加黑色素量，最终导致色素沉着。黄褐斑的病因除了和内分泌紊乱有关外，日光照射也是一重要因素。过度光线照射后黄褐斑会加重，长期紫外线照射尤其是中波紫外线(UVB)能使黑色素细胞增值，黑色素量增加，因此避免日晒可使黄褐斑减轻乃至消退。

随着社会的发展，人们物质生活水平的提高，对美容的要求也越来越迫切，因此，开发一种祛黄褐斑的保健品具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保健品，本发明提供的组合物能够祛黄褐斑。

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：

当归1～6重量份、牡丹皮1～4重量份、桃仁1～4重量份、杏仁1～4重量份、红花0.5～2重量份、白芷1～4重量份和葡萄籽提取物0.05～1重量份。

优选地，当归3～4重量份。

优选地，牡丹皮2～3重量份。

优选地，桃仁1～3重量份。

优选地，葡萄籽提取物0.1～0.5重量份。

本发明提供了一种祛黄褐斑的保健品，由上述技术方案所述的组合物及药学上可接受的辅料制成。

优选地，所述保健品为颗粒剂、片剂或胶囊剂。

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物的制备方法，包括以下步骤：

将1～6重量份当归、1～4重量份牡丹皮、1～4重量份桃仁、1～4重量份杏仁、0.5～2重量份红花、1～4重量份白芷和60～400重量份的水混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物；

将所述中间产物和0.05～1重量份葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

优选地，所述浓缩至密度为1.1g/mL～1.2g/mL。

本发明提供了如上述技术方案所述的组合物在制备祛黄褐斑的保健品中的应用。

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：当归1～6重量份、牡丹皮1～4重量份、桃仁1～4重量份、杏仁1～4重量份、红花0.5～2重量份、白芷1～4重量份和葡萄籽提取物0.05～1重量份。。本发明提供的组合物包括当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷和葡萄籽提取物，各组分缺一不可，它们互相配伍，能够有效地降低酪氨酸酶的活性、对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用，使得该组合物的祛黄褐斑效果显著。

具体实施方式

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：

当归1～6重量份、牡丹皮1～4重量份、桃仁1～4重量份、杏仁1～4重量份、红花0.5～2重量份、白芷1～4重量份和葡萄籽提取物0.05～1重量份。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括当归1～6重量份，优选为3～4重量份。本发明对所述当归的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的当归即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，所述当归具有调节垂体-卵巢内分泌的功能，可以改善血液流变学及微循环；能够抑制酪氨酸酶活性的作用，从而延缓衰老体征的出现，给人以青春常驻之感。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括牡丹皮1～4重量份，优选包括牡丹皮2～3重量份。本发明对所述牡丹皮的来源没有特殊的限制， 采用本领域技术人员熟知的牡丹皮即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，所述牡丹皮性微寒，味苦辛，无毒，具有清血，活血散瘀的功能。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括桃仁1～4重量份，优选包括桃仁1～3重量份。本发明对所述桃仁的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的桃仁即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，所述桃仁富含的油脂，有利于润泽肌肤，保持人体活力；桃仁为治疗瘀阻病常用之品，有良好的活血通滞作用，能明显增加血流量，降低血管阻力，改善微循环和血液流变学状态。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括杏仁1～4重量份，优选包括2～3重量份。本发明对所述杏仁的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的杏仁即可，如可以采用其市售商品。现代研究证明，苦杏仁中所含的脂肪油可使皮肤角质层软化，润燥护肤，有保护神经末梢血管和组织器官的作用，并可抑杀细菌。此外，被酶水解所生成的HCN能够抑制体内的活性酪氨酸酶，消除色素沉着、雀斑、黑斑等，从而达到美容的效果。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括红花0.5～2重量份，优选包括红花1～1.5重量份。本发明对所述红花的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的红花即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，红花可以改善血液流变性，主要机制是改善了红细胞的功能，通过降低红细胞的聚集行，提高红细胞的变形能力及抗氧化、免疫粘附能力，减少自由基对红细胞的损伤，延长其寿命，维持血液粘度的正常，从而达到活血化瘀，通利血脉的良好效果。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括白芷1～4重量份，优选包括白芷2～2.5重量份。本发明对所述白芷的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的白芷即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，白芷味辛，性温，具有解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓功效。现代研究，白芷还能改善局部血液循环，消除色素在组织中过度堆积，促进皮肤新陈代谢，有美白功效。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括葡萄籽提取物0.05～1重量份，优选包括葡萄籽提取物0.1～0.5重量份。本发明对所述葡萄籽提取物的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的葡萄籽提取物即可，如可以采用其市售商品；在本发明的实施例中，所述葡萄籽提取物购买 于宣城市百草植物工贸有限公司。皮肤属于结缔组织，葡萄籽提取物中所含有的胶原蛋白和弹性蛋白对皮肤的整个结构起重要的作用，胶原蛋白的适度交联，可以维持皮肤的完整性，而体内自由基氧化可使其过度交联、在皮肤上表现为皱纹和囊泡，葡萄籽提取物可促使胶原蛋白的适度交联，有效清除自由基，从而保持皮肤柔顺、光滑。另外，弹性蛋白可使皮肤具有弹性，缺乏弹性蛋白的皮肤松弛无力，使人显得老态龙钟，弹性蛋白可被自由基或弹性蛋白酶所降解，葡萄籽提取物具有清除自由基，阻断弹性蛋白酶的产生并抑制其活性，从而改善皮肤健康状况。

在本发明的某些实施例中，本发明提供的祛黄褐斑的组合物由以下重量份的原料制得：

当归3重量份、牡丹皮2重量份、桃仁1重量份、杏仁3重量份、红花1重量份、白芷3重量份、葡萄籽提取物0.1重量份。

在本发明的某些实施例中，本发明提供的祛黄褐斑的组合物由以下重量份的原料制得：

当归4重量份、牡丹皮3重量份、桃仁3重量份、杏仁3重量份、红花2重量份、白芷2重量份、葡萄籽提取物0.5重量份。

在本发明的某些实施例中，本发明提供的祛黄褐斑的组合物由以下重量份的原料制得：

当归4重量份、牡丹皮2重量份、桃仁2重量份、杏仁2重量份、红花1重量份、白芷2重量份、葡萄籽提取物0.2重量份。

在本发明的某些实施例中，本发明提供的祛黄褐斑的组合物由以下重量份的原料制得：

当归1重量份、牡丹皮1重量份、桃仁1重量份、杏仁1重量份、红花0.5重量份、白芷1重量份、葡萄籽提取物0.05重量份。

在本发明的某些实施例中，本发明提供的祛黄褐斑的组合物由以下重量份的原料制得：

当归6重量份、牡丹皮4重量份、桃仁4重量份、杏仁4重量份、红花2重量份、白芷4重量份、葡萄籽提取物1重量份。

本发明提供了一种祛黄褐斑的保健品，由上述技术方案所述的组合物及药学上可接受的辅料制成。在本发明中，所述辅料优选包括微晶纤维素、预胶化淀粉、硬脂酸镁、玉米淀粉和小麦淀粉中的一种或多种。本发明对所述 辅料的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的上述辅料即可，如可以采用其市售商品。

本发明将上述技术方案所述保健品制成颗粒剂、片剂或胶囊剂。在本发明中，所述保健品为口服产品。

本发明还提供了一种祛黄褐斑的组合物的制备方法，包括以下步骤：

将1～6重量份当归、1～4重量份牡丹皮、1～4重量份桃仁、1～4重量份杏仁、0.5～2重量份红花、1～4重量份白芷和60～400重量份的水混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物；

将所述中间产物和0.05～1重量份葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

本发明将当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷和水混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物。在本发明中，所述当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷和水的质量比为(1～6):(1～4)：(1～4)：(1～4)：(0.5～2)：(1～4)：(60～400)，当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷和水的质量比优选为(3～4):(2～3)：(1～3)：(2～3)：(1～1.5)：(2～2.5)：(80～380)。本发明对所述当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷的来源和功能与上述技术方案所述当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷的来源和功能一致，在此不再赘述。

完成当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷和水的混合后，本发明将得到的混合物依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物。在本发明中，所述提取的温度优选为80℃～100℃，更优选为90℃～100℃；所述提取的次数优选为2次～5次，每次提取的时间优选为0.5小时～2小时。本发明将混合物进行提取，过滤得到滤液，将滤液进行浓缩；所述浓缩的温度优选为45℃～75℃，更优选为50℃～70℃；所述浓缩的真空度优选为-0.08MPa～-0.1MPa；滤液优选浓缩至密度为1.1g/mL～1.2g/mL。在本发明中，所述干燥的方式优选为喷雾干燥；所述喷雾干燥的进风温度优选为150℃～190℃，更优选为160℃～180℃；所述喷雾干燥的出风温度优选为80℃～120℃，更优选为90℃～110℃。

得到中间产物后，本发明将所述中间产物和葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。在本发明中，所述当归和葡萄籽提取物的质量比为(1～6):(0.05～1)，优选为(3～4):(0.1～0.5)。

本发明优选将得到的中间产物和葡萄籽提取物混合后，再加入药学上可 接受的辅料，得到祛黄斑的保健品。在本发明中，所述辅料的种类和来源与上述技术方案所述辅料的种类和来源一致，在此不再赘述。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的组合物在制备祛黄褐斑的保健品中的应用。

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：当归1～6重量份、牡丹皮1～4重量份、桃仁1～4重量份、杏仁1～4重量份、红花0.5～2重量份、白芷1～4重量份和葡萄籽提取物0.05～1重量份。。本发明提供的组合物包括当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷和葡萄籽提取物，各组分缺一不可，它们互相配伍，能够有效地降低酪氨酸酶的活性、对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用，使得该组合物的祛黄褐斑效果显著。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保健品进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

在以下实施例中，RPMI-1640购买于GIBCO公司；

胎牛血清购买于HyClone公司；

小牛血清购买于HyClone公司；

胰蛋白酶购买于上海华美生物公司；

MTT购买于Sigma公司；

B16黑色素瘤细胞株由华神集团提供；

Bio-Rad 550酶标仪由北京伯乐生命科学发展有限公司生产；

CK32倒置相差显微镜由日本OLYMPUS生产；

二氧化碳细胞培养箱的型号和生产厂家分别为BNA-311，ESPEC；

JA1003A型电子天平(精度1mg)由上海精天电子仪器有限公司生产；

80-2离心沉淀器由上海手术器械厂生产；

移液器购自芬兰雷勃Finnpipette；

石英紫外线杀菌灯购自扬州通达卫生器械有限公司。

实施例1祛黄褐斑的组合物的制备

取当归4g、牡丹皮2g、桃仁2g、杏仁2g、红花1g、白芷2g和260g水混合，进行提取3次，每次提取1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

实施例2祛黄褐斑的组合物的制备

取当归1g、牡丹皮1g、桃仁1g、杏仁1g、红花0.5g、白芷1g和110g水混合，进行提取3次，每次提取1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.05g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

实施例3祛黄褐斑的组合物的制备

取当归4g、牡丹皮3g、桃仁3g、杏仁3g、红花2g、白芷2g和340g水混合，进行提取4次，每次提取45min，将滤液浓缩至1.1g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.5g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

实施例4祛黄褐斑的组合物的制备

取当归6g、牡丹皮4g、桃仁4g、杏仁4g、红花2g、白芷4g和400g水混合，进行提取4次，每次提取45min，将滤液浓缩至1.1g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物1g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例1拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取牡丹皮2g、桃仁2g、杏仁2g、红花1g、白芷2g，加180g水，100℃提取2次，提取3次，每次提取1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例2拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取当归4g、桃仁2g、杏仁2g、红花1g、白芷2g，加水220g，100℃，提取3次，每次提取1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的保健品组合物。

对比例3拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取当归4g、牡丹皮2g、杏仁2g、红花1g、白芷2g，加水220g，100℃，提取3次，每次提取1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例4拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取当归4g、牡丹皮2g、桃仁2g、红花1g、白芷2g，加水220g，100℃提取3次，每次1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例5拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取当归4g、牡丹皮2g、桃仁2g、杏仁2g、白芷2g，加水240g，100℃提取3次，每次1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例6拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取当归4g、牡丹皮2g、桃仁2g、杏仁2g、红花1g，加水220g，100℃提取3次，每次1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例7拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取当归4g、牡丹皮2g、桃仁2g、杏仁2g、红花1g、白芷2g，加水260g，100℃提取3次，每次1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到祛黄褐斑的保健品组合物。

对比例8拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取桃仁2g、杏仁2g、红花1g、白芷2g、加水140g，100℃提取3次，每次1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例9拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取杏仁2g、红花1g、白芷2g，加水100g，100℃提取3次，每次1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将所述中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例10拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取当归4g、杏仁2g、红花1g、白芷2g，加水180g，100℃提取3次，每次1小时，将滤液浓缩至1.2g/mL；再进行喷雾干燥，得到中间产物；

将所述中间产物和葡萄籽提取物0.2g混合，得到祛黄褐斑的组合物。

实施例5

取实施例1～4任意一个实施例制备的祛黄褐斑的组合物，与辅料混合制粒后，得到祛黄褐斑的保健品。

实施例6

取实施例1～4任意一个实施例制备的祛黄褐斑的组合物，与微晶纤维素混合制粒后，充胶囊，得到祛黄褐斑的保健品。

实施例7

取实施例1～4任意一个实施例制备的祛黄褐斑的组合物，与小麦淀粉混合制粒后，充胶囊，得到祛黄褐斑的保健品。

实施例8

取实施例1～4任意一个实施例制备的祛黄褐斑的组合物，与玉米淀粉混合制粒后，充胶囊，得到祛黄褐斑的保健品。

实施例9

取本发明实施例1～4和对比例1～10制得的祛黄褐斑的组合物，检测对B16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用，实验设不添加祛黄褐斑的组合物的空白对照。实验方法为：

1.1培养液、消化液和缓冲液的配制：

1.1.1培养液的配制：

(1)RPMI-1640培养液(1000mL)：将RPMI-1640干粉溶于300mL三蒸水中，用水洗包装袋2次，倒入合并、搅拌，加三蒸水至近1000mL处：加NaHCO₃2g，补充谷氨酰胺至终浓度为3mmol/L，加入酚红(终浓度为5.3mg/L)；加入青霉素(100U/mL)和庆大霉素(50U/mL)，定容至1000mL；以NaOH或HCL调节pH值至7.2；过滤除菌，4℃保存；吸取配制好的RPMI-1640培养液2mL加入25mL的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置相差显微镜下观察有否染菌，未染菌的培养液方可进行实验；

(2)10％小牛血清的RMPI-1640培养液(100mL)：取配好的RPMI-1640培养液90mL，加入10mL小牛血清，以NaOH或HCI调节pH值至7.2，过滤除菌，4℃保存，吸取已配制的含10％小牛血清的RPMI-1640培养液2mL入25mL的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置相差显微镜下观察有否染菌，未染菌的培养液方可进行实验；

(3)10％胎牛血清的RMPI-1640培养液(100mL)：取配好的RPMI-1640培养液80mL，加入10mL胎牛血清和10mL Heper(终浓渡为5mM)；加入2-巯基乙醇(2-Me)至终浓度为50μmol/L，以NaOH或HCI调节pH值至7.2，过滤除菌，4℃保存，吸取配制好的含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液2mL入25mL的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置相差显微镜下观察是否染菌，未染菌的培养液方可进行实验。

1.1.2消化液的配制：

(1)母液配制：用无钙镁Hanks液配制0.25％的胰蛋白酶溶液，过滤除菌，4℃保存；用PBS配制0.04％的EDTA，10磅高压灭菌15分钟，4℃保存。

(2)应用液配制：取0.4mL 0.04％的EDTA，0.4mL 0.25％胰蛋白酶，加入无菌PBS到2mL，4℃保存。

1.1.3无机盐缓冲液的配制：

(1)PBS溶液(1000mL)：8g NaCI(137mmol/L)，0.2g KCI(2.7mmol/L)，1.15g Na₂HPO₄·7H₂O(4.3mmol/L)，0.2g>2PO₄(1.4mmol/L)溶于1L双蒸水中，调节pH值到7.2，高压灭菌，4℃保存备用。

(2)0.83％Tris-NH₄Cl溶液(500mL)：3.0275g>4Cl(0.83％)溶于250mL双蒸水中，两种溶液混合，加双蒸水，定容至500mL，高压灭菌，4℃保存备用。

1.2空白组、实验组和对照组对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响：

取对数生长期的B16黑色素瘤细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，采用80-2离心沉淀器在转速为1000rpm下，离心3min～5min，弃去上层清液；以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为5×10⁴个/mL；取0.1mL细胞悬液加入96孔细胞培养板，放在37℃、5％CO₂二氧化碳细胞培养箱中培养。

将本发明实施例1制备的保健品组合物用生理盐水配置成2000μg/mL的母液，121℃灭菌20min；将2000μg/mL的中药组合物母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度：0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000μg/mL(共21个梯度)加入贴壁生长4h的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔，取平均值。实验设空白对照，空白对照组用10 ％小牛血清的RMPI-1640培养液进行细胞培养。

在37℃、5％CO₂二氧化碳细胞培养箱中培养72小时；于细胞培养结束前5小时每孔弃去培养上清100μL，加入浓度为5mg/mL的MTT>

将不同对比例按上述对B16细胞增殖抑制的影响的方法处理，得出不同对照组对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响。

本发明采用MTT法测定本发明实施例1提供的祛黄褐斑的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖的影响，测试结果如表1所示，表1为本发明不同浓度的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响。

表1本发明不同浓度的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响(n-4,x±S)

根据表1可以看出，本发明实施例1制备的组合物在极低浓度时，可刺激B16黑色素瘤细胞的增殖；但当其浓度大于100μg/mL时，随浓度增高，则呈现出抑制作用，最佳抑制浓度为400μg/mL～500μg/mL之间，当本发明提供的保健品组合物浓度大于500μg/mL时，对B16黑色素瘤细胞增殖的抑 制作用不会再随着浓度增大而增加，其抑制效果达到最大。本发明实施例2～4制得的组合物的检测结果与此相似。

其中，固定浓度为400μg/mL比较实施例1和对比例1～10提供的祛黄褐斑的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响，测试结果见表2所示，表2为空白组、实施例1和对比例1～10对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响结果。

表2空白组、实施例1和对比例1～10对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响结果(n-4,x±S)

由表2可以看出：与空白组相比，实施例1及不同的对比例制备的祛黄褐斑的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖均有抑制作用。与实施例1相比，所有的对比例的抑制作用明显降低。另外，比较不同对照组的结果发现缺不同的药味对B16黑色素瘤细胞增殖抑制存在显著差异。

实施例10祛黄褐斑的组合物对酪氨酸酶活性的影响

取本发明实施例1～4和对比例1～10制得的祛黄褐斑的组合物检测对酪氨酸酶活性的抑制作用，实验设不添加祛黄褐斑的组合物的空白对照。培养液、消化液、无机盐缓冲液、母液的配制方法与实施例9相同，实验方法为：

取对数生长期的B16黑色素瘤细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000r/min离心3min～5min，弃去上层清液，以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为8×10⁴个/mL。取0.1mL细胞悬液加入96孔细胞培养板，放在37℃、5％CO₂饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。

将母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度：0、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL(共12个梯度)加入贴壁生长4h的细胞培养 体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔；在37℃、5％CO₂二氧化碳细胞培养箱中培养48小时，弃去上层清液，用pH值为7.4的PBS洗涤细胞2次，每孔加入50μL、1％TritonX-100；将96孔细胞培养板迅速放入-30℃冰箱，30min后取出，室温下自然解冻从而破坏细胞。37℃预温后加入1％L-多巴溶液(10μL/孔)，37℃反应2h，用酶标仪在490nm处读取OD值。

将不同对比例按上述对酪氨酸酶活性影响的方法处理，得出不同对比例对酪氨酸酶活性的影响。

本发明采用分光光度法测定本发明实施例1提供的组合物对酪氨酸酶活性的影响，测试结果见表3所示，表3为本发明不同浓度的组合物对酪氨酸酶活性的影响。

表3本发明不同浓度的组合物对酪氨酸酶活性的影响(n-4,x±S)

由表3可以看出，小鼠B16黑色素瘤细胞在经本发明提供的组合物作用48小时后，低浓度(＜100μg/mL)的保健品组合物对酪氨酸酶活性有一定促进作用，但随浓度增高，则对酪氨酸酶活性有明显的抑制作用。本发明提供的组合物浓度在150μg/mL～450μg/mL的范围内，能有效抑制B16黑色素瘤细胞株的酪氨酸酶活性。本发明实施例2～4制得的组合物的检测结果与此相似。

将400μg/mL作为空白组、实施例1和对比例1～10的试验浓度，观察空白组、实施例1和对比例1～10对酪氨酸酶活性的影响，测试结果如表4所示，表4为空白组、实施例1和对比例1～10对酪氨酸酶活性的影响结果。

表4空白组、实施例1和对比例1～10对酪氨酸酶活性的影响结果(n-4,x±S)

由表4可以看出：与空白组相比，实施例1及不同的对比例对于酪氨酸酶活性均有抑制作用。与实施例1相比，所有对比例抑制作用明显降低。另外，比较不同对比例的结果发现缺不同的药味对酪氨酸酶活性的影响存在显著差异。

实施例11祛黄褐斑的组合物对黑色素合成的影响

取本发明实施例1～4和对比例1～10制得的组合物检测对黑色素生成的抑制作用，实验设不添加组合物的空白对照。培养液、消化液、无机盐缓冲液、母液的配制方法与实施例9相同，实验方法为：

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000rpm离心3min～5min，弃去上层清液，以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为1×10⁵个/mL；取1mL细胞悬液加入24孔细胞培养板，在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养。

将母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度0～300μg/mL(共5个梯度，分别为：0、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL)加入贴壁生长4小时的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔，在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养96小时，0.25％胰蛋白酶消化细胞，每孔取1×10⁵个细胞离心弃去上层清液，加入1mL>

本发明的不同对比例制备的组合物对黑色素生成影响：将不同对比例按上述对黑色素生成影响的方法处理，得出不同对照组对黑色素生成的影响；

本发明提供的组合物对黑色素生成的影响结果如表5所示，表5为本发明不同浓度的组合物对黑色素生成的影响结果。

表5本发明不同浓度的组合物对黑色素生成的影响结果(n-4,x±S)

由表5可以看出：本发明组合物对小鼠B16黑色素瘤细胞作用4d后，测定黑色素含量，在100μg/mL以下，随浓度增加，黑色素含量不断增加；大于100μg/mL浓度时，随浓度增高，本发明提供的组合物可明显抑制黑色素的生成，当组合物浓度为100μg/mL时，其对黑色素生成的抑制达到最大；在100μg/mL～300μg/mL浓度之间时，对色素的抑制趋于平稳，说明继续增加本发明提供的组合物浓度对黑色素合成的影响不大。本发明实施例2～4制得的祛黄褐斑的组合物的检测结果与此相似。

将100μg/mL作为空白组、实施例1和对比例1～10的试验浓度，观察三组对黑色素生成的影响，测试结果见表6所示，表6为空白组、实施例1和对比例1～10对黑色素生成的影响结果。

表6空白组、实施例1和对比例1～10对黑色素生成的影响结果(n-4,x±S)

由表6可以看出，与空白组相比，实施例1及不同的对比例制备的祛黄褐斑的组合物对于黑色素生成均有抑制作用。与实施例1相比，所有的对比例的抑制作用明显降低。另外，比较不同对比例的结果发现缺不同的药味对 黑色素生成的影响存在显著差异。

黄褐斑的形成与酪氨酸酶的活性、黑色素瘤细胞的增殖、黑色素的生成密切相关，本发明组合物浓度适当时能够有效的降低酪氨酸酶的活性，并且对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用。在本发明拆方组实验的过程中，发现不同的拆方组的试验结果存在显著差异，说明不同的药味祛斑效果存在显著差异。综合以上结果，本发明提供的组合物对黄褐斑具有一定的防治作用，其作用靶点可能在于抑制黑色素瘤细胞的增殖、酪氨酸酶的生成和黑色素的生成；每种药味对祛斑均有一定的效果，为组合物中不可或缺的成分。因此，本发明提供的组合物可作为辅助祛斑类保健品使用。

由以上实施例可知，本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：当归1～6重量份、牡丹皮1～4重量份、桃仁1～4重量份、杏仁1～4重量份、红花0.5～2重量份、白芷1～4重量份和葡萄籽提取物0.05～1重量份。本发明提供的组合物包括当归、牡丹皮、桃仁、杏仁、红花、白芷和葡萄籽提取物，各组分缺一不可，它们互相配伍，能够有效地降低酪氨酸酶的活性、对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用，使得该组合物的祛黄褐斑效果显著。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。