一种抗天然牛γ-干扰素的单克隆抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用

摘要

本发明公开了一种抗天然牛γ-干扰素的单克隆抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用。本发明的一株能够稳定分泌抗天然牛γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为3D7，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC？No.9329，保藏日期为2014年6月25日。本发明采用牛γ-干扰素的真核表达载体免疫小鼠，以间接免疫荧光检测技术，筛选能产生针对天然牛IFN-γ的抗体的杂交瘤细胞株，成功解决了传统制备IFN-γ单克隆抗体只能与原核表达产物反应，却与天然IFN-γ无反应性等问题，为天然牛γ-干扰素的检测提供了新的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗牛γ-干扰素的单克隆抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应 用，特别涉及一种抗天然牛γ-干扰素的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株， 还涉及该中单克隆抗体在检测天然牛γ-干扰素(IFN-γ)中的应用。本发明属于生物 细胞学领域。

背景技术

干扰素(IFN)是在特定的诱生剂作用下由细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿 瘤和免疫调节功能等生物学活性的糖蛋白，分子量约为20～100kDa，一般由150～ 170个氨基酸组成，含有17种以上氨基酸，其中天冬氨酸，谷氨酸和亮氨酸含量 较高(Iiaacs等，1957)。根据基因序列和受体的不同，可以将IFN分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 型3种类型。Ⅰ型主要包括IFN-α、β，还有后来发现的IFN-ε、ψ、κ、δ、τ、ξ等， 是由成纤维细胞和上皮细胞被抗原刺激后分泌产生的(Sentsui等，2001)。Ⅱ型干 扰素即IFN-γ构成，是由抗原、有丝分裂素等活化免疫细胞，包括CD⁴⁺Th1、CD⁸⁺T 细胞及NK细胞所分泌，因此又称为免疫干扰素。Ⅲ型干扰素是新发现的一类细胞 因子，与Ⅰ型干扰素关系密切，称为IFN-λ(Donnelly等，2010)。Ⅰ型干扰素主 要表现为抗病毒、抗肿瘤的生物学活性；而Ⅱ型干扰素主要表现为免疫调节的生物 学活性(Kenji等，2001)。

IFN-γ基因均含有3个内含子和4个外显子，不同动物的外显子和内含子核 苷酸数量不同，但都属于分泌性蛋白，由5’端非编码区、信号肽编码区、多肽编码 区和3’端非编码区组成。人、猪和牛IFN-γ前体为166个氨基酸残基，其中前23 个氨基酸为信号肽，成熟蛋白大小为143个氨基酸。不同种类动物IFN糖基化位 点数目不同，天然牛IFN-γ在第25和97位的天冬酰胺存在2个糖基化位点(Joseph C, 1998)。尽管IFN-γ是否糖基化并不影响其在免疫调节方面的生物学活性，但会影响 其在动物体内的半衰期(Thiel等，2000)。IFN-γ通常形成二聚体形式，其单体形 式没有生物学活性。牛IFN-γ的活性状态一般以二聚体或四聚体的形式存在。

研究表明，内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状 态，而特异性抗原刺激引起的IFN-γ反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的 免疫指标。目前，IFN-γ体外检测试验不仅服务于基础研究，而且已经被广泛地应 用于临床免疫学(Rodriguz MF,1998)、疫苗免疫效果评估(Agger EM,2001)、器官 移植(Tary-Lehmann M,1998)、过敏反应(Kubota Y,1999)以及多种病原感染的诊断 (Benyoucef S,1997)。其中最重要的应用是牛羊结核病和副结核病的诊断(Walravens  K,2002；Kalis CH,2003)。许多学者对外周血T淋巴细胞对结核菌特异性抗原的IFN-γ 反应在结核病诊断中的应用进行了研究，结果表明，抗原特异性IFN-γ试验与传统 的结核菌素皮试试验(TST)相比有不少优点，由于IFN-γ试验是体外进行，无需 观察皮肤增生，结果的判断中包含的主观因素小，且整个检测过程只需要和被检动 物接触一次(Lalvani A,2004)。

对于IFN-γ的检测技术已经建立了多种方法，如酶联免疫吸附法，酶联免疫斑 点法，流式细胞术分析法等(Liebana E,1998；Asai T,2000；Numa Y,1991)，目前定量 检测方法中使用最广泛的是双抗体夹心ELISA。双抗体夹心ELISA方法检测灵敏 性的关键在于所用的针对IFN-γ的单克隆抗体与天然IFN-γ反应的亲和力大小。传 统制备IFN-γ单克隆抗体通常采用的是原核表达系统获得的IFN-γ纯化产物免疫小 鼠，进行杂交瘤细胞系的筛选，由此获得的绝大部分抗体能很好的与原核表达产物 反应，却与天然IFN-γ无反应性。这主要是由于原核表达系统获得的IFN-γ无糖基 化修饰，与天然IFN-γ结构上有较大差异造成。这一现象使得传统的单克隆抗体制 备方法在IFN-γ抗体的制备过程中效率非常低。本发明采用DNA免疫小鼠，以间 接免疫荧光检测技术，筛选能产生针对天然牛IFN-γ的抗体的杂交瘤细胞株，成功 解决了上述筛选效率低的问题，也为真核生物中其他有甲基化或糖基化修饰的蛋白 特异性抗体的制备提供了新的技术方法。

发明内容

为了解决现有技术中制备真核表达的糖基化修饰蛋白得到的单克隆抗体，获得 的抗体绝大部分只能与原核表达产物反应，不能与天然的糖基化蛋白反应，限制了 所获抗体的亲和力及应用价值等问题，本发明提供了一种利用真核表达产物免疫动 物后进行单克隆抗体的制备方法，并提供了一种抗天然牛γ-干扰素的单克隆抗体， 分泌该抗体的杂交瘤细胞株。

本发明采用TRIZOL法提取牛淋巴细胞总RNA，进而采用Access RT-PCR试 剂盒(Promega公司产品)一步法扩增牛IFN-γ(bIFN-γ)基因编码区的去信号肽片 段(命名为d-bIFN)，将d-bIFN片段连接到pET30b(﹢)载体，重组质粒命名为 p30b-bIFN。取小鼠的脾脏，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因 组DNA，按照说明书操作。以小鼠细胞基因组为模板，扩增IFN-γ的信号肽序列(命 名为MIE)，以重组质粒p30b-bIFN为模板，扩增牛IFN-γ的去信号肽片段d-bIFN。 将扩增获得的MIE及d-bIFN两个片段的PCR产物分别用Omega纯化试剂盒进行 纯化。利用纯化产物作为模板进行重叠PCR扩增，以将两个片段相连。片段ME-bIFN 经琼脂糖凝胶电泳分离后割胶回收，用T4DNA连接酶将ME-bIFN片段连接到 pcDNA3.1载体。用去内毒素中提质粒试剂盒制备免疫用的重组质粒p3.1-MbIFN， 免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。将真核表达质粒 p3.1-MbIFN瞬时转染CHO细胞，同时设转染空载体pcDNA3.1的对照组。建立间 接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，筛选的所有单克隆抗体株均能用 Western-blotting方法检测到与真核表达牛IFN-γ的反应性，但仅有3D7株只能与真 核表达的牛IFN-γ，而与牛IFN-γ原核产物无反应，所述的只能与真核表达的牛IFN-γ 反应的杂交瘤细胞株，命名为3D7，分类命名为：杂交瘤细胞株，保藏在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科 院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9329，保藏日期为2014年6月 25日。亚型鉴定结果表明单抗3D7株的抗体亚型为IgG1/κ。

进一步的，本发明还提出了由所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。以及

所述的杂交瘤细胞株或其分泌的单克隆抗体在制备检测天然牛γ-干扰素试剂 中的应用。

附图说明

图1为反转录PCR扩增牛IFN-γ编码序列的电泳结果；

M为DL2000Marker，1，2泳道均为扩增产物，片段长334bp；

图2为纯化后的重组蛋白rIFN的PAGE电泳分析结果；

M为蛋白Marker，泳道1为穿过液，泳道2、3、4为500mM咪唑三次洗脱 收获的蛋白样品；

图3为原核表达获得的重组蛋白rIFN的Western-bloting检测结果；

将纯化的重组蛋白rIFN进行PAGE电泳分离，转膜后先后用小鼠抗6His抗体 作为一抗，HRP标记的羊抗鼠二抗反应，显出条带与预期的重组蛋白rIFN大小一 致，约18kDa；

图4为小鼠IFN-γ的信号肽序列(MIE)和牛IFN-γ编码序列的去除信号肽片 段(d-bIFN)的PCR扩增结果；

M为DL2000Marker，(A)所示为MIE片段，长度113bp；(B)所示为d-bIFN 片段，长度333bp；

图5为重叠PCR扩增ME-bIFN片段的结果；

M为DL2000Marker，1，2泳道均为扩增产物，片段长420bp；

图6为小鼠用真核表达质粒p3.1-MbIFN五次免疫后抗体效价间接ELISA检测 结果；

图7为第一次融合后间接免疫荧光检测结果；

上方编号为鉴定为阳性克隆的命名，阴性对照使用SP20细胞培养上清作为一 抗；

图8为单抗腹水与牛IFN的反应性的Western-Blotiing检测结果；

M为蛋白Marker，泳道1为原核表达IFN-γ纯化产物，泳道2为转染空载 pcDNA3.1的CHO细胞裂解物，泳道3为转染真核表达质粒p3.1-MbIFN的CHO 细胞裂解物；

图9为单抗3D7的亚型鉴定。

每孔的反应结果代表的亚型已标注于图的左侧，结果表明单抗3D7株的亚型为 IgG1。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：原核表达质粒的构建及蛋白的表达与纯化

1、牛外周血淋巴细胞的分离及活化

牛颈静脉无菌采抗凝血，加入一倍体积Hank’s液，轻轻混匀，小心缓慢的加到 等体积的牛淋巴细胞分离液上。2000r/min离心20min，吸取分界面上的白色细胞 层，收集于另一离心管，用RPMI-1640洗两遍，1500r/min离心10min。将所收集 细胞用含10μg/ml伴刀豆球蛋白A(ConA，Sigma公司产品)的RPMI-1640培养液 悬浮，细胞密度约10⁷个、ml，于37℃、CO₂培养箱刺激培养8h。离心收集刺激后 淋巴细胞于离心管，PBS洗三遍，用于提取总RNA。

2、牛淋巴细胞总RNA的提取

培养的淋巴细胞用PBS洗三遍后离心沉淀，按照1ml溶解2.5×10⁶个细胞的量 加入TRIzol，轻轻吹吸混匀。室温放置10min使核蛋白复合体完全溶解，按每毫升 TRIzol加200μl氯仿，盖紧盖子，剧烈震荡15s，室温放置2～3min后于4℃12000 r/min离心10min。

小心吸取上层水相转移到新的离心管，加入等体积异丙醇，室温静置10min， 于4℃12000r/min离心10min。弃尽上清后，沉淀用75％乙醇洗两遍，室温吹干沉 淀(一般放置5～10min)，用DEPC水溶解RNA，琼脂糖凝胶电泳分析提取RNA 的质量，紫外分光光度计测定浓度后置于﹣80℃保存备用。

3、牛IFN-γ基因编码区的扩增

采用Access RT-PCR试剂盒(Promega公司产品)一步法扩增牛IFN-γ(bIFN-γ) 基因编码区的去信号肽片段(命名为d-bIFN)。引物序列：IF-F(BamHI)： 5’-catGGATCCccagggccaattttttagag；IF-R(SalI)：5’-catGTCGACcgttgatgctctccggc(大 写字母部分表示限制性内切酶识别位点序列)。扩增体系为：DEPC处理水11μl、 AMV/TFI 5×Buffer 5μl、引物IF-F 1μl(50pmol)、引物IF-R1μl(50pmol)、2.5mM  dNTP 2μl、25mM MgSO₄1μl、AMV反转录酶0.5μl、TFI DNA聚合酶0.5μl、总 RNA 3μl(0.5μg)。RT-PCR扩增程序为：48℃反转录45min，94℃2min后进入循 环(94℃1min；56℃1min；72℃0.5min)，扩增40个循环后，72℃5min， 扩增完成后4℃保存，产物用琼脂糖凝胶电泳分析结果如图1。

4、原核表达质粒的构建及蛋白表达纯化

将RT-PCR扩增获得的d-bIFN片段用Omega纯化试剂盒进行纯化，纯化产物 用限制性内切酶(Thermo公司产品)BamHI和SalI双酶切处理，原核表达载体pET30 b(﹢)作同样的双酶切处理。酶切体系按照产品说明书配制，于37℃消化4h。琼 脂糖凝胶电泳回收酶切产物，用T4DNA连接酶(Thermo公司产品)将d-bIFN片 段连接到pET30b(﹢)载体，重组质粒命名为p30b-bIFN。连接体系参照说明书配制， 于22℃连接4h。

连接产物转化DH5α，挑取单菌落培养，提取质粒后用BamHI和SalI双酶切鉴 定转化子，酶切出约333bp大小片段的为阳性克隆，挑选两个阳性克隆送测序公司 进行序列测定，序列与预期100％相符的克隆保留下来，重组质粒命名为p30b-bIFN。 将此重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，挑取单菌落接种于LB培养基， 37℃200r/min振摇培养过夜。取过夜培养物按1︰100的比例转接至200ml新鲜 LB培养基，37℃200r/min振摇培养至菌液OD₆₀₀＝0.6时，加入终浓度为1mM的 IPTG诱导目的蛋白表达，于16℃200r/min振摇培养24h。

离心收集诱导菌液，用10ml结合缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl)重 悬菌体，利用压力破碎仪(压力参数设置为26Kpsi)破碎裂解菌体。裂解液于4℃ 12000r/min离心20min，转移上清，0.45μm滤器过滤上清。取2ml镍离子亲和层 析树脂(Ni Sepharose 6Fast Flow，GE公司产品)匀浆(含树脂1ml)于干净的空 柱(BioRad公司产品)中，加入5倍柱床体积去离子水流过树脂，再用5倍柱床体 积结合缓冲液平衡树脂。加入过滤后的样品上清，待其流尽后，用20倍柱床体积 的结合缓冲液流过树脂，洗去样品中的杂蛋白。用3倍柱床体积的洗脱缓冲液(20 mM Tris-HCl，150mM NaCl，500mM咪唑)洗脱重组蛋白rbIFN-γ，分3次洗脱， 分别收集洗脱样品，SDS-PAGE电泳分析各个样品，结果如图2所示。

rbIFN-γ纯化产物用抗6His抗体验证：将纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳 分离，用半干转移电泳仪将蛋白从凝胶电转至硝酸纤维素膜，转膜条件为电压15V， 时间30min。转上蛋白的硝酸纤维素膜以10％的脱脂乳封闭，TBST洗膜，加抗His 标签单克隆抗体(5000倍稀释)37℃、70r/min结合2h，洗膜，之后加入辣根过氧 化物酶标记的山羊抗兔IgG(5000倍稀释)，37℃、70r/min结合2h，TBST洗膜， 充分洗涤后用DAB底物液显色，鉴定表达产物。结果如图3所示。

实施例2：真核表达质粒构建

小鼠细胞基因组的提取：取小鼠的脾脏，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取 试剂盒(天根生化科技有限公司产品)提取基因组DNA，按照说明书操作。

以小鼠细胞基因组为模板，扩增IFN-γ的信号肽序列(命名为MIE)，引物为： EXIF-U：5’-gatGGTACCatgaacgctacacactgcatc；EXIF-OR： 5’-ttcttcaaATGATGATGATGATGATGaatgactgtgccgtggcag(下划线部分是重叠PCR的 互补序列)，使用Pfu高保真DNA聚合酶(Fermentas公司产品)。扩增体系为：灭菌 水26μl、5×Buffer 5μl、引物EXIF-U 2μl(20umol)、引物EXIF-OR 2μl(20umol)、 dNTP(2.5mM)4μl、DNA聚合酶1μl、基因组DNA 5μl。扩增程序为：95℃预变 性5min后进入循环(95℃30sec；56℃30sec；72℃18sec)，扩增30个循环 后，72℃5min，扩增完成后4℃保存。

牛IFN-γ编码序列的去除信号肽片段(命名为d-bIFN)的扩增：以重组质粒 p30b-bIFN(实施例1构建)为模板，扩增牛IFN-γ的去信号肽片段d-bIFN。扩增所 用引物为EXIF-OF：5’-CATCATCATCATCATCATttgaagaattggaaagatgaaagtg(下划线 部分是重叠PCR的互补序列)；EXIF-D：5’-gatCTCGAGttacgttgatgctctccggc，使用Pfu 高保真DNA聚合酶(Fermentas公司产品)，扩增体系为：灭菌水26μl、5×Buffer 5μl、 引物EXIF-OF 2μl(20umol)、引物EXIF-D 2μl(20umol)、dNTP(2.5mM)4μl、 DNA聚合酶1μl、质粒DNA(1ug/ml)1μl。扩增程序为：95℃预变性5min后进入 循环(95℃30sec；54.5℃30sec；72℃45sec)，扩增30个循环后，72℃5min， 扩增完成后4℃保存。MIE及d-bIFN片段的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析结果见图4。

将扩增获得的MIE及d-bIFN两个片段的PCR产物分别用Omega纯化试剂盒 进行纯化。利用纯化产物作为模板进行重叠PCR扩增，以将两个片段相连。扩增所 用的外侧引物为EXIF-U及EXIF-D。扩增体系分两份，(1)灭菌水33.5μl、5×Buffer 5μl、dNTP(2.5mM)3μl、MIE片段(30ug/ml)1.5μl、d-bIFN片段(27ug/ml) 6μl、DNA聚合酶1μl。(2)灭菌水31μl、5×Buffer 5μl、引物EXIF-U 4μl(20umol)、 引物EXIF-D 4μl(20umol)、dNTP(2.5mM)5μl、DNA聚合酶1μl。扩增程序 为：将体系(1)先扩增，95℃预变性1min后进入循环(95℃30sec；55℃30sec； 72℃1min 10sec)，扩增5个循环后，72℃延伸10min。然后将配好的体系(2) 加到体系(1)中充分混匀，再分为两管继续扩增，95℃预变性1min后进入循环 (95℃30sec；56.5℃30sec；72℃1min 20sec)，扩增25个循环后，72℃延 伸10min，扩增完成后4℃保存。扩增获得的PCR产物(命名为ME-bIFN)琼脂糖 凝胶电泳分析结果见图5。

片段ME-bIFN经琼脂糖凝胶电泳分离后割胶回收(Omega胶回收试剂盒)，回 收产物用核酸内切酶(Thermo公司产品)KpnI和XhoI双酶切处理，真核表达载体 pcDNA3.1用同样的内切酶处理，酶切体系按照产品说明书配制，于37℃消化4h。 琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，用T4DNA连接酶(Thermo公司产品)将ME-bIFN 片段连接到pcDNA3.1载体。连接体系参照说明书配制，于22℃连接4h。

连接产物转化DH5α，挑取单菌落培养，提取质粒后用KpnI和XhoI双酶切鉴 定转化子，酶切出约420bp大小片段的为阳性克隆，挑选两个阳性克隆送测序公司 进行序列测定，保留序列与预期100％相符的克隆，重组质粒命名为p3.1-MbIFN。

实施例3：动物免疫

小鼠免疫前断尾采血，分离血清，作为阴性对照。用去内毒素中提质粒试剂盒 (Omega公司产品)制备免疫用的重组质粒p3.1-MbIFN，免疫剂量为每只小鼠100 μg质粒DNA，左右大腿各注射50μg。具体操作如下：首先将小鼠大腿内侧肌肉的 毛用酒精打湿，用微量进样器(上海安亭微量进样器厂，规格为100μl)吸取适量 体积的去内毒素质粒溶液(含100μg质粒)，于小鼠左右腿内侧肌肉各分两点进行 注射(插入深度为2mm～2.5mm，注意避免肌肉扎穿或扎的深度不够)。注射时要 缓慢，注射后停几秒再取出针头，以防止漏液。注射后，将小鼠大腿外侧的毛打湿， 将活体基因导入仪(宁波新芝生物科技股份有限公司产品，型号WJ-2002)的电夹 夹在大腿打湿的两侧，电压调至100V，触动电击按钮，可观察到小鼠因电击而全 身抖动，即完成一次电击。将导入仪的正负极调换，再次触动电击按钮，进行第二 次电击。另一侧已注射质粒的大腿按以上操作进行同样的电击处理。

免疫15天后进行加强免疫，免疫的操作过程同上，此后每间隔15天进行一次 加强免疫。三免后第14天对小鼠进行断尾采血，分离血清，检测效价，此后每次 免疫后第14天采血并分离血清，利用原核表达的牛IFN-γ作为包被原建立的间接 ELISA方法检测免疫效价。在第五次免疫后，免疫效价达到预期(图6所示)，取 小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合。

实施例4：细胞融合

1、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)的准备：

从液氮罐中取出骨髓瘤细胞冻存管，放入37℃水浴锅中至完全融化；1000r/min 离心3～5min；倒弃上清液，用完全培养基(RPMI-1640，添加20％的胎牛血清及 1％的青链霉素双抗)将下沉的细胞吹散悬浮，加入有适量营养液的细胞培养瓶中， 混匀后置37℃、5％CO₂培养箱中培养。次日观察骨髓瘤细胞的生长情况，如为圆形、 透亮且呈轻微贴壁生长，则说明骨髓瘤细胞生长良好；如发现有些细胞发暗，漂浮 于液体中，则可以换液，弃去漂浮的死亡细胞，存活的细胞大部分可贴壁生长并增 殖。当细胞长满单层时1︰3传代培养，一直扩大培养至细胞融合所需细胞量(每 次融合需要约1.5×10⁵个SP2/0细胞)。

在融合之前将PEG、40ml终止液(基础1640)和HAT培养基(RPMI-1640， 添加20％的胎牛血清、1％的青链霉素双抗及1％的HAT)放入37℃温箱预热备用。

2、饲养细胞的制备：

取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。四肢固定后， 先撕开皮肤，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管2～3ml(视 老鼠大小而定)RPMI-1640基础液注入小鼠腹腔，吸打几次，将液体吸出放于50ml 离心管。重复用RPMI-1640基础液盥洗一次，收集的液体中含小鼠腹腔巨噬细胞。 1000r/min离心10min弃去上清，沉淀细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃、5％CO₂培养箱中待用。

3、免疫脾细胞的制备：

取免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％ 酒精中浸泡5～10min消毒。将消毒好的老鼠固定于解剖板上，剪开皮肤露出腹膜， 再小心剪开腹膜，暴露出脾脏，镊子夹出脾脏，用剪刀去掉脾脏上粘连的脂肪组织， 剪破脾脏外膜，放入灭菌的匀浆器中。往匀浆器中加入5ml RPMI-1640基础液，研 磨，挤压出脾细胞，补加10ml RPMI-1640基础液。静置2min后，吸取5ml上层 细胞悬液于另一无菌的50ml离心管。再补加10ml RPMI-1640液于匀浆器中，吹 吸混匀后静置2min，吸取10ml上层细胞悬液于离心管中，再重复以上步骤一次。 收集的液体含免疫小鼠脾细胞，于1000r/min离心10min，弃去上清，细胞沉淀重 悬后计数。

4、细胞融合：

将1×10⁷～2×10⁷个SP2/0细胞与1×10⁸个免疫细胞(两者比例为1︰5～1︰10) 于50ml离心管中混匀，1000r/min离心8min。弃尽上清，并用用灭菌的滤纸吸干 残留液体，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动，便于PEG对细胞的作用均匀。将 装有细胞混合物的离心管底部浸于37℃水浴中，在1min内慢慢加入0.8ml预温至 37℃的50％PEG溶液(Sigma公司产品)，边加边轻轻用吸管尖搅拌。加完PEG溶 液后继续搅拌30s。静置30s后，缓慢加入10ml预温的RPMI-1640基础液。加入 速度严格控制：第1分钟逐滴滴入1ml，第2分钟加l ml，第3～4分钟加3ml，第 5分钟加5ml，匀速加入，并不断的轻轻搅拌。最后再加入30ml RPMI-1640液。 于1000r/min离心5min，弃上清，用含饲养细胞的HAT培养基将此融合后的细胞 悬浮，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250μl/孔。一 次融合接种于4块96孔板中。于37℃、5％CO2培养箱中培养。

实施例5：杂交瘤细胞筛选及克隆化

1、细胞株的筛选：

细胞融合后第二天开始观察，有无污染，第4天吸去100μl培养基，加入100μl HT培养基(RPMI-1640，添加20％的胎牛血清、1％的青链霉素双抗及1％的HT)。 待细胞单个集落清晰可见时，将一个孔内有多个集落的孔进行单集落化。具体操作 如下，将带显示屏的倒置显微镜(EVOS fl，美国AMG公司产品)搬至超净工作台 内，观察96孔细胞培养板中集落的分布，选定有多集落的孔后，用毛细吸管将视 野中某个集落的细胞尽量全部吸出。毛细吸管应提前将一头烧出弯度，以方便操作， 并在使用前进行高压灭菌。吸出的细胞转移至新96孔细胞培养板的孔中，孔中需 预先添加200μl HT培养基。如此反复，将多集落孔中的集落分别转移，以保证每 个生长出来的集落能在第一次筛选时单独检测到是否分泌所需抗体。待细胞集落长 至培养孔的1/4～1/3，培养基略变黄时，吸取培养上清进行间接免疫荧光的检测。

2、间接免疫荧光检测阳性细胞株：

用高糖DMEM(Gibco公司产品)的完全培养基(添加10％胎牛血清及1％青 链霉素双抗)培养CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)，培养至所需数量时，将其消化 后铺96孔细胞培养板，使细胞约铺满孔的60～70％。生长约12h后，待细胞长满孔 的80％时，将真核表达质粒p3.1-MbIFN瞬时转染CHO细胞，同时设转染空载体 pcDNA3.1的对照组。使用的转染试剂为SignaGen公司产品PolyJet体外DNA转染 试剂，操作步骤按照说明书中一般转染的流程进行。转染后12h换维持培养基(高 糖DMEM，添加2％胎牛血清及1％青链霉素双抗)，继续培养24h后弃去上清，用 PBS溶液洗涤细胞两遍。用80％丙酮(﹣20℃预冷30min)于室温固定细胞10min， 弃去固定液，用PBS洗涤三遍，每次浸泡5min。转染重组质粒p3.1-MbIFN和空载 体pcDNA3.1的细胞分别加入待检的杂交瘤培养上清；设一组阳性对照孔，分别加 入免疫小鼠的血清(即前面所述的阳性血清；1︰50倍稀释)；一组阴性对照孔，分 别加入小鼠免疫前的血清(即前面所述的阴性血清；1︰50倍稀释)。加样后细胞板 置于37℃温育30min，弃去上清后PBS洗三遍；加入异硫氰酸荧光素(FITC)标 记的羊抗鼠IgG(Sigma公司产品，1︰100倍稀释)，37℃温育30min，PBS洗三遍， 在荧光显微镜下观察细胞荧光现象。如阴性对照组无可见荧光现象，阳性对照组的 空载体pcDNA3.1孔无可见荧光，且阳性对照组的重组质粒p3.1-MbIFN孔出现明显 荧光，则实验结果成立；培养上清使转染重组质粒p3.1-MbIFN的CHO细胞显荧光， 同时与转染空载体pcDNA3.1的CHO细胞反应不显荧光的杂交瘤细胞株即为阳性克 隆(如图7所示)。

3、杂交瘤细胞的克隆化

根据检测结果挑选阳性孔的细胞，用有限稀释法进行亚克隆。克隆前根据上述 方法取健康小鼠的腹腔巨噬细胞制备饲养细胞层，制备好饲养细胞，用HT完全培 养基重悬后置于温箱中备用。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细 胞计数板计算活细胞数。根据计数结果将细胞用HT完全培养基稀释到5、10、50 个细胞/ml。将以上三个浓度的细胞悬液分别加入96孔培养板，100μl/孔，使每孔 分别含0.5、1和5个细胞。杂交瘤细胞铺孔完成后再将饲养细胞滴加到孔里。

培养到第4天添加HT完全培养基一滴，第5～6天仔细观察各孔内细胞的生长 情况，并记录。在克隆后第7～9天，细胞克隆长满孔的1/4～1/3时，再用上述间 接免疫荧光法检测。若检出细胞生长孔有相应抗体，可选择抗体效价高，呈单个集 落生长，细胞形态良好的孔，继续同法再亚克隆。此次亚克隆后，若所有长出细胞 的孔用间接免疫荧光法检测结果都为阳性，则可挑选单集落、细胞形态良好的孔建 株。

实施例6：杂交瘤细胞的冻存

将定株的杂交瘤细胞分别从96孔中转移至24孔扩大培养，待细胞长满后收集 细胞于离心管中，混匀后进行细胞计数，于1000r/min离心8min，弃去上清，根据 计数结果，加入适量的4℃预冷的细胞冻存液(40％DMEM，50％胎牛血清， 10％DMSO)重悬细胞，使细胞终浓度为2～3×10⁶个/ml。每个细胞冻存管中加入 1ml细胞悬液，放入细胞冻存盒(美国NALGENE公司产品)中，然后于﹣70℃冰 箱降温过夜，最后转入液氮罐中长期保存。

实施例7：腹水的制备

取8～10周龄的小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，注射剂量0.5ml/只。7～10 天后腹腔分别注射各定株的杂交瘤细胞，注射量为5×10⁵～10⁶/只，一般一个24孔 细胞板的细胞长满后，收集的细胞量足够。注射后一天观察小鼠状态，7～10天后， 当看到小鼠腹部明显鼓胀后抽取腹水，1000r/min离心8min离心取上清，即为各株 单抗对应的小鼠腹水。

实施例8：腹水与真核表达牛IFN-γ(天然牛IFN-γ)反应性验证(Western-blotting)

CHO细胞铺六孔板，细胞汇合程度达到约80％时分别转染重组质粒p3.1-MbIFN 和空载体pcDNA3.1，具体操作如实施例5中所述。转染后36h，弃培养上清，用 PBS洗涤细胞一遍，每个孔加入100ul细胞裂解液(上海碧云天)，用细胞刮子将 细胞刮下，吸于1.5ml离心管中，反复吹打后于冰上静置使样品产生的泡沫消去。 每个样品加入25ul蛋白Loading Buffer(Fermentas公司产品)，混匀后沸水浴10min。 待样品置于冰上完全冷却后于10000r/min离心1min，取上清进行PAGE电泳。用 半干转移电泳仪将蛋白从凝胶电转至硝酸纤维素膜，转膜条件为电压15V，时间30 min。转上蛋白的硝酸纤维素膜以10％的脱脂乳封闭，TBST洗膜，加各株单抗对应 的小鼠腹水(1000倍稀释)，于37℃、70r/min结合2h，TBST洗膜，之后加入Dylight 680标记的羊抗鼠二抗(KPL公司产品；10000倍稀释)，于37℃、70r/min结合 1h，TBST洗膜，充分洗涤后用红外荧光扫描仪(ODYSSEY，美国Li-cor公司产品) 观察并记录结果，筛选的所有单克隆抗体株均能用Western-blotting方法检测到与真 核表达牛IFN-γ的反应性，但仅有3D7株只能与真核表达的牛IFN-γ，而与牛IFN-γ 原核产物无反应，3D7株的Western-blotting检测结果如图8所示。

所述的3D7株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在 北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No. 9329，保藏日期为2014年6月25日。

实施例9：单抗3D7株的亚型鉴定(ELISA)

用SouthernBiotech公司的抗体亚型鉴定试剂盒SBA Clonotyping System-HRP (货号5300-05)对单抗3D7株进行亚型的鉴定分析。方法如下：用1ml双蒸水溶 解15mg ABTS底物粉剂制备成ABTS底物保存液，避光保存于2～8℃。将捕获抗 体用PBS缓冲液(pH7.4)稀释至5～10ug/ml的浓度，取0.1ml加入ELISA板的孔 内。于4℃湿润的环境中温育12h后，弃掉孔内液体，用含0.05％吐温的PBS洗涤 三遍。弃掉孔内洗涤液后，每孔加满含1％BSA的PBS溶液，室温孵育至少1h， 孵育时保持轻微振荡。弃掉液体后，洗涤三遍。每孔加入杂交瘤细胞的培养上清， 0.1ml，室温孵育1h，孵育时保持轻微振荡。弃掉液体后，洗涤三遍。稀释各个亚 型对应的酶标抗体，往ELISA板中对应的孔内每孔加入0.1ml酶标抗体。室温孵育 1h，孵育时保持轻微振荡，弃掉板内液体后洗涤五遍。10ml柠檬酸盐缓冲液(pH4.0) 中加入0.2ml ABTS底物保存液配成底物液，每孔加入0.1ml底物液在室温放置 10～20min进行显色。于OD450读取吸光度值。

如图9和表1所示，检测结果表明单抗3D7株的抗体亚型为IgG1/κ。

表1.单抗3D7的亚型鉴定(OD450)。

IgG3 IgG2b IgG2a IgG1 IgA IgM κ λ 0.336 0.08 0.111 1.516 0.088 0.1 1.438 0.186

序列表