同时表达猪α干扰素和猪γ干扰素的重组腺病毒

摘要

本发明涉及一种重组病毒，所述重组病毒对口蹄疫病毒显示抑制效果。更具体地，涉及一种重组腺病毒，所述重组腺病毒通过口蹄疫2A基因的插入来同时表达猪α干扰素和γ干扰素，以能够一次性处理猪α干扰素和γ干扰素，从而能够增强对口蹄疫病毒的抑制效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组病毒，所述重组病毒对口蹄疫病毒显示抑制 效果。更具体地，涉及一种重组腺病毒，所述重组腺病毒通过口蹄疫 2A基因的插入来同时表达猪α干扰素和γ干扰素，以能够一次性处 理猪α干扰素和猪γ干扰素，从而能够增强对口蹄疫病毒的抑制效果。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease；FMD)为感染于偶蹄动物的病 毒水疱性疾病，其特征在于，复制快，传播快。这种疾病由于经济重 要性，由国际兽疫局(OIE)被分类为A类(ListA)疾病，在国家之 间的畜产品的贸易中，为起到非常重要的作用的因素。病原体为单链 的正义RNA病毒，属于病毒科(Piconaviridae)口蹄疫病毒(Aptho  virus)属，分为七个不同的血清型(A、O、C、Asia1、SAT1、SAT 2、SAT3)。

将口蹄疫发作(outbreak)时作为防御对策而使用的紧急疫苗(E  mergency vaccination)接种于猪时，平均过七天后，形成对口蹄疫病 毒感染的防御能力(J.S.Salt et al，1998，Vaccine 16:746-754)。然 而，猪依靠疫苗形成抗体慢，并且排出的病毒量比牛明显多。并且， 猪被感染后会在24小时内，将病毒从呼吸器官排出，因此，接种疫 苗后到产生防御能力之前，病毒传播的危险性会更高。

因此，对其的对策为提出口蹄疫病毒抑制剂。其中，将重组腺病 毒用作传递系统的包含α干扰素的I类型干扰素使用于口蹄疫中而有 效防御口蹄疫病毒的研究结果被报道之后(Chinsangaram，J.et al.，2 001，Journal of Virology 75:5498-5503)，确认过将表达γ干扰素的 重组腺病毒与表达α干扰素的腺病毒混合而使用的情况下，能够得到 提高的抑制效果(Maraes MP et al.，2007，Journal of Virology 81: 7124-7135)。α干扰素是最广为人知的直接的病毒抑制物质，γ干扰 素是在辅助T细胞(T-helper cell)和天然杀伤细胞(natural killer c  ell)中起着诱导分泌细胞因子(cytokine)的作用，从而显示对病毒 的直接或间接的抑制效果。由此，虽然同时使用α干扰素和γ干扰素 有利于多种免疫诱导，但是γ干扰素的抗病毒效果相对于α低，因此 单纯地混合使用时，存在抑制效率降低的问题。

一方面，口蹄疫病毒2A序列是在口蹄疫病毒基因中发生自切割 (self cleavage)的部分，在插入于基因中时，基因转录后引起自切 割，使其能够表达两个蛋白质。报道称2A序列与具有相似作用的内 部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site，IRES)序列相比， 不仅基因大小小，而且由于基因被切割，从而形成两个蛋白质的效率 高9倍。(SH Ha et al，2010，Plant biotech，8:928-938)。

发明内容

要解决的技术问题

对此，本发明人希望通过使用对现有动物最适合使用，并且对抑 制效果的可能性大的干扰素，以更低的费用和简便的方法开发出一种 在动物中能够更有效地抑制病毒的抑制剂并提出，如果通过插入口蹄 疫2A序列能同时表达猪α干扰素和猪γ干扰素，则具有能够一次性 处理这些干扰素的效果，从而确认了能够更有效地提供抑制口蹄疫病 毒的效果，由此完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供一种能够同时表达猪α干扰素和 γ干扰素的重组病毒。

技术方案

为了达到上述目的，本发明提供一种重组腺病毒或质粒，所述重 组腺病毒或质粒包含按照猪α干扰素、口蹄疫病毒2A及猪γ干扰素 基因的顺序排列的SEQ ID NO：2的碱基序列。

有益效果

本发明的重组腺病毒可以同时表达猪α干扰素和猪γ干扰素，从 而能够可以一次性地处理猪干扰素α和猪γ干扰素，并且，比起将这 些各个干扰素单独使用或混合使用，能够更经济并且简便地使用，能 够提供更高效率更高水准的抑制口蹄疫病毒的效果。

附图说明

图1示出用于生产能够同时表达猪α干扰素和γ干扰素的重组腺 病毒的设计策略。

图2是在重组腺病毒中，通过利用蛋白质印迹法(Western blot) 来确认猪α干扰素及γ干扰素的表达的照片。

图3是对重组腺病毒各滴度口蹄疫病毒的抑制程度进 行比较的图表。

图4是示出同时表达猪α干扰素和γ干扰素的重组腺病毒与分别 单独表达的重组腺病毒相比，在小鼠中抑制口蹄疫病毒的效果增强的 图表。

最佳实施方式

本发明提供一种重组病毒，所述重组病毒将猪α干扰素和猪γ干 扰素的基因插入到一个基因中，并且将口蹄疫2A序列插入到上述干 扰素基因之间，从而使两种干扰素能够同时表达。尤其，可以将腺病 毒载体用作病毒载体。

并且，本发明提供一种蛋白质表达载体，所述蛋白质表达载体将 猪α干扰素和猪γ干扰素的基因插入到一个基因中，并且将口蹄疫2 A序列插入到上述干扰素基因之间，从而使两种干扰素能够同时表 达。尤其，可以将质粒用作蛋白质表达载体。

由于本发明的重组病毒或质粒可以同时表达猪α干扰素和猪γ干 扰素，因此，与单独使用或混合使用干扰素相比，可以更经济且简便 地使用，并且可以更有效地抑制口蹄疫病毒。

并且，本发明提供一种包含上述重组病毒或质粒的口蹄疫病毒抑 制剂。在适用相同滴度时，本发明的重组病毒与利用分别表达α干扰 素和γ干扰素的重组病毒相比，显示出显著高的抑制口蹄疫病毒的效 果，因此，本发明的重组病毒可以用一个病毒显示出两种效果，并且 能够用少的滴度提供相同的效果，从而可以用作效果增加的新的口蹄 疫抑制剂。并且，与利用分别表达α干扰素和γ干扰素的重组病毒相 比，使用一半的重组病毒滴度，从而能够节约两倍的经济费用，并能 够获得简便性，同时还可以减少由于接种高滴度的病毒而有可能出现 的副作用。并且，从干扰素的广泛的抗病毒效果来看，预期能够适用 于各种病毒疾病。

具体实施方式

以下，将通过下述实施例更加具体地说明本发明。这些实施例仅 是为了加强对本发明的理解而提出的，本发明的权利范围并不限定于 这些实施例，可以实施本领域通常已知的变形、取代及插入等，并且 这些内容也包含在本发明的范围中。

[实施例1]重组腺病毒的制作

在CMV启动子的后面插入猪α干扰素和猪α干扰素序列，并且 在两个基因之间插入口蹄疫病毒2A基因，从而使它们同时表达，对 此已在图1中示出。

对其进行更具体的说明如下：猪α干扰素基因以猪干扰素α1提 取基因库no.NM_214393的遗传信息，猪γ干扰素基因提取基因库 no.AY293733的遗传信息，并将SEQ ID NO：1示出的口蹄疫病毒2 A序列(CAGCTGTTGAACTTTGACCTGCTCAAGTTGGCAGGAGA CGTCGAGCCCAACCCTGGGCCC:SEQ ID NO：1)配置在两个猪 干扰素基因之间，从而将SEQ ID NO：2所示的基因通过(株)柏 业(Bioneer)来进行合成。此时，在合成基因序列的5'末端中插入N heI限制酶部位，在3'末端中插入XbaI限制酶部位，从而使其可以进 行克隆，并且去除α干扰素部分的终止密码子，并且在γ干扰素的3 '末端配置终止密码子。并且，为了干扰素基因部分在猪中的有效的蛋 白质表达，对密码子选择(codon usage)进行了评价。

<用于同时表达猪α干扰素和γ干扰素的基因序列(两末端包含 NheI,XbaI限制酶序列；SEQ ID NO：2)>

ATTTGCTCTCTGGGCTGTGATCTGCCACAGACCCACAGCCT GGCTCACACCCGGGCCCTG

CGGCTCCTGGCACAGATGCGGAGAATATCCCCGTTTTCCTG TCTGGACCACCGAAGGGAC

TTCGGATCCCCTCATGAGGCTTTCGGGGGCAACCAGGTACA GAAGGCTCAGGCCATGGCT

CTGGTGCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTTCAGCTCTTCAG CACAGAGGGCTCGGCTGCG

GCCTGGAATGAGAGCCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGAC TGGATCAGCAGCTGCGCGAT

CTGGAAGCCTGCGTCATGCAGGAAGCAGGGCTGGAAGGG ACCCCCCTGTTGGAGGAAGAC

TCCATCCTGGCTGTGCGGAAGTACTTCCACAGGCTCACCCT CTATCTGCAAGAGAAGTCC

TACAGCCCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCCGAGGTGA TGCGCTCGTTCTCTTCCAGC

AGAAACCTGCAGGATAGACTTCGCAAGAAGGAGCAGCTGT TGAACTTTGACCTGCTCAAG

TTGGCAGGAGACGTCGAGCCCAACCCTGGGCCCATGAGCT ACACAACTTATTTCTTAGCC

TTTCAGCTTTGCGTGACTTTGTGTTTCTCCGGCTCTTACTGC CAGGCGCCCTTTTTTAAG

GAGATCACGATCCTAAAGGACTATTTTAACGCAAGTACCTC AGATGTCCCTAACGGTGGC

CCTCTTTTCTTAGAAATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAG TGACAAGAAAATCATCCAG

AGCCAGATCGTTTCCTTCTACTTTAAATTCTTTGAGATCTTC AAAGACAACCAGGCCATT

CAAAGGAGTATGGACGTGATTAAGCAAGACATGTTTCAGC GCTTCCTTAACGGTAGCTCT

GGCAAACTGAATGACTTCGAGAAGCTGATTAAAATCCCGG TTGATAATCTGCAGATCCAG

CGCAAAGCGATCAGCGAACTCATCAAGGTGATGAATGATCT GTCACCACGTTCTAACCTA

AGGAAGCGGAAGCGAAGTCAGACAATGTTCCAGGGCCAG AGAGCATCAAAATAATCTAGA

为了制作重组腺病毒，通过NheI、XbaI限制酶对pShuttle载体 (clontech)进行基因克隆后，通过基因测序(Sequencing)进行确认 。然后，通过利用PI-Sce I和I-Ceu来切断该克隆的pShuttle载体质 粒和对于非常罕见的PI-Sce I和I-Ceu的限制酶位点，并将线性化的 目的基因片段结扎(ligation)于Adeno-X病毒性DNA(PI-Sce I和I-Ceu 预处理)中。接着，利用限制酶Swa I进行处理，从而去除没有产生 插入的自我连接(self-ligation)或非重组腺病毒DNA。之后进行转 化(transformation)和基因准备(prep)，从而选择重组的质粒(欲表 达的基因与腺病毒DNA进行重组)。将确认的基因用Pac I酶进行 处理，从而使线性化后，转染(transfection)至293A细胞。在细胞 中能看到80％以上的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，就表示 收获重组腺病毒。生产的腺病毒利用维生素腺病毒净化迷你试剂盒 (Virabind Adenovirus Purification Mini Kit(Cellbiolabs公司))只对 病毒进行精制后测定滴度(TCID₅₀)并保存。

[实施例2]确认猪α干扰素或γ干扰素的表达

为了确认猪α干扰素及γ干扰素在重组腺病毒中的表达与否，使 用了蛋白质印迹法。实施蛋白质印迹法的前一天，准备IBRS-2(猪 肾脏细胞)置于75cm²的烧瓶中，待第二天形成90％的细胞单层后将 稀释的约1×10⁸组织培养感染量(TCID)的腺病毒分别接种于新的培 养基中。接种48小时后，回收培养基并通过超滤离心过滤器(Amic  on ultracentrifugal filter(密理博公司))来进行浓缩后适用于蛋白质 印迹。为了对蛋白质表达进行比较，对表达猪α干扰素的腺病毒(A d-porcine IFN-α)、表达猪γ干扰素的腺病毒(Ad-porcine IFN-γ)、同 时表达猪α干扰素和γ干扰素的腺病毒(Ad-porcine IFN-αγ)一起进 行实验。为了确认猪α干扰素，将抗-IFN-α单克隆抗体K9(Thermo  scientific)稀释500倍后使用；为了确认猪γ干扰素，将抗-猪IFN-γ 多克隆抗体(Thermoscientific)稀释500倍后使用。通过利用ECL^TM主要(Prime)蛋白质印迹检测试剂(通用电气医疗集团生命科学 部(GE healthcare life science))来进行显色，通过利用LAS 4000 凝胶成像系统(通用电气医疗集团生命科学部)来得到图像，并将其 在图2中示出。

[实施例3]利用酶联免疫吸附试验(ELISA)的猪α干扰素或γ 干扰素的定量和蛋白质的确认

通过利用猪α干扰素酶联免疫吸附试验试剂盒(Enzyme-linked i  mmunosorbent assay)(Uscn生命科学有限公司)和猪γ干扰素酶联 免疫吸附试验试剂盒(Thermosicentific)对上述制备的重组腺病毒中 表达的猪α干扰素和γ干扰素进行定量。其结果如表1所示。

表1

如上述表1中所示，确认了在1×10⁴滴度的Ad-猪IFNαγ中表达 出与在Ad-猪IFN-α或Ad-猪IFN-γ中表达的蛋白质量同等水准的蛋 白，并确认了，在Ad-猪IFNαγ中，像所预计的一样，α干扰素和γ 干扰素均被表达。

[实施例4]重组腺病毒的各滴度的口蹄疫病毒抑制程度评价(试 管内分析)

对重组腺病毒的各滴度的口蹄疫病毒抑制程度进行评价。为此， 准备IBRS-2(猪肾脏细胞)并置于75cm²的烧瓶中，待第二天形成9 0％的细胞单层时，按各滴度进行10倍的阶段稀释而接种重组腺病毒。 第三天除去上层液后，接种600TCID₅₀的口蹄疫病毒，接种1小时 后，替换培养基。接种口蹄疫病毒48小时后，回收上层液并使用实 时反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)对口蹄疫病毒的复制数进行 测定。通过使用以口蹄疫的3D部分作为目的的上游引物5'-GGAAC YGGGTTTTAYAAACCTGTRAT-3'(SEQ ID NO：3)、反义引物5'- CCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGA-3'(SEQ ID NO：4)和探针5'- FAM-CCCADCGCAGGTAAAGYGATCTGTA-TAMRA-3'(SEQ ID  NO：5)和ABI7500荧光定量PCR系统(Real-time PCR system(应 用生物系统(Applied Biosystems))来实施实时RT-PCR。(Su-Mi K  im et al.，Multiple shRNAs driven by U6and CMV promoter enha  nces efficiency of antiviral effects against foot-and-mouth disease vir  us，2010，Antiviral Research 87:307-317)。本结果在图3中示出。

如图3所示，Ad-猪IFNαγ与滴度值无关，示出比Ad-猪IFN-γ 优异的口蹄疫病毒抑制效果，在1000TCID₅₀以下，示出比Ad-猪IF  N-α优异的口蹄疫病毒抑制效果，尤其在100TCID₅₀中与Ad-猪IFN- α及Ad-猪IFN-γ比较，可以确认提供显著优异的口蹄疫病毒抑制效 果。

[实施例5]根据重组腺病毒的口蹄疫病毒抑制效果评价(活体内 分析)

为了进行本实验，按每实验组15只或14只(空载体(Ad-null) 对照组)，共准备59只6日龄的ICR小鼠个体，对每个个体接种2× 10⁷TCID₅₀的腺病毒。接种24小时后接种250LD₅₀口蹄疫病毒，然后 观察七天生存率，结果如图4中所示。

如在图4中可以确认，进行观察结果，从初期的第三天开始，接 种Ad-猪IFNαγ的小鼠组(80％生存率)比接种Ad-猪IFN-α(60％生 存率)或Ad-猪IFN-γ(33％生存率)的接种组表现出更高的生存率， 在接种第七天，Ad-猪IFNαγ表现出约40％的生存率，相反，Ad-猪I FN-α和Ad-猪IFN-γ接种组示出约20％的生存率。因此，在小鼠实验 中也已证明了接种本发明的产物Ad-猪IFNαγ时，与分别单独接种相 同滴度的干扰素时相比，表现出提高的口蹄疫抗病毒效果。

序列目录自由文本

SEQ ID NO：1:口蹄疫病毒2A序列

SEQ ID NO：2:用于同时表达猪α干扰素和γ干扰素的基因序 列(两末端包含NheI、XbaI限制酶序列)

SEQ ID NO：3:用于RT-PCR的上游引物的序列

SEQ ID NO：4:用于RT-PCR的反义引物的序列

SEQ ID NO：5:用于RT-PCR的探针的序列