检测I型志贺毒素双抗夹心法酶联免疫试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种检测I型志贺毒素(StxI)双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及其应用。本发明通过杂交瘤技术共获得4株针对StxI？A亚单位的单克隆抗体，并将制备的4株单克隆抗体彼此配对，从中筛选出非竞争性的两株单抗，分别为8E7-E6和2F6-F8，制备双抗体夹心法ELISA试剂盒，所制备的试剂盒能够特异性检测StxI，具有很好的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及试剂盒领域，具体涉及一种检测I型志贺毒素(StxI)双抗夹心 酶联免疫检测试剂盒及其应用。

背景技术

肠出血性大肠杆菌感染是一种食物源性传染性疾病，国外俗称为“汉堡病”， 其病原为肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)，其典型菌株为 EHEC O157:H7，主要表现症状为出血性结肠炎、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔 等严重胃肠道并发症，在儿童和老年人中还可引起溶血性尿路综合症(haemolytic  uraemic syndrome，HUS)和血栓性血小板紫癜(thrombocytpenic purpura，TTP) 等全身性并发症。HUS和TTP的病情凶险，病死率高。据报道，由于O157:H7 感染力强，耐酸，100-200个O157细菌就能突破胃酸屏障，在肠道内大量繁殖， 引起人感染此病，而其它致病性大肠杆菌需要100万个细菌以上才能引起发病。 由于该菌对人的致病力强、可造成后遗症、预后差和目前国内外尚无特效疗法而 引起世界各国的高度重视。

研究表明，EHEC感染的主要致病机理可分为两个方面，一是由菌体基因组 毒力岛LEE(Locus of Enterocyte Effacement)编码的多种致病因子所介导的粘附 抹平机制(Attaching and Effacing,A/E)，通过A/E机制，细菌可破坏肠上皮细 胞，粘附并定植于肠道；二是分泌志贺毒素(Shiga toxin,Stx)，Stx可以穿越破 损的肠上皮细胞进入血液循环，与其受体-丙糖酰基鞘氨醇Gb3或丁糖酰基鞘氨 醇Gb4结合，造成肠道、中枢神经系统等器官的损伤，特别是Gb3受体含量较 高的肾脏，受损后易引发HUS，危及生命；该毒素分为StxI和StxII两个亚型。 针对志贺毒素的研究，以往主要集中在StxII上，因为临床上StxII较StxI更能 引起HUS。然而，由StxI引起的HUS还是经常被报道，本发明制备的抗体及检 测试剂盒填补了此方面的空白。

临床上检测O157:H7的常用方法包括细菌的分离培养法、免疫学方法、PCR 扩增技术。细菌培养发展得比较成熟，因其所需设备要求不高，己成为基层最常 用的方法，但操作复杂、费时，不能做到早期诊断。PCR虽然快速、敏感性和 特异性高，但需特异性基因，目前除rfbE基因特异性较高外，大部分与其他微 生物具有一定的同源性，特异性还不理想。免疫学方法因其灵敏性、特异性和可 视性广泛用于临床疾病的诊断与监测，特别是ELISA检测，敏感性高、操作简 便，配套仪器设备的发展使操作程序规范化和自动化，并进一步提高了稳定性， 被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其它体液中微量蛋白成分、细胞 因子等。但是目前免疫学方法检测O157:H7的候选抗体尚不理想。

为了提供一种以StxI为靶向的快速、易操作的诊断EHEC感染的方法，本发 明制备多株针对StxI的单克隆抗体，从中筛选出非竞争性的两株单抗，分别为 8E7-E6和2F6-F8，制备双抗体夹心法ELISA试剂盒。本发明制备的双抗体夹心 法ELISA试剂盒能够特异性检测StxI，具有很好的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗StxI的单克隆抗体或其片段，包括轻链 CDR1-3和重链CDR1-3，其特征在于，所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：12所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13所示；

进一步，所述轻链CDR1-3的核苷酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：52所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：53所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：54所示；

所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：14所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：15所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：16所示。

进一步，所述重链CDR1-3的核苷酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：55所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：56所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：57所示。

本发明的目的在于提供一种抗StxI的单克隆抗体8E7-E6，所述的单克隆抗 体8E7-E6的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基 酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。 所述单克隆抗体8E7-E6的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、 CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO： 6所示。

进一步，所述的单克隆抗体8E7-E6的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区 CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO：46、SEQ ID  NO：47、SEQ ID NO：48所示。所述单克隆抗体8E7-E6的重链蛋白质分子可 变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID  NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51所示。

所述单克隆抗体8E7-E6包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列 表中SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID  NO：9、SEQ ID NO：10所示。

本发明的目的在于提供一种抗StxI的单克隆抗体2F6-F8，所述的单克隆抗 体2F6-F8的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基 酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13 所示。所述单克隆抗体2F6-F8的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、 CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、 SEQ ID NO：16所示。

进一步，所述的单克隆抗体2F6-F8的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区 CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO：52、SEQ ID  NO：53、SEQ ID NO：54所示。所述单克隆抗体2F6-F8的重链蛋白质分子可变 区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO： 55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57所示。

所述单克隆抗体2F6-F8包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列 表中SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID  NO：19、SEQ ID NO：20所示。

本发明的目的在于提供一种检测I型志贺毒素的ELISA试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒中的抗体或其片段轻链CDR1-3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1-3 或11-13，重链CDR1-3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4-6或14-16。

进一步，所述ELISA试剂盒为双抗夹心法ELISA试剂盒，所述包被抗体为 8E7-E6单克隆抗体，所述检测抗体为2F6-F8单克隆抗体。

进一步，试剂盒还包括下列试剂中的一种或几种：辣根过氧化物酶底物缓冲 液、蛋白标准品StxI、阴性对照样品、底物、BSA、PBS+0.05％Tween 20洗液、 封闭液、终止液。

本发明的目的在于提供上述单克隆抗体或其片段、ELISA试剂盒在制备检测 I型志贺毒素中的应用。

本发明的目的在于提供上述的单克隆抗体或其片段在制备治疗I型志贺毒素 所引起疾病的药物中的应用。

本发明的优点：本发明提供的抗体特异性靶标StxI，所制备的双抗夹心ELISA 试剂盒仅识别I型志贺毒素，而不识别II型志贺毒素，具有很好的临床应用价值。

附图说明

图1.从杂交瘤细胞中抽提的总RNA

图2.MHV11/MHCG1引物组合扩增的条带

泳道1为Lane1vk；泳道2为lane2vh；泳道3为marker

图3.MHV2/MHCG1引物组扩增的条带

泳道1为Lane1vk；泳道2为lane2vh；泳道3为marker

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解 为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和 宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范 围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1抗StxI单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

实验方法

1、Balb/C小鼠免疫

I型志贺毒素A亚单位重组蛋白(StxIA)免疫5周龄雌性Balb/c小鼠，100 μg/只，首次免疫，100μg抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，腹腔注射；第3 周后用等量抗原与不完全佐剂混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐剂。

2、脾细胞与骨髓瘤细胞的融合

融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0至OPTI-MEM培养基(含10％的 胎牛血清)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，融合前3天，将细胞传代一次。 融合当天，收获骨髓瘤细胞，计数，把5.0×10⁷骨髓瘤细胞用无血清培养基洗涤 2次备用。小鼠经第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、处死。无菌操作取出小 鼠脾脏，置灭菌平皿中，分离脾细胞，计数，备用。

把等同于小鼠1/2脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，1300rpm离心5min，尽 可能去除上清液。在1.5分钟内加入1.5ml的50％的PEG，边加边摇匀；然后在 8.5分钟内加入20ml的无血清培养基，边加边摇匀。

把经PEG融合的细胞1000rpm离心5分钟，除去上清液，加150ml的HAT 选择培养基重悬，将融合细胞接种至无菌96孔板150μl/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养4天，每孔补加100μl选择培养基。

3、杂交瘤细胞的筛选和克隆

融合后10天，从每孔中吸50μl上清，加到包被有StxIA的96孔ELISA板 (用1％的BSA封闭)，室温孵育1.5小时；洗2次。稀释辣根过氧化物酶 (Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠1:2000，每孔加50μl，室温 孵育1.5小时；洗涤4次。每孔加入100μl HRP底物(H₂O₂+TMB)，室温孵育 0.5小时，每孔加入100μl 2M H₂SO₄，测A450nm值。对于阳性克隆，继续下面 的实验。

收集阳性孔细胞，重悬于HT选择培养基中，采用有限稀释法稀释细胞，并 种植于96孔细胞培养板中，5天后观察，对确定只有一个细胞克隆生长的孔， 作ELISA进行鉴定。对阳性孔细胞进行有限稀释，经过3-4次单细胞分离培养， 直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。大量培养杂交瘤细胞，收集含有抗体的培养上 清，用protein G亲和层析柱进行纯化，并透析到PBS中，测浓度，-20℃冻存 备用。

通过上述杂交瘤技术共获得4株针对StxIA亚单位的单克隆抗体，分别为 1H2-G7，2H1-C12，8E7-E6和2F6-F8。

实施例2双抗体夹心ELISA选择最佳抗体配对

应用双抗体夹心ELISA法，让实施例1制备的4株抗体彼此配对，选出最佳 组合以利于毒素检出，具体方法如下：

1、单抗的包被

用0.1M的NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液(pH 9.6)稀释抗体浓度至10μg/ml，加入至 96孔酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜，用PBST(在PBS中加入0.05％的Tween-20) 洗1次，加入5％的牛奶4℃封闭过夜，用PBST洗1次，-20℃冻存备用。

2、单抗与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)的偶联

把单抗透析至PBS中，调节浓度至1mg/ml。应用北京泰天和生物科技有限公 司的产品活化辣根过氧化物酶进行偶联，具体操作参照其公司说明书。在HRP 标记抗体中加入50％的甘油，-20℃冻存备用。

3、ELISA操作

用含有1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS稀释纯化的 StxI至浓度为10μg/ml，每孔加入100μl，于37℃水浴孵育1小时，用PBST 洗涤5次。用含有1％BSA的PBS按照1:1000稀释HRP酶标抗体，按照4株抗体 彼此配对的原则，于相应孔中加入100μl酶标抗体，于37℃水浴孵育1小时， 用PBST洗涤5次后，每孔中加入100μl TMB+H₂O₂底物，室温孵育20分钟，每 孔加入100μl 2M的硫酸终止反应，于450nm处测定OD值。具体结果如表1所 示。

表1

从表中结果可以看出，只有8E7-E6/2F6-F8组合，并且只有当8E7-E6作为 包被抗体，而2F6-F8作为检测抗体时，其检测毒素的OD值最高，达到1.435， 而其它组合的OD值均较低。由于上述获得的4株单抗的表位均位于毒素的A亚 单位，当两个抗体同时与该抗原结合时，存在着空间位阻。而只有当8E7-E6作 为捕获毒素的抗体、且2F6-F8作为检测抗体时，可能其彼此之间的阻碍最小， 因此显示的OD值也最高。

实施例3单克隆抗体8E7-E6/2F6-F8重、轻链同种型(Isotype)的鉴定

使用SouthernBiotech公司的SBA Cloning System/HRP同种型鉴定试剂盒 (5300-05)，用PBS，pH 7.4，稀释山羊抗小鼠(H+L)抗体至10μg/ml，加至 ELISA酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜。弃包被液，用含有0.05％Tween 20 的PBS(PBST)洗涤3次，每孔加入200μl的1％的BSA，4℃封闭过夜。用PBST 洗涤3次，于12个孔中每孔加入100μl杂交瘤培养上清液，置于37℃水浴中 孵育1小时，用PBST洗涤3次。用含有1％BSA的PBS按1:500分别稀释HRP标 记的山羊抗小鼠二抗，其特异性如下：重链为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，轻 链为κ、λ，每个特异性二抗加入2个孔，每孔100μl，置于37℃水浴中孵 育1小时，用PBST洗涤5次。每孔加入100μl底物(TMB+H₂O₂)，室温放置20 分钟，每孔加入2M H₂SO₄100μl终止反应，置于450nm下测量吸光度。具体结 果见表2。

表2

酶标二抗 IgG₁IgG_2aIgG_2bIgG₃κ λ OD_450nm(8E7-E6) 1.353 0.095 0.065 0.087 1.900 0.075 OD_450nm(2F6-F8) 1.367 0.099 0.085 0.091 1.675 0.086

从上表列出的结果可以看出，单克隆抗体8E7-E6/2F6-F8的重、轻链同种型 分别为：重链的同种型为G1，而轻链的同种型为κ。

实施例4单克隆抗体8E7-E6/2F6-F8重、轻链可变区基因的克隆

取对数生长期的杂交瘤细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA， 用oligo(dT)20为引物，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增 其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入pMD-18T载 体，测序、进行序列分析。具体操作步骤如下：

1、总RNA抽提

操作方法参照Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA说明书。提取总RNA后 进行电泳检测，结果见图1。

电泳结果显示RNA没有降解。

2、cDNA合成

以抽提的总RNA为模板，oligo(dT)20为引物，逆转录合成cDNA。反应体系 如下：

试剂 用量 oligo(dT)20(500μg/ml) 1μl RNA 10μl dNTPs mix(10mM each) 1μl

65℃孵育5分钟，然后快速置于冰上3分钟，加入以下成分：

试剂 用量 5×first-strand buffer 4μl DTT(0.1M) 2μl RNA酶抑制剂(40U/μl) 1μl 逆转录酶(200U/μl) 1μl ddH₂O 补平至20μl

42℃孵育50分钟，然后70℃孵育15分钟灭活逆转录酶。

3、PCR扩增单抗重、轻链可变区基因VH和VL

扩增VH的引物是：

SEQ ID NO：21MHV1：5’ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC3’

SEQ ID NO：22MHV2：5’ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT3’

SEQ ID NO：23MHV3：5’ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT3’

SEQ ID NO：24MHV4：5’ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT3’

SEQ ID NO：25MHV5：5’ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT3’

SEQ ID NO：26MHV6：5’ATGGCTTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC 3’

SEQ ID NO：27MHV7：5’ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT 3’

SEQ ID NO：28MHV8：5’ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG 3’

SEQ ID NO：29MHV9：5’ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG 3’

SEQ ID NO：30MHV10：5’ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG 3’

SEQ ID NO：31MHV11：5’ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG 3’

SEQ ID NO：32MHV12：5’ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG 3’

SEQ ID NO：33MHCG1：5’CAGTGGATAGACAGATGGGGG 3’

扩增VL的引物是：

SEQ ID NO：34MKV1：5’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG 3’

SEQ ID NO：35MKV2：5’ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG 3’

SEQ ID NO：36MKV3：5’ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG 3’

SEQ ID NO：37MKV4：5’ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG 3’

SEQ ID NO：38MKV5：5’ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC 3’

SEQ ID NO：39MKV6：5’ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG 3’

SEQ ID NO：40MKV7：5’ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG 3’

SEQ ID NO：41MKV8：5’ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG 3’

SEQ ID NO：42MKV9：5’ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG 3’

SEQ ID NO：43MKV10：5’ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT 3’

SEQ ID NO：44MKV11：5’ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC 3’

SEQ ID NO：45MKC：5’ACTGGATGGTGGGAAGATGG 3’

兼并密码子：R＝A or G Y＝C or C M＝A or C K＝G or T S＝C or G W＝A  or T H＝A or C or T B＝C or G or T V＝A or C or G D＝A or G or T N＝A  or C or G or T。

反应体系如下：

试剂 用量 ExTaq(5U/μl) 0.25μl 10×buffer(Mg++free) 5.0μl MgCl2(25mM) 4.0μl dNTPs(2.5mM each) 4.0μl 上游引物(10μM) 1.0μl 下游引物(10μM) 1.0μl cDNA 2.0μl ddH₂O 补平至50μl

扩增条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec；56℃退火30sec；72℃ 延伸1min，共30个循环。

对于单抗8E7-E6，重链可变区，只有MHV11/MHCG1引物组合能够扩增出阳性 条带，对于轻链可变区MKV5\MKC引物组合能够扩增出阳性条带，条带大小均为 450bp左右(如图2)。对于单抗2F6-F8，重链可变区，只有MHV2/MHCG1引物 组合能够扩增出阳性条带，为450bp左右，对于轻链可变区MKV3\MKC引物组合 能够扩增出阳性条带，条带大小均为430bp左右(如图3)。

4、PCR产物的测序

根据大连TAKARA公司TA克隆试剂盒说明书，将单抗8E7-E6/2F6-F8重、轻 可变区基因PCR产物插入pMD-18T载体,送公司测序。结果显示：8E7-E6VH核 苷酸序列见序列表SEQ ID NO：10，8E7-E6VH氨基酸序列见序列表SEQ ID NO： 8；8E7-E6VK核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：9，8E7-E6VH氨基酸序列见序 列表SEQ ID NO：7；2F6-F8Vh核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：20，2F6-F8Vh 氨基酸序列见序列表SEQ ID NO：18；2F6-F8Vk核苷酸序列见序列表SEQ ID NO： 19，8E7-E6VH氨基酸序列见序列表SEQ ID NO：17。

实施例5制备8E7-E6/2F6-F8构成的双抗体夹心法ELISA试剂盒

1、单抗的包被

用0.1M的NaHCO3/Na₂CO₃缓冲液(pH 9.6)稀释抗体8E7-E6至浓度为10μg/ml， 加入至96孔酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜，用PBST(在PBS中加入0.05％ 的Tween-20)洗1次，加入5％的牛奶4℃封闭过夜，用PBST洗1次，-20℃ 冻存备用。

2、单抗2F6-F8与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)的偶联

把单抗2F6-F8透析至PBS中，调节浓度至1mg/ml。应用北京泰天和生物科 技有限公司的产品活化辣根过氧化物酶进行偶联，具体操作参照其公司说明书。 在HRP标记抗体中加入50％的甘油，-20℃冻存备用。

洗液：PBS+0.05％Tween 20

底物：TMB和H₂O₂，为Thermo公司产品。

实施例68E7-E6/2F6-F8构成的双抗体夹心法ELISA试剂盒检测样品中的StxI 材料：

所使用的EHEC菌株列表：

名称 00G097 99A021 99G143 23A2C 85933 882364 菌株 O157H7 O157H7 O157H7 O157H7 O157H7 O157H7 来源地 中国 中国 中国 中国 美国 中国 宿主来源 HUMAN PIG HUMAN HUMAN HUMAN HUMAN StxI - - + + + + StxII + + + + + -

方法：

1、Stx粗提物的制备。对于上述菌株，分别在在LB平板上挑取EHEC单菌落， 置LB液体培养基中250rpm，37℃培养过夜。次日过夜培养物1:100稀释至2L， 培养至4小时，加入终浓度为0.4mg/L丝裂霉素C(mitomycin C)，然后继续培 养20小时。培养物16,000g 4℃离心30分钟，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤， 调节pH值至7.5，分装，-20℃冻存备用。

2、ELISA检测。使用实施例5制备的8E7-E6/2F6-F8构成的双抗体夹心法ELISA 试剂盒。

结果：

检测结果如下：

结果显示StxI型菌株(如23A2C、85933、99G143、882364)能够被本发明制备 的试剂盒检测出，检测结果与对照相比较具有统计学差异。当菌株为StxII型菌 株(00G097、99A021)，检测结果与对照相比无统计差异。即本发明制备的试剂 盒能够特异性检测StxI型菌株。