一种应用近红外实时监测银杏叶提取过程中槲皮素的方法

摘要

本发明公开了一种应用近红外实时监测银杏叶提取过程中槲皮素的方法，本发明首先安装大孔树脂实时监测系统，再运用偏最小二乘法将高效液相色谱法测定的槲皮素含量数据与近红外光谱信息进行关联，建立起银杏叶提取过程中槲皮素含量的定量校正模型；并利用所建立定量校正模型对未知银杏叶提取过程中的槲皮素含量进行快速检测。本发明方法可以对银杏叶提取过程中的提取液进行实时取样，并实时监测银杏叶提取液中的槲皮素的变化；结果准确可靠。

说明书

技术领域

本发明属于中药分离纯化的技术领域，具体地，涉及一种应用近 红外实时监测银杏叶提取过程中槲皮素的方法。

背景技术

在中药制药过程中，提取过程作为中药生产的特色环节之一，决 定着中药中不同成分在成品中的比例，即决定着药品疗效。目前，我 国中药提取过程的质量控制仍十分被动，只对终端产品进行质检，很 少考虑工艺过程中的成分变化，生产工艺很难得到精确控制，从而导 致中药产品批次间质量差异较大，这也是中药难以现代化、国际化的 主要原因之一。因此，发展形成从中药制药源头——提取工艺过程解 决产品稳定性和可靠性问题的快速分析方法，对于中药工业技术进步 和产品质量升级具有重大现实意义。

银杏叶具有益心、活血止痛、敛肺平喘之功效，是一种常用中药。 总黄酮苷作为银杏叶中的主要成分，具有显著的药理、药效作用，因 此，在银杏叶生产加工各工艺环节过程中常被用来作为质控指标。传 统的分析方法，如高效液相色谱法、紫外分光光度法等，常需对所取 样品进行繁杂的预处理，耗费大量的试剂，并且信息反馈滞后，无法 满足生产过程中即时分析的需要。

槲皮素，又名栎精，槲皮黄素，溶于冰醋酸，碱性水溶液呈黄色， 几乎不溶于水，乙醇溶液味很苦。可作为药品，具有较好的祛痰、止 咳作用，并有一定的平喘作用。此外还有降低血压、增强毛细血管抵 抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量 等作用。用于治疗慢性支气管炎。对冠心病及高血压患者也有辅助治 疗作用。槲皮素作为银杏叶提取物中的重要关键指标，对其进行实时 监测具有重要意义。

近红外光谱(near-infrared spectroscopy,NIRS)分析技术是上 世纪90年代发展起来的一项现代分析技术。它综合运用了计算机技 术、光谱技术和化学计量等多个学科的最新研究成果，以其独特的高 效、快速、成本低、环保等突出优点，在农业、食品、石油化工和制 药工程等学科中得到了广泛应用。在化学制药领域，NIRS已被运用 于原料药质量分析、反应过程、制粒过程、混合过程、微波真空干燥 过程、压片过程、包衣和包装过程，作为一种极有前途的过程分析技 术，其在中药生产领域也展现出了巨大的应用潜力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种应用近红外实时监测银 杏叶提取过程中槲皮素的方法。本发明方法可以对银杏叶提取过程中 的提取液进行实时取样，并实时监测银杏叶提取液中的槲皮素的含量 变化；结果准确可靠。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种应用近红外 实时监测银杏叶提取过程中槲皮素的方法，包括以下步骤：银杏叶粉 碎、提取、浓缩、大孔树脂柱分离纯化、收集洗脱液、浓缩、干燥； 其特征在于，通过在对大孔树脂分离纯化过程中进行取样时，用近红 外光谱建立定量模型，使用该定量模型进行银杏叶提取物中槲皮素含 进行快速测定；具体包括以下步骤：

步骤一、安装大孔树脂实时监测系统，所述大孔树脂实时监测由 树脂柱、流量调节阀、三通阀、流通池、光纤、近红外光谱仪、计算 机组成，在大孔树脂柱流出口设置流量调节阀，大孔树脂柱流出口下 段通过橡胶管连接三通阀b端，三通阀a端通过橡胶管与流通池下段 连接，流通池上端连接橡胶管，流通池左右端连接光纤，光纤与近红 外光谱仪连接，近红外光谱仪与计算机连接，三通阀c端用于样品收 集；

步骤二、收集不同批次的银杏叶提取过程液作为校正样本集，对 其进行近红外光谱扫描，采集体现槲皮素特性的近红外光谱信息；其 中，光谱采集条件为：扫描范围12500～4000cm-1，分辨率8cm-1， 扫描次数96次，每个样品测定2次，取平均光谱用于近红外建模；

步骤三、运用高效液相色谱法分别测定所述银杏叶提取过程液中 的槲皮素含量；

步骤四、运用偏最小二乘法将所述步骤三高效液相色谱法测定的 槲皮素含量数据与所述步骤二得到的近红外光谱信息进行关联，建立 起银杏叶提取过程中槲皮素含量的定量校正模型；其中，用于构建槲 皮素定量校正模型的近红外光谱波段为两个波段，包括12493.2～ 7498.2cm^-1、以及6101～5446.2cm^-1；

步骤五、利用所述步骤四建立的多元定量校正模型对未知银杏叶 提取过程中的槲皮素含量进行快速检测。

所述步骤二中，所述银杏叶提取过程液包括银杏叶提取液和银杏 叶解析液。

所述步骤三中，所述高效液相色谱法测定所述银杏叶提取过程液 中的色谱条件为:色谱柱：Welch Ultimate XB—C18，4.6*250mm， 5μm；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50:50)为流动相；检测波长为360nm。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明方法可以对银杏叶提取过程中的提取液进行实时取 样，并实时监测银杏叶提取液中的槲皮素的变化；结果准确可靠。

(2)本发明结果表明，近红外光谱技术可以对银杏叶提取过程 中槲皮素含量进行有效检测。本发明具有方法简单、快速、准确性高 等特点，相对于一般仪器检测方法，可有效解决提取过程中槲皮素、 含量变化的监控问题，具有较强的实用价值，可推广运用于中药生产 过程。

(3)水分子所含的OH基，在近红外谱区的6900cm^-1和5180cm^-1附近有很强的倍频与合频吸收谱带，而其它各种物质分子的倍频与合 频吸收相对较弱，因此水溶液物质体系中，水就成为近红外光谱分析 时的强干扰因素。所以本发明在建模过程中避开水分的强干扰吸收波 段进行建模，通过RMSECV和R²作为评价指标，通过对不同光谱区 间进行建模试验，最终选定槲皮素的最佳建模波段为“12493.2～ 7498.2cm^-1、6101～5446.2cm^-1”，从而避免了过多的冗余信息和干扰 信息，改善模型性能，提高了计算速度。此时RMSECV最小，相关 系数R²接近1，槲皮素的吸收特性在近红外光谱中得到了很好地体 现。

附图说明

图1为本发明大孔树脂实时监测系统。

图2为12批银杏提取液近红外光谱图。

图3为12批银杏解析液近红外光谱图。

图4为12批银杏下柱液中段近红外光谱图。

图5为12批银杏下柱液后段近红外光谱图。

图6为混合对照品液相色谱图。

图7为银杏提取液液相色谱图。

图8为银杏下柱液中段液相色谱图。

图9为银杏下柱液后段液相色谱图。

图10为银杏解析液液相色谱图。

图11为校正集样本中槲皮素NIR预测值与HPLC测定值之间的 相关图。

图12为NIRS预测的未知批次银杏叶提取过程槲皮素含量变化 曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说 明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制 本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域 的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的 保护范围。

实施例

设备安装：如图1所示，安装大孔树脂实时监测系统，所述大孔 树脂实时监测由树脂柱1、流量调节阀2、三通阀3、流通池4、光纤 5、近红外光谱仪6、计算机7组成，在大孔树脂柱1流出口设置流 量调节阀2，大孔树脂柱1流出口下段通过橡胶管连接三通阀3b端， 三通阀3a端通过橡胶管与流通池4下段连接，流通池4上端连接橡 胶管，流通池4)左右端连接光纤5，光纤5与近红外光谱仪6连接， 近红外光谱仪6)与计算机7连接，三通阀3c端用于样品收集。

1、校正集样本的收集

收集不同批次的银杏提取液、银杏下柱液中段、银杏下柱液后段 以及银杏解析液各12批，共48批提取过程液样本作为校正集用于近 红外建模。

注：但银杏下柱液中段、银杏下柱液后段经液相检测，未检出其 中含有槲皮素，故真正用于银杏提取物近红外建模的校正集包含了 12批银杏提取液和12批银杏解析液。

2、样本近红外透射光谱图的采集

仪器：MPA傅立叶变换近红外光谱仪(德国BRUKER公司)， 测样装置为透射样品腔或透射光纤探头，TE-InGaAs检测器，光谱采 集及信息处理软件为OPUS或Unscramber数据处理软件。

光谱采集条件：扫描范围12500～4000cm^-1，分辨率8cm^-1，扫 描次数96次，每个样品测定2次，取平均光谱用于近红外建模。近 红外光谱图见图2～5。

3、校正集样本中槲皮素化学建模参考值的测定(HPLC)

对校正集样本进行槲皮素的测定，以此作为建模参考值。具体方 法如下：

色谱条件色谱柱：Welch Ultimate XB—C18，4.6*250mm，5μm； 以甲醇-0.4％磷酸溶液(50:50)为流动相；检测波长为360nm。理论 板数按槲皮素峰计算应不低于2500。

对照品溶液的制备分别精密称取槲皮素对照品，加甲醇制成每 1ml分别含30μg的混合溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取本品约35mg，精密称定，加甲醇-25％盐 酸溶液(4:1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷 却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过， 取滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液 相色谱仪，测定，分别计算槲皮素的含量。

HPLC测定结果见图6～10及表1。

表1槲皮素化学建模参考值的测定(HPLC)结果

4、选择能体现槲皮素特性的最优建模波段

水分子所含的OH基，在近红外谱区的6900cm^-1和5180cm^-1附 近有很强的倍频与合频吸收谱带，而其它各种物质分子的倍频与合频 吸收相对较弱，因此水溶液物质体系中，水就成为近红外光谱分析时 的强干扰因素。所以本项目在建模过程中避开水分的强干扰吸收波段 进行建模，通过RMSECV和R²作为评价指标，通过对不同光谱区间 进行建模试验(槲皮素，见表2)，最终选定总黄酮苷的最佳建模波 段为“12493.2～7498.2cm^-1、6101～5446.2cm^-1”，从而避免了过多的 冗余信息和干扰信息，改善模型性能，提高了计算速度。此时 RMSECV最小，相关系数R²接近1，槲皮素的吸收特性在近红外光 谱中得到了很好地体现。

表2不同光谱波段的建模结果

5、校正模型的建立

在筛选出最佳建模波段后，运用偏最小二乘法,建立了银杏叶提 取液样本的近红外光谱和HPLC测定值之间的槲皮素定量校正模型。 以该模型预测的校正集样本的槲皮素含量与HPLC测得值之间的相 关关系图见图11。

6、模型的预测

采集未知批次银杏叶提取过程中样品的近红外光谱，将其输入所 建模型，即可快速得到其中槲皮素含量。该数据与HPLC参照方法测 得值比较，结果见表3，图12。模型对银杏叶提取过程液样品的预测 效果以相关系数r、预测误差均方根RMSEP和预测相对标准偏差 RSEP％来评价，其中r越接近1，同时RMSEP和RSEP％越小，模 型的预测效果就越好。

表3槲皮素NIR预测结果

如上所述，便可以较好地实现本发明。