一种准确测定花鳗鲡V型-H+-ATP酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种准确测定花鳗鲡V型-H+-ATP酶(VHA)活性的方法。本发明是通过测定酶促反应中释放的无机磷量来测定ATP酶的活力，将花鳗鲡组织样品前处理后，测定组织匀浆的蛋白浓度；以组织匀浆为ATP酶源进行酶促反应；通过测定酶促反应中释放的无机磷量来计算出ATP酶的活力；反应中设空白组、标准组、对照组和测定组。本发明具有准确、快捷、经济的特点，而且更换缓冲液后可运用于其他鱼类，适用于科研单位、技术推广站及企业检测鱼类VHA酶活力，为鱼类渗透压调节机制研究提供基础资料，并对扩大花鳗鲡在盐碱地、沿海滩涂及咸淡水中的养殖生产具有指导价值。

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类酶学检测技术领域，具体涉及一种准确测定花鳗鲡V型-H⁺-ATP酶(Vacuolar-Type-H⁺-ATPase)活性的方法。

背景技术

花鳗鲡(Anguilla marmorata)是一种典型的降河性洄游鱼类，性成熟后便由江河的上、中游移向下游，群集于河口处入海，到远洋中去产卵繁殖。近年来，由于过度捕捞、环境污染、拦河建坝等人类活动加剧，花鳗鲡的分布海域在逐渐缩小，自然资源明显减少，我国已将其列为二级保护动物。花鳗鲡不但肉质好，营养价值高，素有“水中人参”之称，而且有药用价值，是优质食用鱼类，该鱼市场价格是日本鳗鲡、欧洲鳗鲡的3倍，市场前景广阔。目前，海南、福建、广东等地积极发展花鳗鲡人工养殖业，但是由于花鳗鲡的苗种完全依赖于天然苗种的捕捞，而且培育成活率不高，故而极大地影响了养鳗产业的健康持续发展。因此，为了有效地提高花鳗鲡苗种的培育成活率和扩大苗种的养殖范围，保护日益稀少的花鳗鲡苗种资源变得重要和紧迫。盐度作为洄游性鱼类的一个非常重要的非生物因素，它与鳗鲡的生长、存活、洄游以及耗氧率等一系列生态、生理过程密切相关。当务之急是加强花鳗鲡应对环境盐度变化的适应性调节机制的基础研究，特别是对花鳗鲡适应盐度变化的渗透调节机制进行系统研究。

在真核生物中，V型-H⁺-ATP酶(Vacuolar-Type-H⁺-ATPase或H⁺-ATPase)是一种由ATP驱动的质子泵，存在于细胞质膜和多种细胞内膜系统中，包括溶酶体、核内体、高尔基体囊泡、液泡、微泡等。该离子泵通过ATP水解产生的能量将质子从胞质中泵进细胞器腔内从而介导细胞内膜的酸化、胞浆内的PH值变化等。

目前，许多学者对于鱼类渗透压调节酶的相关研究均集中在Na⁺/K⁺-ATP酶(NKA)测定，而对于鱼类V型-H⁺-ATP酶(Vacuolar-Type-H⁺-ATPase，VHA)活性检测未见相关报道。VHA酶活力作为一个重要的生理指标，在鱼类盐度适应过程中受到盐度的影响，因此通过检测VHA酶活力能够反应出花鳗鲡幼鳗对不同盐度变化的适应情况，可以进一步探讨其在花鳗鲡幼鳗的渗透压调节过程中起到的作用，阐明花鳗鲡幼鱼入海洄游过程中的渗透压调节规律，为其渗透压调节机制研究提供基础资料，并可以为扩大花鳗鲡在盐碱地、沿海滩涂及咸淡水中的养殖生产具有指导价值。

发明内容

本发明的基本原理：ATP酶(Adenosine triphosphatase)可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，这一反应可释放出大量能量，以供生物体进行各项需能生命过程。本发明通过测定酶促反应中释放的无机磷量来测定ATP酶的活力。

针对以上技术现状，本发明所要解决的技术问题是提供一种准确、高效的测定花鳗鲡V型-H⁺-ATP酶活性的方法：是将花鳗鲡组织样品前处理后，测定组织匀浆的蛋白浓度；以组织匀浆为ATP酶源进行酶促反应；通过测定酶促反应中释放的无机磷量来计算出ATP酶的活力；反应中设空白组、标准组、对照组和测定组。

本发明中测定无机磷量的方法是：利用在酸性条件下，无机磷可与钼酸铵作用生成磷钼酸铵，并被氯化亚锡还原成蓝色的磷钼蓝的原理，在酶促产物中加入钼酸铵、氯化亚锡，然后用分光光度计检测各组的吸光度值(OD值)，由此测定磷的含量。

本发明中，ATP酶的活力的计算方法是：组织Vacuolar-Type-H⁺-ATPase活力(U/mg prot)＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)*标准品浓度(0.02μmol/mL)*2*7/待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)。

具体包括以下5个步骤：1、花鳗鲡组织样品前处理；2、蛋白浓度测定；3、酶促反应；4、定磷；5、V型-H⁺-ATP酶活性定量计算。

所述步骤1，花鳗鲡组织样品前处理：取出花鳗鲡待测组织，按重量(g)：体积(mL)＝1:9的比例，加入9倍体积的缓冲液，在冰水浴条件下机械匀浆，然后在4℃条件下，以5000转/分的转速离心1min，取上清液(即浓度为10％的匀浆上清液)。

所述缓冲液配方为：150mmol/·L蔗糖，10mmol·/L EDTA Na2，50mmol/·L咪唑，0.1％脱氧胆酸钠。

所述步骤2，蛋白浓度测定：使用考马斯亮蓝试剂盒测定组织蛋白浓度。测定组织蛋白后，组织匀浆的蛋白质浓度用缓冲液稀释至1.3mg/mL以下。

所述考马斯亮蓝法测定组织蛋白浓度时组织匀浆的浓度一般为0.5％-2％。

所述步骤3，酶促反应：取两个1.5mL EP管分别标记为对照管和测定管，分别加入10μL样本，100μL ATP Na₂(3.6mM)，70μL NaCl(125mM)，70μL KCl(75mM)，50μL MgCl₂(7.5mM)，然后向对照管加入50μL巴弗洛霉素A1(40μmol·/L)，向测定管中加入50μL双蒸水，混匀后在37℃水浴锅中准确反应30min，然后在冰浴条件下反应10min，用来终止反应。

所述步骤4，定磷：另取两个1.5mL EP管分别标记为空白管和标准管，向空白管、标准管、对照管、测定管分别加入1mL钼酸铵硫酸溶液、0.35mL二氯化锡溶液，然后向空白管加入0.3mL双蒸水、向标准管加入0.3mL 0.02μmol/mL磷标准液(mL)、向对照管和测定管加入0.3mL上述步骤3中的酶促反应液，混匀后室温静置反应10min后，使用分光光度计在 660nm处，1cm光径条件下检测各管吸光度值。

所述0.02μmol/mL磷标准液配制方法为：称取无水的磷酸二氢钾2.7218g溶于1L双蒸水混匀，含磷0.02μmol/mL；所述钼酸铵硫酸溶液配制方法为：称取2.5g钼酸铵溶于15mL双蒸水中，另将28mL浓硫酸加入47mL双蒸水中，冷却后将钼酸铵溶液倒入硫酸溶液中并稀释至100mL混匀；所述二氯化锡溶液配制方法为：称取1g二氯化锡于小烧杯中，加入2mL浓盐酸加热至溶解，再加入18mL双蒸水混匀，使用时按二氯化锡溶液：双蒸水＝1:4的比例稀释。

所述步骤5，计算V型-H⁺-ATP酶活性：组织V型-H⁺-ATP酶活力(U/mg prot)＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)*标准品浓度(0.02μmol/mL)*2*7/待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)。

本发明的有益效果：

1、能准确测定花鳗鲡V型-H⁺-ATP酶活性，为鱼类渗透压调节机制研究提供基础资料，并对扩大花鳗鲡在盐碱地、沿海滩涂及咸淡水中的养殖具有指导价值。

2、本检测方法具有准确、快捷、经济的特点，而且更换缓冲液后可运用于多种鱼类，适用于科研单位、技术推广站及企业检测鱼类VHA酶活力。

具体实施方式

本发明具体检测花鳗鲡V型-H⁺-ATP酶活力实例如下，具体参数为说明本发明技术方案所需，不应理解为对本发明保护范围的限制。

1仪器与材料 

1.1仪器

电子天平、台式离心机、水浴锅、分光光度计。

1.2药品与试剂 

蔗糖、EDTA Na2(乙二胺四乙酸二钠)、咪唑、脱氧胆酸钠、巴弗洛霉素A1规格100μg(南京丁贝生物科技有限公司)、ATPNa₂、氯化钠、氯化钾、氯化镁、无水的磷酸二氢钾、钼酸铵、浓硫酸、二氯化锡、浓盐酸、双蒸水。

1.3实验材料人工养殖花鳗鲡(体长10.95±0.94cm，体重1.99±0.78g)

2实验方法

2.1试剂配制

缓冲液：称取蔗糖25.65g配制成200mL溶液，浓度为375mmol/·L；称取EDTA Na21.86g配制成100mL溶液，浓度为50mmol/·L；称取咪唑1.7g配制成100mL溶液，浓度为250mmol/L；称取脱氧胆酸钠0.5g配制成100mL溶液，质量分数为0.1％；四种溶液混合在一起，即为缓 冲液，体积为500mL。

巴弗洛霉素A1：质量为100μg，加入100μL双蒸水配制成浓度为1605μmol/L的溶液，然后取其中70μL将其浓度稀释成280μmol/·L，获得溶液体积400μL。

ATP Na₂：称取0.76g ATP Na₂粉末配制成100mL溶液，浓度为12.6mmol/L。

NaCl溶液：称取3.66g NaCl配制成100mL溶液，浓度为625mmol/L。

KCl溶液：称取2.79gKCl配制成100mL溶液，浓度为375mmol/L。

MgCl₂溶液：称取1.07gMgCl₂配制成100mL溶液，浓度为52.5mmol/L。

0.02μmol/mL磷标准液配制：称取无水的磷酸二氢钾2.7218g溶于1L双蒸水混匀，含磷0.02μmol/mL。

钼酸铵硫酸溶液配制：称取2.5g钼酸铵溶于15mL双蒸水中，另将28mL浓硫酸加入47mL双蒸水中，冷却后将钼酸铵溶液倒入硫酸溶液中并稀释至100mL混匀。

二氯化锡溶液配制：称取1g二氯化锡于小烧杯中，加入2mL浓盐酸加热至溶解，再加入18mL双蒸水混匀，使用时按1:4稀释。

2.2花鳗鲡鳃组织处理：

试验设3个盐度梯度，即淡水对照组(盐度0)，咸淡水(盐度10)以及海水组(盐度25)。每个梯度设置3个平行组，每个平行组30尾幼鳗。幼鳗转移到淡水中后，先取淡水中的花鳗鲡幼鳗鳃组织作为对照组实验材料，之后每天升高2‰的趋势逐步达到咸淡水(盐度10组)和海水组(盐度25组)。实验开始后，分别在1h，3h，6h，12h，24h，48h，96h和15天时间段取咸淡水和海水组的花鳗鲡鳃组织，每平行组随机取3尾。将取出的鳃组织置于离心管中，称量离心管中的鳃组织，各组的组织重量在0.4-0.7g范围内，按重量(g)：体积(mL)＝1:9的比例，即加入360μL-630μL的缓冲液，在冰水浴条件下进行机械匀浆，4℃的条件下5000转/分，共离心1min，然后取其上清液(即10％的匀浆上清液)，再用缓冲液10倍稀释成1％，同时用考马斯亮蓝试剂盒测定组织蛋白。

2.3酶促反应： 

按下表的反应体系1将溶液加入EP管中混匀，在37℃水浴锅中准确反应30min，然后冰浴10min终止反应，最后取上清定磷。

2.4定磷:

按下表的反应体系2将溶液加入EP管中混匀，室温反应10min后，在660nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。

2.5VHA酶活计算： 

规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位。即微摩尔磷/毫克蛋白/小时(μmol Pi/mg prot/h)。

组织中ATPase活力(U/mg prot)＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)*标准品浓度(0.02μmol/mL)*2*7/待测样本蛋白浓度(mg prot/mL)。[注]“2”：定义为每小时，实际操作为30min反应；“7”：反应体系中7倍稀释。

3结果与分析： 

花鳗鲡幼鳗鳃组织在咸淡水(盐度10)和海水组(盐度25)环境中不同时段的V型-H⁺-ATP酶(VHA)活性变化情况见表1。在淡水对照组中，鳃组织的VHA酶活值为1.47±0.095μmol Pi/mg prot/h；在盐度10组中，鳃组织的VHA酶活在6小时达到最高为2.96±0.11μmol Pi/mg prot/h，在12小时有所降低，之后基本与淡水对照组的酶活水平保持一致。在盐度25组中，鳃组织的VHA酶活在24小时达到3.13±0.11μmol Pi/mg prot/h，是对照淡水组的2倍左右，之后其酶活保持相对稳定。由此可知，海水组中的VHA酶活最高值要略大于咸淡水组。通过测定花鳗鲡鳃组织在咸淡水和海水组中不同时间段的VHA酶活力变化，说明了花鳗鲡应对不同盐度变化的适应情况。因此，通过VHA酶活力检测可知花鳗鲡盐度适应的规律，说明此方法灵敏、准确、方便，并能对花鳗鲡养殖范围的扩大提供指导。

表1花鳗鲡幼鳗鳃组织在咸淡水(盐度10)和海水组(盐度25)环境中不同时段的VHA酶活性变化

注：*为10盐度组和25盐度组与对照组相比较具有显著性差异，*p<0.05(显著差异),**p<0.01(极显著差异)。