检测肺癌治疗耐药及毒副作用相关基因多态性的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测肺癌治疗耐药及毒副作用相关基因多态性的方法及试剂盒。该方法包括如下步骤：设计扩增肺癌三个相关基因的扩增引物，接着将扩增引物配成引物混合液，进行多重PCR扩增，获得PCR产物；将PCR产物进行毛细管电泳，电泳结果用GeneMapper4.1分析，判读结果。依据该方法设计得到的试剂盒，含有如SEQ ID NO.1～6所示的引物序列。本发明提供的方法和试剂盒具有如下优点：通量高，一次单管同时检测三个基因的多态性；步骤简单，仅需一次PCR扩增及一次毛细管电泳便可获得结果；检测周期短，仅需半个工作日便可完成检测。

说明书

技术领域

本发明属于临床生物技术领域，特别涉及一种检测肺癌治疗耐药及毒副作用相关基因多 态性的方法及试剂盒。

背景技术

肺癌的发病率及病死率在肿瘤中均位于首位。传统的治疗方法是基于病人的临床特征及 病理类型选择化学治疗方案，但无疾病进展期(PFS)只有6个月。近年来，肺癌的靶向治 疗取得了显著进展，以表皮生长因子(EGFR)为靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼 及埃克替尼)在含敏感突变型EGFR的非小细胞肺癌患者中显示出显著的疗效，PFS达到了 9-13个月。然而，吉非替尼在EGFR敏感突变型肺癌的疗效仅达70％，研究显示，EGFR intron1  CA多态性与吉非替尼的疗效相关。EGFR的转录由两个增强子调控，一个位于转录起始点的 上游，另一个在第一内含子的CA重复区，CA的长度在不同种族有差异，文献报道：CA区 的长度约为14-21CA，但在本发明单位前期研究中发现，中国人的EGFR intron1 CA的长度 可长达22个，而14个CA极其罕见，其临床意义有待进一步研究。CA区长度多态性与EGFR 的转录相关，即短的CA，则EGFR转录水平较高，其表达水平也较高，EGFR的过表达提示 不良的预后。而较长的CA重复提示良好的生存率；较短的CA重复，提示EGFR高表达， 在肺癌靶向治疗中对EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感。

不同文献计算CA长度的cutoff值(截断值)的方法不一样，导致结果有所差异。有的 文献是以两个等位基因中最短的CA长度来判断截断值；而有的文献是将两个同位基因CA 值的总和来判断截断值，这样就需要准确计算两个等位基因的长度。用经典的Sanger测序法 未能较清晰地将EGFR intron1 CA的杂合子及纯合子区分出来，对准确计数CA的长度有较 大的影响。

此外，研究提示：BIM基因的上调是EGFR TKI诱导细胞凋亡所需，在亚裔人口中BIM 基因的第二内含子存在着缺失多态性，在高加索人群中却未发现。并且BIM基因的缺失多态 性与EGFR_TKI耐药相关，添加BIM基因BH3模拟分子，可以克服BIM缺失导致的耐药。 我们早期调查数据提示：在中国人口中，BIM基因的缺失多态频率约为18％。

依立替康可用于非小细胞肺癌及小细胞肺癌治疗。该药可引起严重的腹泻及中性粒细胞 减少等毒副作用，延迟性腹泻为剂量限制性。当出现严重毒副作用时，下一周期可减少剂量 或延迟给药。UGT1基因表达9个功能性的UGT1A蛋白，UGT1A1蛋白是主要催化SN-38 葡萄糖苷酸及胆红素的蛋白。UGT1A1突变导致其活性减低或缺失，从而使非结合性胆红素 增高，尤其是在其TA盒插入TA的突变，使得酶的活性减低及SN-38葡萄糖苷酸化，致使依 立替康毒性增加，但只要减少给药量则不影响疗效。UGT1A1 TA盒的多态性为：突变型：6/7 型及7/7型，野生型为：6/6型.

因此，更多地了解患者的肺癌基因的信息，有助于更好对肺癌患者实施精准治疗。目前， Sanger测序法为突变检测的经典方法，但Sanger测序法耗时、通量低，每次仅能检测一个片 段的突变，而且操作复杂。相比Sanger测序法，本发明方法通量较高，可单管同时检测三个 基因的多态性，而且操作简便、流程短，能快速、准确地获得检测结果，节省试剂、节省时 间，减少检测成本、减少核酸样本的使用量，更重要的是减轻患者的经济负担。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测肺癌治疗耐药及毒副 作用相关基因多态性的方法。该方法为应用多重PCR方法检测肺癌靶向治疗和化疗耐药及毒 副作用相关基因多态性。本发明所指的肺癌治疗耐药及毒副作用基因为EGFR intron1、BIM 及UGT1A1等三个与肺癌靶向治疗或化学治疗耐药或毒副作用相关基因。

本发明的另一目的在于提供检测肺癌治疗耐药及毒副作用相关基因多态性的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测肺癌治疗耐药及毒副作用相关基因多态 性的方法，包括如下步骤：

(1)设计扩增肺癌三个相关基因多态性区域的扩增引物

扩增UGT1A1基因的引物对如下：

UGT1A1_F：5’-VIC-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA-3’；

UGT1A1_R：5’-TGCCAGAGGTTCGCCCTCTCCTACT-3’；

扩增EGFR intron1基因的引物对如下：

EGFR intron1_F：5’-NED-CCCGGAGACTTTCTTTCTTGGATGT-3’；

EGFR intron1_R：5’-CTGTCAAGTGGGTTTATGGTCGGTA-3’；

扩增BIM基因的引物对如下：

BIM_F：5’-6-FAM-GCTAACTCAACAAACCCATCAGAAC-3’；

BIM_R：5’-AGCCAGTAAATATAAATCCAAAGCA-3’；

(2)多重PCR扩增

将步骤(1)中的扩增引物配成引物混合液，其中各引物的浓度如下：UGT1A1_F 1.0μM、 UGT1A1_R 1.0μM、EGFR intron1_F 2μM、EGFR intron1_R 2μM、BIM_F 2μM、BIM_R 2μM； 用引物混合液进行多重PCR扩增，获得PCR产物；

(3)毛细管电泳

将上述PCR产物用水作体积比1：55稀释，然后取1μl稀释产物、0.2μl LIZ120和9μl 甲酰胺混合，按AB3730操作说明上机进行毛细管电泳，电泳结果用GeneMapper4.1分析， 判读结果；

(4)判读结果

UGT1A1：由于PCR引物标记上了VIC荧光，UGT1A1不同的分子分型在毛细管电泳图 上产生不同大小的绿色产物峰，单个124.2大小的峰为6/6型，单个128.4大小的峰为7/7型， 124.2及126.4两个峰为6/7型(如表1所示)；

表1 UGT1A1结果判读

峰的大小 基因型 124.2 6/6 124.2、126.4 6/7 128.4 7/7

EGFR intron1：EGFR内含子1(intron1)CA区的长度约为14～21CA，可分为纯合型 及杂合型，由于引物标记上NED荧光，在毛细管电泳图上197.1-213.5位置上可见一个或两 个黑色的峰；峰的大小不同表示CA的长度不一样(如表2所示)；单个峰为纯合型，两个峰 为杂合型；

表2 EGFR-intron1结果判读

峰的大小 CA的数目 197.1 14 199.2 15 201.5 16 203.3 17 205.3 18 207.3 19 209.2 20 211.1 21 213.5 22

BIM：由于BIM的引物标记上了6-FAM，缺失型的BIM基因在毛细管电泳图上产生一 个大小为263.6蓝色峰，野生型由于PCR产物太大超出显示范围，则毛细管电泳图上未见产 物峰，因此，毛细管电泳图上263.6位点可见蓝色峰为缺失型，未见峰为野生型；

步骤(2)中所述的多重PCR扩增的条件为：95℃ 5min；95℃ 20sec、58℃ 30sec、 72℃ 60sec，40个循环；72℃ 3min；

步骤(2)中所述的多重PCR扩增的体系为：Qiagene Multiplex PCR master mix 5μl、扩 增引物混合液1μl、DNA模板1μl(10ng)，双蒸水补至10μl；

步骤(3)中所述的毛细管电泳的操作条件为AB3730基因分析仪用户手册标准操作程序。

一种检测肺癌治疗耐药及毒副作用相关基因多态性的试剂盒，为依据上述方法设计得到， 包含如下引物：

UGT1A1_F：5’-VIC-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA-3’；

UGT1A1_R：5’-TGCCAGAGGTTCGCCCTCTCCTACT-3’；

EGFR intron1_F：5’-NED-CCCGGAGACTTTCTTTCTTGGATGT-3’；

EGFR intron1_R：5’-CTGTCAAGTGGGTTTATGGTCGGTA-3’；

BIM_F：5’-6-FAM-GCTAACTCAACAAACCCATCAGAAC-3’；

BIM_R：5’-AGCCAGTAAATATAAATCCAAAGCA-3’；

所述的试剂盒，优选包含上述引物制备得到的引物混合液，其中各引物的浓度如下： UGT1A1_F 1.0μM、UGT1A1_R 1.0μM、EGFR intron1_F 2μM、EGFR intron1_R 2μM、BIM_F  2μM、BIM_R 2μM；

所述的试剂盒，优选还包含Qiagene Multiplex PCR master mix。

所述的试剂盒在制备诊断试剂中的应用，用于检测肺癌靶向治疗或化学治疗耐药及毒副 作用相关基因的多态性。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)通量高：与经典方法Sanger测序法比较，本发明提供的方法和试剂盒通量高，一 次单管同时检测三个基因的多态性。

(2)步骤简单：本发明提供的方法和试剂盒相对于Sanger测序技术，操作步骤简单， 结果容易判断，仅需一次PCR扩增及一次毛细管电泳便可获得结果；而Sanger测序法则需 五个操作步骤，手工劳作较多。

(3)检测周期短：由本发明提供的方法和试剂盒仅需半个工作日便可完成检测，而Sanger 测序法则需三个工作日。

附图说明

图1为样本1在一单管中同时检测UGT1A1、EGFR_intron1、BIM基因多态性的毛细管 电泳谱图。

图2为图1中UGT1A1TA界面放大效果图。

图3为图1中EGFR_intron1界面放大效果图。

图4为图1中BIM基因界面放大效果图。

图5为样本2在单管中同时检测UGT1A1、EGFR_intron1、BIM基因多态性的电泳谱图。

图6为样本4234EGFR_intron1的测序图。

图7为样本4301EGFR_intron1的测序图。

图8为用本发明试剂盒检测样本4234EGFR_intron1的结果图。

图9为用本发明试剂盒检测样本4301EGFR_intron1的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

一、引物设计

(1)设计引物，用于扩增EGFR基因intron1(内含子1)、BIM基因的内含子2及UGT1A1 的5’端上游的poly CA区域，上游引物的5’端用不同的荧光标记，具体如表3所示。

表3三个基因的扩增引物(5’-3’)

二、PCR引物混合液配制

将表3中的扩增引物分别配制成浓度为100μM的引物母液，然后在90μl的水加入引物 UGT1A1_F(100μM)1μl、引物UGT1A1_R(100μM)1μl、引物EGFR intron1_F(100μM) 2μl、引物EGFR intron1_R(100μM)2μl、引物BIM_F(100μM)2μl、引物BIM_R(100μM) 2μl，得到PCR引物混合液。

三、样本检测

(1)多重PCR扩增

使用组织DNA提取试剂盒(QIAgene公司)按试剂盒操作说书明对两个肺癌血液标本或 组织样本(来源广东的两名肺癌患者，分别命名为样本1及样本2)提取DNA后，用PCR 引物混合液进行多重PCR扩增，设置一管无模板的空白对照，设置一管BIM缺失阳性对照 标本(BIM阳性对照为前期通过Sanger测序法检测证实为缺失多态性的病人血液标本))。PCR 扩增条件是：95℃ 5min；95℃ 20sec、58℃ 30sec、72℃ 60sec，40个循环；72℃ 3min。 PCR体系为：Qiagene Multiplex PCR master mix 5μl、PCR引物混合液1μl、DNA模板1μl(10ng)， 双蒸水补至10μl。

(2)毛细管电泳

用水将步骤(1)得到的PCR产物作1：55(体积比)稀释，取1μl稀释产物，加入9μl 甲酰胺，0.2μl LIZ120，混匀，在AB 3730基因分析仪上进行电泳，采用GeneMaper4.1分析 结果。

四、检测结果：

样本1的检测结果如图1～4所示：图1显示在一单管中，同时检测UGT1A1、BIM、 EGFR_intron1基因多态性；图2是将图1电泳图界面放大后所见，毛细管电泳图上产生单个 绿色的峰，峰的大小分别为124.6，提示UGT1A1 TA多态性为6/6型；图3是将图1电泳图 界面放大后所见，在电泳图上出现黑色、大小分别为203.1及211.1的两个峰，提示 EGFR_intron1 CA多态性为17/21型，是杂合子；图4是将图1电泳图界面放大后所见，电泳 图上出现一个大小为263.6蓝色峰，提示BIM基因为缺失多态性。

样本2的检测结果如图5所示：124.6及127.0分别有两个绿色产物峰，则UGT1A1 TA 多态性为6/7型；211.1处有一黑色产物峰，则EGFR intron1 CA多态性为纯合子21；263.6 处未见产物峰，BIM为野生型。

可见本发明提供的方法和试剂盒能准确、有效地检测非小细胞肺癌与疗效及毒副作用相 关基因的多态性。

比较实施例

用本发明的方法与经典Sanger测序对比检测112例肺癌病人的血液样本三个基因的多态 性。112例肺癌病人的血液样本通过组织DNA提取试剂盒(QIAgene公司)得到基因组DNA。

一、用Sanger测序法检测UGT1A1、BIM、EGFR_intron1基因多态性

1、引物设计，用于扩增EGFR基因intron1(内含子1)、BIM基因的内含子2及UGT1A1 的5’端上游的poly CA区域，如表4所示。

表4 Sanger测序引物及扩增产物的大小(5’-3’)

引物名称 引物序列 产物大小 UGT1A1_F2 CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA 339bp UGT1A1_R2 ACAACGAGGCGTCAGGTGCTA   EGFR intron1_F2 GGATCGCGGGACTCTTGA 298bp

EGFR intron1_R2 GTGGGTTTATGGTCGGTA   BIM_F2 GCTAACTCAACAAACCCATCAGAAC 262bp BIM_R AGCCAGTAAATATAAATCCAAAGCA  

2、样本检测

将112例标本分别用表4的引物进行UGT1A1、BIM、EGFR intron1基因目的片段的扩增， 然后按以下条件分别进行Sanger测序，每例样本需分三次进行如下操作。

(1)PCR扩增

反应体系：25μl体系，含1μl DNA(20ng)、1μl引物混合物(上下游引物浓度分别为 5μmol/L)、10.5μl的水、12.5μl的TAKARA Premix Hotstart Taq。

反应条件：95℃，4min；94℃ 30sec、58℃ 30sec、72℃ 45sec，40个循环；72℃延伸 10min。

琼脂糖电泳：制备2％的琼脂糖凝胶，将2μl PCR产物、1μl 2×Sybe Gold(核酸显影剂) 和2μl 6×电泳缓冲液混匀，全部加入孔中，以120V电泳20min。电泳结束后，凝胶成像， 观察PCR产物的亮度。

(2)PCR产物的纯化

PCR产物纯化体系：4μl PCR产物，核酸外切酶I(TAKARA，中国大连)0.5μl，碱性 磷酸酶(TAKARA，中国大连)0.5μl，H₂O 5μl。

将上述混合物于37℃消化1小时，65℃灭活20min。

(3)标记反应(96孔板)

反应体系：

正向测序：2μl BigDye terminator 3.1(AB,USA)，5μl H2O，2μl 3.2μmol/L的PCR上游 引物，1μl纯化后的PCR产物。

反向测序：2μl BigDye terminator 3.1(AB,USA)，5μl H2O，2μl 3.2μmol/L的PCR下游 引物，1μl纯化后的PCR产物。

反应条件：96℃，1min；(96℃ 10sec、50℃ 5sec、60℃ 4min)×25个循环；72℃延伸 10min。

(4)标记产物的纯化(96孔板)

A、PCR反应结束后，将反应板稍离心，然后每孔中加入40μl的乙醇和NaAc的混合溶 液(3mol/L醋酸钠2.5μl+无水乙醇37.5μl)，盖上盖子，振荡混匀，8℃、3000rpm离心20min。

B、揭开盖子，盖上吸水纸，反向离心(小心速度绝不能超过800rpm，严格控制离心时 间，当速度达到790rpm即停止离心)。

C、每管加入70％酒精70μl，振荡混匀，8℃、3000rpm离心15min。

D、盖上吸水纸，反向离心(小心速度绝不能超过800rpm，严格控制离心时间，当速度 达到790rpm即停止离心)。

E、将反应板室温下放置约10min，让残留乙醇全部挥发。

F、在纯化后的产物中加入10μl甲酰胺，即可上机进行测序。

G、目的片段均作双向测序，测序图用sequencing analysis v5.4软件分析。

二、用本发明方法检测112例血液样本

1.多重PCR扩增

PCR扩增条件是：95℃ 5min；95℃ 20sec、58℃ 30sec、72℃ 1min，40个循环；72 ℃ 3min。PCR体系为：Qiagene Multiplex PCR master mix 5μl、实施例步骤二得到的PCR引 物混合液1μl、DNA模板1μl(10ng)，双蒸水补至10μl

2.毛细管电泳

用水将PCR产物作1：55(体积比)稀释，取1μl稀释产物，加入9μl甲酰胺，0.2μl LIZ120(AB，USA)，混匀，在AB 3730基因分析仪上进行电泳。采用GeneMaper4.1分析结 果。

三、对比例结果：用本发明方法检测112例肿瘤患者的血液样本，并与Sanger测序法比 较。

UGT1A1T/A基因分型如下：野生型6/6型97例(85.7％)、杂合突变6/7型16例(14.3％)， 未见7/7纯合突变型，本发明与Sanger测序法检测结果完全一致。

EGFR Intron1 CA多态性检测结果：在最短CA的计数方面本发明有8个样本与Sanger 测序法不一致，两种方法结果一致率为92.9％。分析不一致产生原因为：在Sanger测序法中， 如果核酸序列中存在poly结构(如EGFR Intron1的poly CA)，由于Sanger测序技术的局限， 导致poly CA后面的序列未能测通，出现乱峰的现象，影响了读图的准确性(参见图6-7)， 未能区别纯合子与杂合子。本发明方法较Sanger测序法较优，还在于能清晰区分杂合子与纯 合子，如图8-9所示：样本4234与4301分别为纯合子与杂合子。

BIM缺失多态性频率为18.8％，本发明与Sanger测序法比较，灵敏度95.5％，特异度100％， 阳性预测值为100％，阴性预测值为98.9％。

表5本发明方法检测BIM缺失多态性灵敏度与特异度

注：DEL表示缺失，WT表示野生型。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其 他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等 效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。