一种UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其dsRNA在防治桔小实蝇中的应用

摘要

本发明提供了桔小实蝇UDP- N -乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因，并构建其RNA、DNA等构建体，利用RNAi技术沉默桔小实蝇体内UDP- N -乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因，使体内该酶的表达明显受到抑制，导致桔小实蝇产生致死效应，可应用于RNAi技术对桔小实蝇害虫防治。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因、蛋白、dsRNA及其在桔小实蝇防治中的应用。

背景技术

桔小实蝇Bactrocera> (Hendel)，属双翅目（Diptera）实蝇科（Tetriphitedae）。该虫寄主范围广，可危害番石榴、芒果、柑橘等46科250多种水果、蔬菜和花卉，是一种重要的果蔬害虫。桔小实蝇主要以幼虫潜居果瓤取食，使果实腐烂、落果，对水果和蔬菜造成巨大的经济损失。然而，由于大量不合理地使用化学农药，导致了一系列问题： 1、华南地区桔小实蝇种群已对有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯和阿维菌素等农药产生了严重的抗药性 ，农药施用量增加，防治成本升高；2、农药残留严重污染环境，对食品安全和农产品质量也造成了威胁；3、造成有害生物天敌减少，破坏了生态平衡，反而加剧了农业有害生物爆发危害。

RNA干扰属于反向遗传学范畴，通过体外合成一段与靶基因同源的dsRNA或siRNA，导入生物体内，使内源性靶基因中同源mRNA降解，从而达到阻抑基因表达的目的。近年来，应用RNA干扰技术防治植食性害虫取得了突破性进展。2007年中国和美国的科学家在Nature Biotechnology杂志上发表的两篇独立论文报道了通过RNA干扰介导的转基因植物可能用于害虫控制。Baum等通过转基因玉米表达液泡ATP酶基因的dsRNA来减少玉米根萤叶甲的危害，从而达到保护玉米生长的目的。Mao等以细胞色素P450基因CYP6AE14为靶标基因，构建了表达其dsRNA的转基因烟草和拟南芥，使取食转基因植物的棉铃虫靶基因受到抑制，从而使棉铃虫对棉子酚的抗性显著降低，以达到防控害虫的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸分子，可以编码桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因，并作为药物靶点，使桔小实蝇致死。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种核酸分子，其特征在于：序列为SEQ ID NO.1及其互补序列。命名为BdUAP，是桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的开放阅读框，编码496个氨基酸，5′-UTR和3′-UTR的长度分别为210>

一种蛋白分子，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.6。是桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的氨基酸序列。

上述核酸分子中，SEQ ID NO.2序列及其互补序列可以作为有效的药物靶点，干扰基因的转录表达。

本发明的另一目的在于针对上述核酸分子，提供有效干扰其转录表达的dsRNA（双链核糖核酸）。

RNA构建体，其包含至少一个双链RNA 区，其至少一条链包含与上述任一核酸分子互补的核苷酸序列。

优选地，RNA构建体，其序列为SEQ ID NO.5或其互补序列。该dsRNA能与桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因mRNA高效结合，并将其剪切为片段，使目标基因高效沉默。

上述dsRNA构建体的合成的上游引物为SEQ ID NO:3和下游引物为SEQ ID NO:4。

DNA构建体，包含了上述核酸分子，或者包含编码上述RNA构建体的区域。

表达构建体，包含了上述DNA构建体。

宿主细胞，包含上述RNA构建体、DNA构建体或表达构建体。

杀虫组合物，包含了上述RNA构建体和/或上述DNA构建体和/或上述表达构建体和/或上述宿主细胞以及适合的载体。

上述任一项RNA构建体和/或DNA构建体和/或表达构建体和/或宿主细胞以及适合的载体和/或杀虫组合物在防治桔小实蝇中的应用。

有益效果

1. 本发明首次给出了桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因序列和氨基酸序列，及其在桔小实蝇蜕皮发育中的作用。

2. 本发明给出了高效沉默目标基因的构建体，使用剂量小，能特异性地沉默UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的mRNA表达，并导致桔小实蝇幼虫无法完成化蛹而死亡。基因沉默效率达到80%以上，致死率达到60%以上。

附图说明

图1：3龄幼虫桔小实蝇注射SEQ ID NO:5后出现表皮黑化、皱缩而出现死亡的表型。A为注射dsGFP的对照，B为注射SEQ ID NO:2合成的dsRNA。

图2：3龄幼虫桔小实蝇注射SEQ ID NO:5后UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的mRNA表达量，α-Tubulin作为内参基因。*P>

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因全长的获得

1.1 UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因在桔小实蝇转录组数据库的获得

采用生物信息学方法，经过反复分析及比对后，获得1条UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段，即SEQ>

1.2 桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因RACE引物设计

基于上述搜索得到的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段的碱基序列，设计特异性引物，序列如下：

5′-RACE上游引物：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'

5′-RACE下游引物：5'-TTCTCCTCGGGCACTGGTT-3'

3′-RACE上游引物：5'-CCGGTGGCATTGTGCATGGTGAG-3'

3′-RACE下游引物：

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'

1.3 桔小实蝇总RNA提取与反转录合成第一链cDNA

取5头桔小实蝇3龄幼虫于液氮内速冻，然后放在研钵中磨碎成细粉，转移入无RNA酶离心管中，加入1 mL TRIzol试剂，提取总RNA，具体步骤参见TRIzol试剂盒说明书。按照TaKaRa公司PrimeScript^TM>

1.4 RACE第一链 cDNA合成

RACE cDNA合成步骤参照SMARTer^TM>

1.5 桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因3′-和5′-末端序列的获得

根据TaKaRa rTaq说明书进一步克隆获得桔小实蝇3′-和5′->N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因序列。

1.6 桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因全长序列的获得

根据所获得的5′-末端和3′-末端以及转录组中cDNA片段序列，利用DNAMAN 5.22（Lynnon BioSoft）软件对测序结果进行拼接和分析，推导的氨基酸采用BLAST软件和ClustalW进行同源性比较分析，确定所获序列为桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的全长序列。

实施例2：桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段及其dsRNA的获得

2.1桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因序列片段的获得

基于实施例1获得桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的碱基序列，根据SEQ>

取5头桔小实蝇3龄幼虫于液氮内速冻，然后放在研钵中磨碎成细粉，转移入无RNA酶离心管中，加入1 mL TRIzol试剂，提取总RNA，具体步骤参见TRIzol试剂盒说明书。按照TaKaRa公司PrimeScript^TM>N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段SEQ>®>

2.2 桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段的dsRNA合成

利用上述纯化获得的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段，按照MEGAscript^®>

实施例3：桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段dsRNA注射致死三龄幼虫

3.1 桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段dsRNA注射

选取三龄第二天大小均一、健康状况一致的幼虫用于注射上述合成的dsRNA。采用微量注射器Nanoject II Auto-Nanoliter Injector（Drummond Scientific）用于注射，注射点位于幼虫侧腹部倒数第三腹节，避开气门，轻微操作，顺着体液流动的方向。注射dsRNA的量为1 μg，并设置dsGFP（1 μg）的对照组，每组45头虫子，3个生物学重复，共计135头。注射完毕后，将虫子置于人工气候室用人工饲料进行饲养，饲养条件为温度27 ± 1°C、相对湿度为70 ± 5% 、光周期L:D = 14:10 h。

3.2注入dsRNA后桔小实蝇三龄幼虫表型的观察

三龄幼虫经注射dsRNA后，注射dsGFP对照组3天后开始蜕皮并全部成功化蛹，羽化至成虫后虫体形态活力正常。注射dsUAP的处理组幼虫共135头，有60%不能正常化蛹，最终死亡，表型如图1所示：虫体表皮黑化、皱缩等现象，无法完成正常地化蛹，最终导致死亡。

3.3 桔小实蝇UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默检测

对于桔小实蝇三龄幼虫dsRNA注射后基因的沉默效率检测，选择72h后整虫虫体作为RNA提取对象，每组设置3个生物学重复。提取各样品的总RNA并反转录成cDNA，用实时荧光定量检测目的基因（UAP）和内参基因（α-Tubulin）的相对表达量，以计算目的基因的沉默效率（图2）。