水飞蓟黄酮木脂素的去甲基衍生物及其制备方法和其用途

摘要

本发明提供了一类水飞蓟黄酮木脂素的衍生物及其制备方法和其用途。本发明使用具有脱甲基活性的人体肠道菌E.limosum ZL-II对水飞蓟黄酮木脂素成分进行生物转化，分离得到四个去甲基衍生物。本发明提供的水飞蓟黄酮木脂素的衍生物对β-淀粉样蛋白42的聚集表现出抑制活性，且明显优于原型化合物及表没食子儿茶素没食子酸酯，具有开发成防治阿尔兹海默症等神经退行性疾病的药物前景。同时本发明提供的水飞蓟黄酮木脂素的衍生物对癌细胞也表现出一定的抑制活性。本发明成果为充分利用水飞蓟资源和提高其经济附加值奠定了工作基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种水飞蓟黄酮木脂素的衍生物及其制备方法和其用途。 

背景技术

水飞蓟(Silybi Fructus)为菊科植物水飞蓟Silybum marianum(L.)Gaertn.(Milk thistle)的干燥成熟果实，原产于南欧、北非，收载于《中华人民共和国药典》(2010版)，性凉，味苦，归肝、胆经，具有清热解毒、疏肝利胆的功效，临床上用于肝胆湿热，胁痛，黄疸等肝胆疾病。水飞蓟主要包括6个黄酮木脂素类化合物的同分异构体，分别为水飞蓟宾A/B(silybin A/B，两个非对映异构体)、异水飞蓟宾A/B(isosilybin A/B，两个非对映异构体)、水飞蓟亭(silychristin)和水飞蓟宁(silydianin)。这类黄酮木脂素化合物已被开发成中成药水飞蓟素(又名益肝灵、利肝泰、西利马灵、利肝隆，CAS NO.65666-07-1)，临床上用于急、慢性肝炎，早期肝硬化，中毒性肝损伤等疾病的治疗；水飞蓟黄酮类成分也是保肝宁、飞当片等保肝利胆药的重要原料；在美国及欧洲将其有效成分水飞蓟宾作为抗氧化食品添加剂。 

发明内容

本发明的目的是提供一种水飞蓟黄酮木脂素的衍生物及其制备方法和其用途。 

本发明提供的一种水飞蓟黄酮木脂素是如式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物： 

本发明的还一个目的是提供式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ所示化合物或式Ⅳ所示化合物的制备方法， 

包括下述步骤1)和2)： 

1)将含有式Ⅴ-式Ⅷ所示化合物的混合物加入培养基基础中；所述培养基基础为 适合菌株Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846生长或发酵的培养液； 

2)将含Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846的菌液接种于步骤1)制备的培养基中，37℃培养48h即得。 

所述方法中，所述步骤1)中，含有式Ⅴ-式Ⅷ所示化合物的混合物与培养基基础的质量体积比为2∶1；所述质量的单位以g计，体积的单位以L计。 

所述方法中，所述步骤1)中，所述将含有式Ⅴ-式Ⅷ所示化合物的混合物加入培养基基础中后，还要121℃高压灭菌15min，然后室温放置备用。 

所述方法中，所述步骤2)中，所述菌液与步骤1)制备的培养基的体积比为1∶5；所述含Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846的菌液的OD₆₀₀为1.826。 

所述的方法中，所述培养基基础具体为庖肉培养基基础，其组成为：蛋白胨30.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母5.0g/L，葡萄糖3.0g/L，磷酸二氢钾5.0g/L，可溶性淀粉2.0g/L，溶剂为水。 

所述含Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846的菌液的制备方法为：取Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846的冻存液室温融化，加入厌氧液体培养基中37℃培养24h后，如此循环进行菌株的扩增。 

所述含Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846的菌液的制备方法中，所述冻存液与厌氧液体培养基的体积比为1∶5；之后重复按照体积比1∶10的比例接种于厌氧液体培养基中扩大体系增菌，直至获得OD₆₀₀＝1.826的500ml菌液。 

所述厌氧液体培养基的组成为：蛋白胨15.0g/L，酵母5.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，牛肉粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，氯化钠5.0g/L，可溶性淀粉3.0g/L，半胱氨酸0.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，血红素0.005g/L，和维生素K₁0.001g/L，溶剂为水。 

所述含有式Ⅴ-式Ⅷ所示化合物的混合物具体为从菊科水飞蓟属植物水飞蓟 Silybum marianum果实中采用甲醇提取的黄酮类化合物的混合物，该黄酮类化合物的混合物主要包括水飞蓟素，所述水飞蓟素包括水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭。 

所述含有式Ⅴ-式Ⅷ所示化合物的混合物具体为每18.0g的混合物中，含式Ⅴ所示化合物5.006％、式Ⅵ所示化合物7.692％、式Ⅶ所示化合物24.006％和式Ⅷ所示化合物14.726％，所述百分数为质量百分含量。 

所述含有式Ⅴ-式Ⅷ所示化合物的混合物具体为水飞蓟甲醇提取物粉末，所述水飞蓟甲醇提取物粉末购自西安瑞迪生物科技有限公司，商品名为水飞蓟素，CAS NO.：65666-07-1。 

所述的方法中，还包括分离纯化步骤；所述分离纯化步骤包括大孔吸附树脂XAD-2分离纯化过程、ODS中压色谱分离纯化过程和制备型高效液相色谱分离纯化过程。 

所述大孔吸附树脂XAD-2分离纯化过程的条件为：将权利要求2中步骤2)所得的培养液进行如下操作，每24L的培养液，过滤得上清液，上样于XAD-2大孔吸附树脂柱，分别依次用去离子水、10％乙醇水溶液、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液各6个柱体积和60％乙醇水溶液8个柱体积进行洗脱，收集60％乙醇洗脱液流分，去除溶剂得7.48g Fr.1；所述柱子填料为XAD-2大孔吸附树脂，1.7kg，粒度20-60目，平均表面积330m²/g，柱高×内径为450×90mm；所述柱体积具体指一个柱体积为1L；所述％指乙醇在乙醇水溶液中的体积百分数； 

所述ODS中压色谱分离纯化过程的条件为：将7.48g Fr.1与11.22g反相硅胶ODS拌样后干法上样，柱子体积为36×460mm，填料为ODS，粒径20-45μm，经ODS中压色谱甲醇-水系统洗脱分离，洗脱液的流速20ml/min，先以250ml 40％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱开始至第250ml的洗脱液，去除溶剂后获得100.3mg的Fr.1-1；再以45％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱开始至第700ml初的洗脱液，去除溶剂后得325.3mg的Fr.1-2；再收集第700ml末至第1600ml末的洗脱液，去除溶剂后得776.3mg的Fr.1-3；所述％指甲醇在甲醇水溶液中的体积百分数； 

所述制备型高效液相色谱分离纯化过程的条件为：采用制备型高效液相色谱仪SHIMADZU LC-20A，制备柱Inertsil ODS-3column，柱高×内径为250×20mm，粒径5μm，以甲醇和0.1％甲酸水溶液的混合液作为洗脱缓冲液进行等度洗脱，分别纯化Fr.1-1、Fr.1-2和Fr.1-3，所述洗脱缓冲液中，甲醇体积百分含量为48％；所述0.1％甲酸水溶液中，甲酸的体积百分含量为0.1％；将100.3mg的Fr.1-1、325.3mg的Fr.1-2和776.3mg的Fr.1-3分别用甲醇溶解为20.0mg/mL的制备母液，将母液分别进行制备型高效液相色谱分离纯化；每次进样量1.0mL，流速10.0mL/min；针对Fr.1-1 样品，收集保留时间为38～41min的流分，去除溶剂后得到43.2mg的式Ⅳ所示化合物；针对Fr.1-2样品，收集保留时间为45～53min的流分，去除溶剂后得到57.9mg的式Ⅲ所示化合物；针对Fr.1-3样品中，先收集保留时间为63～72min的流分，去除溶剂后得到61.5mg的式Ⅱ所示的化合物，再收集保留时间为75～78min的流分，去除溶剂后得到26.3mg的式Ⅰ所示的化合物。 

所述方法直接制备得到的化合物也属于本发明保护的范围。 

本发明的还一个目的是提供式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物，或所述方法直接制备得到的化合物在制备具有下述任一用途的产品中的应用： 

1)治疗阿尔茨海默病； 

2)抑制Aβ₄₂蛋白聚集； 

3)治疗癌症； 

4)抑制人宫颈癌细胞、人前列腺癌细胞、人胃癌细胞和/或人结肠癌细胞的活性。 

所述人宫颈癌细胞具体为人宫颈癌细胞Hela；所述人前列腺癌细胞具体为人前列腺癌细胞DU-145；所述人胃癌细胞具体为人胃癌细胞BGC-823；所述人结肠癌细胞具体为人结肠癌细胞SW-480。 

本发明的再一个目的是提供Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846菌株在制备下述式Ⅰ-式Ⅳ任一所示化合物中的应用： 

本发明使用具有脱甲基活性的人体肠道菌E.limosum ZL-II对水飞蓟黄酮木脂素成分进行生物转化，分离得到四个去甲基衍生物，其中两个为新化合物，以及该类化合物在开发成防治阿尔兹海默症等神经退行性疾病的药物前景。 

该类衍生物通过ESI-TOF/MS，¹H NMR，¹³C NMR，HMBC和CD光谱分析，结构分别被鉴定为去甲基异水飞蓟宾B(T1)、去甲基异水飞蓟宾A(T2)、去甲基水飞蓟宾B(T3)和去甲基水飞蓟宾A(T4)。T1-T4均为首次分离到的转化产物，T1和T2为新化合物。该类化合物对阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白42(β-amyloid 42，Aβ₄₂)的聚集表 现出抑制活性，且明显优于原型化合物及阳性对照表没食子儿茶素没食子酸酯。同时T1-T4对人宫颈癌细胞Hela有抑制活性，T1和T2对人前列腺癌细胞DU-145有抑制活性，T1对人胃癌细胞BGC-823有抑制活性，T2对人结肠癌细胞SW-480有抑制活性；但该类化合物对四种肿瘤细胞的抑制活性整体上比原型化合物低。 

本发明成果为充分利用水飞蓟资源和提高其经济附加值奠定了工作基础；且该类衍生物在阿尔茨海默病等神经退行性疾病的治疗上有潜在的应用前景。 

附图说明

图1为ZL-II菌株的16S rRNA基因序列同源性分析及鉴定结果。其中，Strain ZL-II菌株即表示ZL-II菌株。 

图2为P1-P4和T1-T4的化学结构及生物转化路径，其中*表示新化合物。 

图3为T1-T4对Aβ₄₂聚集的抑制率-浓度曲线。 

图4为P1-P4对Aβ₄₂聚集的抑制率-浓度曲线。 

图5为化合物P1-P4和T1-T4对人肿瘤细胞的抑制活性统计结果图。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

下述实施例所使用的人体肠道菌为粘液真杆菌Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.6846，保藏日期为2012年11月20日，分类命名为Eubacterium limosum。保藏中心的地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。 

下述实施例中所用的水飞蓟甲醇提取物粉末是从菊科水飞蓟属植物水飞蓟Silybum marianum果实中采用甲醇提取的黄酮类化合物的混合物，该黄酮类化合物的混合物主要包括水飞蓟素，所述水飞蓟素包括水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭。 

所述水飞蓟甲醇提取物粉末购自西安瑞迪生物科技有限公司，商品名为水飞蓟素，CAS NO.：65666-07-1。 

下述实施例中使用的培养基的的组成为： 

庖肉培养基基础(购自北京陆桥技术有限责任公司，产品目录号CM605)：蛋白胨30.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母5.0g/L，葡萄糖3.0g/L，磷酸二氢钾5.0g/L，可溶性淀粉2.0g/L，溶剂为水，pH 7.8。 

厌氧液体培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司，产品目录号CM1513)：蛋白胨15.0g/L，酵母5.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，牛肉粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，氯化 钠5.0g/L，可溶性淀粉3.0g/L，半胱氨酸0.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，血红素0.005g/L，和维生素K₁ 0.001g/L，溶剂为水，pH 7.3±0.2。 

无碳源培养基：NaCl(3.0g)，NH₄Cl(1.0g)，PBS(100mL)，去离子水900(mL)，pH 6.4。使用前分装于10mL连盖塑料离心管，每管5mL；表面覆盖1mL液体石蜡；121℃高压蒸汽灭菌20min；室温放置备用。PBS：KH₂PO₄(26.0g)，K₂HPO₄(18.5g)，去离子水(1L)。 

下述实施例中所涉及的样本中肠二醇(END)的HPLC检测方法如下： 

取200μL培养液，加入400μL水饱和正丁醇萃取，4800rpm/min离心10min，取上清液320μL于离心管中，氮气吹干，加入200μL色谱甲醇，10000rpm/min离心3min，取上清液20μL进HPLC检测。色谱柱：Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×25cm，5μm，美国Agilent公司)；保护柱Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×12.5mm，5μm，美国Agilent公司)；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～30min(A∶B体积比由100∶0线性梯度变化至50∶50)，30～40min(A∶B体积比由50∶50线性梯度变化至0∶100)；流速1.0mL/min；检测波长280nm；温度25℃。 

下述实施例中所述的液体的百分含量为体积百分数。 

实施例1、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)ZL-II的分离与鉴定 

一、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)ZL-II的分离 

采集新鲜人或小鼠粪便标本，经庖肉培养基增菌，得到肠道菌群样本，接种到5mL无碳源培养基中，加入底物亚麻籽粕(粒径为200μm-1000μm)100mg，37℃厌氧培养48h。取10μL无碳源培养基菌液，10倍梯度稀释。取10^-6倍稀释液涂平板，37℃厌氧培养24h。挑取其中的单菌落，接种到5mL无碳源培养基中，加入底物亚麻籽粕(粒径为200μm-1000μm)100mg，培养2天后进行HPLC检测，筛选可以产生肠二醇的单菌落。取10μL活性菌的菌液加入庖肉液体培养基增菌，10^-5倍稀释液涂平板，厌氧培养48h后观察，有白色且较大(Strain-I)、黄色(ZL-II)和透明且较小(ZL-III)三种不同颜色和形态的菌落。 

二、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)ZL-II的鉴定 

1、细菌基因组DNA提取 

取ZL-II菌种0.5mL接种到厌氧液体培养基5mL培养20h，取1mL菌液进行基因组DNA提取。细菌基因组提取使用试剂盒(天根公司，目录号DP209)，按照试剂盒说明书操作，得到120μL基因组提取液。经琼脂糖凝胶电泳检测，证实细菌基因组DNA提取成功。 

2、16S rRNA扩增及测序 

(1)引物设计：采用肠道菌通用引物，由上海生工公司合成。 

正向引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 

反向引物：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 

(2)PCR反应体系：见表1。 

表1.PCR扩增反应体系(50μL) 

(3)PCR扩增反应程序： 

(4)测序：PCR产物未纯化，送北京奥科生物公司测序。 

3、16S rRNA序列分析 

16S rRNA序列如序列表中序列1所示。对其16S rRNA基因序列进行同源性分析，ZL-II菌株被鉴定为粘液真杆菌（Eubacterium limosum）（图1）。该粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II已于2012年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6846）。 

实施例2、生物转化法制备化合物T1-T4 

(一)生物转化过程 

精密称取水飞蓟甲醇提取物粉末48.0g加入到24L庖肉培养基基础，分至12个培养瓶中(2L/瓶)，121℃高压灭菌15min，室温放置备用。 

取粘液真杆菌Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846的冻存液1ml室温融化，加入5mL的厌氧液体培养基中37℃培养24h，之后重复按照体积比1∶10的比例接种于厌氧液体培养基中扩大体系增菌，直至获得OD₆₀₀＝1.826的500ml菌液，最后取400ml(OD₆₀₀＝1.826)菌液接种于上述2L灭菌后的含水飞蓟甲醇提取物的庖肉培养基基础 中，37℃培养48h。12个样品瓶平行依此操作。 

(二)水飞蓟黄酮木脂素类成分及其去甲基衍生物的分离、鉴定 

1、水飞蓟黄酮木脂素类成分的分离 

所述水飞蓟甲醇提取物粉末(18.0g)经超声提取，ODS中压色谱和制备型高效液相色谱分离纯化得到P1(24.6mg)，P2(56.4mg)，P3(58.5mg)和P4(40.1mg)。 

所述超声提取过程及条件：精密称量水飞蓟提取物18.0g，加入甲醇360ml，超声提取60min(500W，40KHz，60℃) 

ODS中压色谱纯化过程及条件：甲醇提取液过滤后经40℃减压浓缩至30mL，与反相硅胶拌样后干法上样，经ODS中压色谱甲醇-水梯度系统洗脱分离，获得Fr.2-1(50％甲醇部分洗脱液，300mL，263.5mg)，Fr.2-2(50％甲醇部分洗脱液，300mL，397.0mg)和Fr.2-3(55％甲醇洗脱液，1200mL，829.0mg)。 

上述制备型高效液相色谱分离纯化过程及条件：以甲醇(A)-0.1％甲酸(B)系统45％A等度洗脱纯化Fr.2-1、Fr.2-2和Fr.2-3中主要成分。从Fr.2-1中得到P4(40.1mg)，从Fr.2-2中得到P3(58.5mg)，从Fr.2-3中得到P2(56.4mg)和P1(24.6mg)。 

2、水飞蓟黄酮木脂素类成分的去甲基衍生物的分离 

将上述步骤(一)经粘液真杆菌Eubacterium limosum ZL-II CGMCC NO.6846 37℃培养48h后所得的生物转化的培养液(24L)经过大孔吸附树脂XAD-2，ODS中压色谱和制备型高效液相色谱的分离纯化，得到转化成分T1(26.3mg)，T2(61.5mg)，T3(57.9mg)和T4(43.2mg)。下述分离纯化过程中，所述的液体与液体的百分数均为体积百分数。 

上述大孔吸附树脂XAD-2纯化过程及条件：培养液(24L)用8层纱布和棉花过滤得上清液，上样于XAD-2大孔吸附树脂柱(填料为XAD-2大孔吸附树脂，1.7kg，粒度20-60目，平均表面积330m²/g，柱高×内径为450×90mm)，分别依次用去离子水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇各6个柱体积(6.0L)和60％乙醇8个柱体积(8.0L)进行洗脱，收集60％乙醇洗脱液流分，去除溶剂后得Fr.1(7.48g)。所用的乙醇溶液为乙醇的水溶液。 

上述ODS中压色谱分离纯化过程的条件为：将7.48g Fr.1与11.22g反相硅胶ODS拌样后干法上样，柱子体积为36×460mm，填料为ODS，粒径20-45μm，经ODS中压色谱甲醇-水系统洗脱分离，洗脱液的流速20ml/min，先以250ml 40％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱开始至第250ml的洗脱液，去除溶剂后获得100.3mg的Fr.1-1；再以45％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱开始至第700ml初的洗脱液，去除溶剂后得325.3mg的Fr.1-2；再收集第700ml末至第1600ml末的洗脱液，去除溶剂后得776.3mg的Fr.1-3；所述％指甲醇在甲醇水溶液中的体积百分数； 

上述制备型高效液相色谱分离纯化过程的条件为：采用制备型高效液相色谱仪SHIMADZU LC-20A，制备柱Inertsil ODS-3 column，柱高×内径为250×20mm，粒径5μm，以甲醇和0.1％甲酸水溶液的混合液作为洗脱缓冲液进行等度洗脱，分别纯化Fr.1-1、Fr.1-2和Fr.1-3，所述洗脱缓冲液中，甲醇体积百分含量为48％；所述0.1％甲酸水溶液中，甲酸的体积百分含量为0.1％；将100.3mg的Fr.1-1、325.3mg的Fr.1-2和776.3mg的Fr.1-3分别用甲醇溶解为20.0mg/mL的制备母液，将母液分别进行高效液相色谱分离纯化；每次进样量1.0mL，流速10.0mL/min；针对Fr.1-1样品，收集保留时间为38～41min的流分，去除溶剂后得到43.2mg的T4；针对Fr.1-2样品，收集保留时间为45～53min的流分，去除溶剂后得到57.9mg的T3；针对Fr.1-3样品中，先收集保留时间为63～72min的流分，去除溶剂后得到61.5mg的T2，再收集保留时间为75～78min的流分，去除溶剂后得到26.3mg的T1。 

3、水飞蓟黄酮木脂素类成分及其去甲基衍生物的鉴定 

利用核磁(¹H-NMR，¹³C-NMR，HMBC)和圆二色散(CD)光谱对化合物P1-P4和T1-T4进行结构鉴定，¹H-NMR、¹³C-NMR及CD谱数据见表1-4。P1-P4和T1-T4的化学结构及由其化学结构推理的生物转化路径见图2。 

表1 化合物P1、P2和T1、T2的¹HNMR数据(J，Hz) 

表2 化合物P3、P4和T3、T4的¹HNMR数据(J，Hz) 

表3.化合物的¹³CNMR数据 

表4.T1-T4和P1-P4的cotton效应[Circular dichroism(Wavelength at extremum)] 

实施例3、化合物P1-P4和T1-T4对Aβ₄₂蛋白聚集的抑制活性 

阿尔茨海默病(又称老年痴呆症，Alzheimer′s disease，AD)是一种神经系统疾病。在众多的发病机制中，β淀粉样蛋白——尤其β-淀粉样蛋白42(Aβ₄₂)的自我聚集导致的神经毒性被认为是阿尔茨海默病的首要诱因。 

本实施例采用硫代黄素T(Thioflavin T，ThT)荧光法，对化合物T1-T4和原型化合物P1-P4进行了β-淀粉样蛋白42(Aβ₄₂)聚集的抑制活性检测。 

(一)实验条件 

1.仪器设备 

AR1140型电子天平(奥豪斯，美国)；WMK-02型恒温培养箱(湖北省黄石市医疗器械厂)；F96Pro荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司)。 

2.材料与试剂 

人源Aβ₄₂合成肽(上海强耀生物科技有限公司，纯度＞95％)；硫代黄素T，六氟异丙醇HFIP(Sigma-Aldrich，USA)；甘氨酸(北京康倍斯科技有限公司，纯度＞99.99％)；表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)对照品(上海源叶生物科技有限公司)。 

甲醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)；二甲基亚砜DMSO(Amresco，USA)；氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾(分析纯，北京市化工厂)；纯净水(娃哈哈纯净水)。 

(二)实验方法 

1.试剂的配制 

PBS溶液：精密称取NaCl 0.801g，KCl 0.020g，Na₂HPO₄ 0.178g和KH₂PO₄ 0.027 g，混合后用纯净水定容至100mL(pH7.4)。 

NaOH溶液：精密称取0.800g NaOH，用纯净水定容至100mL，得到终浓度0.2M的NaOH溶液，用纯净水稀释至10mM待用。 

甘氨酸溶液：精密称取甘氨酸0.3752g，纯净水定容至25mL，终浓度0.2M。 

甘氨酸-NaOH溶液：向12.5mL 0.2M的甘氨酸溶液中加入0.2M NaOH溶液至pH 8.5，再用纯净水定容至50mL，甘氨酸终浓度为50mM。 

硫代黄素T(ThT)溶液的配制：精密称取ThT 1mg，加入纯净水1mL溶解，于-20℃冻存。 

2.样品对Aβ₄₂聚集抑制活性的筛选 

1)Aβ₄₂溶液的制备 

取1管人源Aβ₄₂合成肽(内含肽1mg)，加入1mL乙腈∶水(1∶1，v/v)的溶剂溶解，分装至20个离心管中。用氮气吹干后，在室温下真空干燥2h，Aβ₄₂含量为50.0μg/管。将处理后的Aβ₄₂于-40℃冻存。 

处理后的Aβ₄₂，平衡至室温后加入10mL HFIP，室温密封放置2小时，开盖过夜挥干HFIP。加入40μL上述配制的10mM NaOH溶液，超声10min溶解，再加入160μL上述配制的PBS溶液，超声1min得到Aβ₄₂溶液。 

2)样品溶液的配制 

将EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)和实施例2制备得到的化合物T1-T4分别溶于DMSO中，制备成浓度梯度分别为1.5mM、0.5mM、0.1mM和0.05mM的阳性对照溶液和样品溶液。 

将实施例2制备得到的化合物P1-P4分别溶于DMSO中，制备成浓度梯度分别为2.0mM、1.5mM、0.5mM和0.1mM的样品溶液。 

3)样品与Aβ₄₂的孵育反应 

将上述配制的Aβ₄₂溶液分装至离心管(9μL/管)，再分别加入上述配制的各样品溶液(1μL)混合均匀，37℃孵育24h。以加入EGCG阳性对照溶液的Aβ₄₂溶液作为阳性对照，以加入1μL DMSO的Aβ₄₂溶液作为阴性对照，同时每一个样品均建立不含Aβ₄₂的空白对照。在上述反应体系中Aβ42的终浓度约为50μM。 

4)ThT荧光实验 

取冻存的ThT溶液，取8μL加入1mL甘氨酸-NaOH溶液，得到ThT-甘氨酸溶液。向上述步骤3)所述的反应体系中各加入40μL新鲜配制的ThT-甘氨酸溶液，充分混匀后避光放置10min，用荧光分光光度计测量溶液荧光强度。激发波长440nm，15档增益，测定300-600nm波长的发射荧光光谱，以文献报道的482nm发射光的荧光值作为接收点。 

每个样品在减除空白对照的荧光值后与阴性对照DMSO组比较抑制率I％＝[1-(F_s-F_B)/(F_D-F_BD)]×100％(Fs为样品溶液荧光值，F_B为对应无Aβ₄₂的空白溶液荧光值，F_D为DMSO阴性对照溶液荧光值，F_BD为无Aβ₄₂反应体系的DMSO对照溶液溶液荧光值)。 

(三)实验结果与讨论 

ThT可以特异性地嵌入Aβ₄₂的聚集物中并在440nm激发光作用下在482nm产生特征性的发射荧光，因此可以定量地测定Aβ₄₂的聚集状态及相关抑制活性。应用此方法本节对T1-T4和P1-P4进行Aβ₄₂聚集抑制活性的筛选，结果见表5和图3-图4。表5结果表明，T1-T4和P2、P3表现出抑制作用，而P1和P4的效果不明显(IC₅₀＞200μM)。T1、T2、T3和T4的IC₅₀值分别为10.46μM，7.49μM，7.95μM和9.78μM，表现出显著的抑制活性，与阳性对照EGCG(IC₅₀＝9.01μM)效果相当。然而，P2和P3的IC₅₀值分别是166.35μM和145.10μM，表现出一定的抑制活性。从图3-4的抑制率-浓度曲线中可以看出，相同浓度的T1-T4比P1-P4表现出更高的抑制活性。 

表5 

n＝3数据分析使用SPSS19.0统计学分析软件。 

以上实验结果证实了P1-P4的去甲基转化产物T1-T4有更好的神经保护作用，在阿尔茨海默病等神经退行性疾病的治疗上有潜在的应用前景。 

实施例4、化合物P1-P4和T1-T4对癌细胞的抑制活性 

本实施例采用CellTiter-Glo发光法分别测定了T1-T4和P1-P4对4种人肿瘤细胞系(人宫颈癌细胞Hela，人前列腺癌细胞DU-145，人胃癌细胞BGC-823和人结肠癌细胞SW-480)的抑制活性。 

人宫颈癌细胞Hela、人前列腺癌细胞DU-145、人胃癌细胞BGC-823、人结肠癌细胞SW-480均购自中美冠科生物技术有限公司。 

(一)实验条件与方法 

1实验条件 

人宫颈癌细胞Hela，人前列腺癌细胞DU-145，人胃癌细胞BGC-823和人结肠癌细胞SW-480分别依次培养于含体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)，100units/mL 青霉素和100units/mL链霉素的1640培养基，MEM培养基，1640培养基和MEM培养基中。癌细胞在含体积百分含量5％的CO₂的潮湿环境下37℃培养。通过CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega，USA)测定细胞活力。 

2实验方法 

癌细胞以1000cells/孔的初始密度接种到384孔板。细胞培养18-24h后分别加入化合物T1-T4、P1-P4(终浓度均为20μM)孵育，以星形孢菌素(Staurosporine)作为阳性对照。经过72h孵育后，加入15μL CellTiter-Glo发光试剂，孵育10min。 

使用Multimode Microplate Reader Varioskan Flash(Thermo Scientific，USA)测定样品的相对发光单位(RLU)，减去溶剂对照的RLU后计算抑制率。 

(二)实验结果与讨论 

化合物T1-T4和P1-P4对4种肿瘤细胞表现出不同的抑制活性，结果见图5。图5结果显示，T1-T4和P1-P4对Hela均显示抑制活性，T1、T2和P1-P3对DU-145显示抑制活性，T1、P1和P2对BGC-823显示抑制活性，T2、P1和P4对SW-480显示抑制活性。但转化产物T1-T4对4种肿瘤细胞的抑制活性整体上比原型化合物P1-P4低，证实了黄酮木脂素类成分的去甲基化会减弱抗肿瘤活性的构效关系。