一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的microRNA及其应用

摘要

本发明公开了一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的microRNA及其应用。本发明提供了序列表的序列1所示的单链RNA（microRNA）。本发明提供的microRNA可以显著降低猪繁殖与呼吸综合征病毒对细胞的损伤（即降低细胞病变），有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的组成蛋白（以Gp5和N蛋白为代表）的合成，并极大地降低子代病毒粒子的产生。本发明为猪繁殖与呼吸综合征的治疗和预防提供了依据。本发明提供的microRNA有望作为新型的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物，具有重大的价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)增殖的microRNA及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）， 又称为猪蓝耳病，是由PRRS病毒（PRRS virus,PRRSV）引起的猪的一种高发传染病， 可引起母猪的繁殖障碍、各年龄猪发生呼吸道症状以及仔猪死亡，此外还可以导致免 疫抑制从而诱发继发感染，对全世界的养猪业都造成了巨大的经济损失。该病在1987 年首次发现于美国，而后迅速传播到加拿大及欧洲各地，如今这种疾病已经传播到世 界各地。尤其是2006年下半年以来，我国25个省份爆发了由毒力变异的高致病性PRRSV 毒株（H-PRRSV）为主要病原的“猪高热病”（HP-PRRS），本病的传染性极强，一旦感 染，会引起妊娠母猪早产、流产、死胎、弱胎和木乃伊胎，导致公猪种用性能下降， 加剧病情，死亡率升高，给我国的养猪业造成严重的经济损失。

PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，根据病毒抗原的抗原性、基因组及致病性 差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型（I型，以LV株为代表）和美洲型（II型，以VR2332 株为代表）。目前在我国流行的主要是II型毒株。该病毒的基因组大约长15.4k bp,含 有至少10个开放阅读框:ORF1a/1b,ORF2a/2b,ORF3-4,ORF5/5a,ORF6-7，分别编码 病毒的非结构蛋白nsp1-14，Gp2a/E，Gp3，Gp4，Gp5/Gp5a，M和N蛋白。

疫苗接种是当前预防PRRS的最普遍方法，国内外已有商业化的PRRS疫苗，包括弱 毒疫苗和灭活疫苗。但是，弱毒疫苗在提供免疫保护的同时，还会持续散播疫苗病毒， 使得病毒在猪场中循环存在，可能发生重组变异等，存在着毒力返强等不安全性问题， 有时甚至引发PRRS爆发。而灭活疫苗存在着免疫剂量大、免疫次数多、免疫产生周期 长，不能对非疫苗株型的病毒侵染提供免疫保护等缺点，不太适合仔猪免疫，而仔猪 带毒是猪场PRRSV持续存在的重要原因。所以，研发有效抑制PRRSV感染的方法就显得 尤为重要。

microRNAs（miRNA）是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹 结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶加工后生成。它通 过与其目标mRNA分子的3'端非编码区域(3'UTR)互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到 抑制，通过抑制靶基因的翻译过程或促使靶基因的mRNA降解。miRNA的合成和作用机制 如下：在细胞核内编码miRNA的基因转录成pri-microRNA(pri-miRNA)。pri-miRNA在一 种Drosha RNase的作用下，剪切为约70个核苷酸长度，具有茎环结构的miRNA前体 (pre-miRNA)。pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin 5的作用下， 从核内运输到胞质中。在Dicer酶(双链RNA专一性RNA内切酶)的作用下，miRNA前 体被剪切成21-25个核苷酸长度的双链miRNA。起初，成熟miRNA与其互补序列互相结 合成所谓miRNA:miRNA*双螺旋结构(miRNA*是miRNA的反向互补序列)；随后，双螺旋 解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex， RISC)中，形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assembly)，该复合物会结合到 目标靶mRNA上。在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3' UTR不完全互补配对，从而阻断该基因的翻译过程。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)增殖的microRNA 及其应用。

本发明提供的microRNA为序列表的序列1所示的单链RNA。

本发明还保护序列表的序列2所示的DNA分子（编码所述microRNA的DNA分子）。

含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。

所述重组载体可为将功能DNA片段导入siSTRIKE^TMU6载体得到的重组质粒；所述 功能DNA片段包括如下三个元件：所述DNA分子、与所述DNA分子反向互补的DNA分 子以及位于两者之间的间隔序列。所述功能DNA片段具体可为将序列表的序列3自5’ 末端第4-57位核苷酸所示的单链DNA分子和序列表的序列4自5’末端第10-63位核 苷酸所示的单链DNA分子退火形成的双链DNA分子。所述重组载体具体可为将序列表 的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子退火形成的双链 DNA分子导入siSTRIKE^TMU6载体得到的重组质粒。

所述重组质粒中，所述功能DNA片段编码的RNA形成具有茎环结构的miRNA前体。 在Dicer酶的作用下，miRNA前体被剪切成双链miRNA。随后，双螺旋解旋，其中一 条（microRNA）结合到RNA诱导的基因沉默复合物中，形成非对称RISC复合物，该 复合物会结合到目标靶mRNA上，从而阻断该基因的翻译过程，最终抑制猪繁殖与呼吸 综合征病毒增殖。

本发明还保护一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的产品，它的活性成分为所 述单链RNA、所述DNA分子、所述重组载体、所述表达盒、所述转基因细胞系和所述 重组菌中的至少一种。

本发明还保护所述单链RNA、所述DNA分子、所述重组载体、所述表达盒、所述 转基因细胞系和所述重组菌中的至少一种在如下（a）或（b）或（c）或（d）中的应 用：（a）制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的产品；（b）抑制猪繁殖与呼吸综合 征病毒增殖；（c）制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的产品；（d）抑制猪繁殖与 呼吸综合征病毒感染。

以上任一所述抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖具体可体现为如下（1）、（2）和 （3）中的至少一种：（1）抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的细胞病变；（2）抑制细 胞中猪繁殖与呼吸综合征病毒组成蛋白的表达；（3）抑制细胞中猪繁殖与呼吸综合征 病毒粒子的产生（降低细胞培养上清中的猪繁殖与呼吸综合征病毒滴度，滴度具体可 通过TCID₅₀体现）。所述组成蛋白具体可为Gp5蛋白和/或N蛋白。所述（1）和/或（2） 和/或（3）中，所述细胞具体可为MARC-145细胞。

以上任一所述猪繁殖与呼吸综合征病毒可为II型猪繁殖与呼吸综合征病毒，具体 可为VR2332毒株。

本发明提供的microRNA可以显著降低猪繁殖与呼吸综合征病毒对细胞的损伤（即 降低细胞病变），有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的组成蛋白（以Gp5和N蛋白为代 表）的合成，并极大地降低子代病毒粒子的产生。本发明为猪繁殖与呼吸综合征的治 疗和预防提供了依据。本发明提供的microRNA有望作为新型的抗猪繁殖与呼吸综合征 病毒药物，具有重大的价值。

附图说明

图1为光学显微镜下观察细胞病变的照片。

图2为Western-Blot结果。

图3为各个病毒液对于MARC-145细胞的TCID₅₀结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。MOI（multiplicity of infection，感染复数）：病毒颗粒数/细 胞数。ATCC即美国模式培养物集存库(American type culture collection)，网址为 http://www.atcc.org/。siSTRIKE^TMU6载体（自身带有粘性末端；具有氨苄抗性）： Promega公司，C7290。Lipofectamine^TM2000（购于Invitrogen，Cat.No.11668-027， 按说明书操作）。细胞裂解液（购于Promega，E194A）。

MARC-145细胞：购于美国模式培养物集存库ATCC，CRL-12231^TM（编号为：CRL-12231 TM（LN 14832 MARC145 CELL LINE(MONKEY KIDNEY)）） （http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CRL-12231&Template=patents）；公众也可从中国科学院微生 物研究所获得；参考文献：Yu,M.,X.Liu,L.Sun,C.Chen,G.Ma,Y.Kitamura, G.F.Gao and W.Liu,2010.Subcellular localization and topology of porcine  reproductive and respiratory syndrome virus E protein.Virus Res 152, 104-114.）。

PRRSV病毒VR2332毒株:购于ATCC（VR-2332^TM） （http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=VR-2332&Template=animalVirology）；公众也可从中国科学院 微生物研究所获得；参考文献：Yu,M.,X.Liu,L.Sun,C.Chen,G.Ma,Y.Kitamura, G.F.Gao and W.Liu,2010.Subcellular localization and topology of porcine  reproductive and respiratory syndrome virus E protein.Virus Res 152, 104-114.）。

实施例1、设计抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的microRNA

基于对猪繁殖与呼吸综合征病毒全序列的分析，设计并筛选，得到ssc-miR-26a 序列，为抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的microRNA。在Sanger数据库 （http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/）中查阅线虫cel-let-7序列（作为阴 性对照），该阴性对照已经通过BLAST比对所有猪、人、大鼠及小鼠的基因组序列以及 microRNA序列。

ssc-miR-26a（序列表的序列1）：5’-UCGGAUAGGACCUAAUGAACUU-3’。

ssc-miR-26a的编码序列（序列表的序列2）：5’-TCGGATAGGACCTAATGAACTT-3’。

cel-let-7：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’。

cel-let-7的编码序列：5’-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3’。

实施例2、重组表达载体的构建

一、ssc-miR-26a表达载体的构建

1、分别合成序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA 分子。

序列表的序列3如下（5’→3’）：

ACCTCGGATAGGACCTAATGAACTTCTTCCTGTCAAAGTTCATTAGGTCCTATCCGATTTTC

（I）                                            （II）

（I）为ssc-miR-26a的编码序列，（II）为（I）的反向互补序列。

序列表的序列4如下（5’→3’）：

TGCAGAAAATCGGATAGGACCTAATGAACTTTGACAGGAAGAAGTTCATTAGGTCCTATCCGAT

2、将序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子退 火，形成带有粘末端的双链DNA分子。

3、将步骤2得到的带有粘末端的双链DNA分子与siSTRIKE^TMU6载体链接，得到 ssc-miR-26a表达载体（重组质粒甲）。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如 下：在siSTRIKE^TMU6载体的粘性末端插入了带有粘末端的双链DNA分子（由序列表的序 列3所示单链DNA分子和序列表的序列4所示单链DNA分子退火后形成）。

二、cel-let-7表达载体的构建

1、分别合成序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA 分子。

序列表的序列5如下（5’→3’）：

ACCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTCTTCCTGTCAAACTATACAACCTACTACCTCATTTTC

（Ⅲ）                                            （Ⅳ）

（Ⅲ）为cel-let-7的编码序列，（Ⅳ）为（Ⅲ）的反向互补序列。

序列表的序列6如下（5’→3’）：

TGCAGAAAATGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTGACAGGAAGAACTATACAACCTACTACCTCAT

2、将序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子退 火，形成带有粘末端的双链DNA分子。

3、将步骤2得到的带有粘末端的双链DNA分子与siSTRIKE^TMU6载体链接，得到 cel-let-7表达载体（重组质粒乙）。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下： 在siSTRIKE^TMU6载体的粘性末端插入了带有粘末端的双链DNA分子（由序列表的序列5 所示单链DNA分子和序列表的序列6所示单链DNA分子退火后形成）。

实施例3、ssc-miR-26a对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的抑制作用

分别进行以下四组处理（平行试验；每个处理进行三次重复）：

处理一（PRRSV感染—miR-26a）：用MARC-145细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达到 80%的时候，通过Lipofectamine^TM2000转染实施例2构建的重组质粒甲（转染剂量为 1μg/孔），37℃孵育24小时；然后感染PRRSV病毒VR2332毒株（感染剂量为1MOI），37 ℃孵育72小时；

处理二（PRRSV感染—阴性对照）：用MARC-145细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达 到80%的时候，通过Lipofectamine^TM2000转染实施例2构建的重组质粒乙（转染剂量为 1μg/孔）37℃孵育24小时；然后感染PRRSV病毒VR2332毒株（感染剂量为1MOI），37 ℃孵育72小时。

处理三（PRRSV感染—阳性对照）：用MARC-145细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达 到80%的时候，加入与处理一等量的Lipofectamine^TM2000，37℃孵育24小时；然后感染 PRRSV病毒VR2332毒株（感染剂量为1MOI），37℃孵育72小时。

处理四（空白对照）：用MARC-145细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达到80%的时候， 加入与处理一等量的Lipofectamine^TM2000，37℃孵育96小时。

完成上述处理后，分别取细胞培养上清（病毒液）和细胞。

取细胞，先用PBS缓冲液洗3次，然后在光学显微镜下观察细胞病变（Cytopathic  effect，CPE），拍照存图。见图1。重组质粒甲能显著减轻PRRSV感染造成的MARC-145 细胞病变（根据microRNA的作用机理，是ssc-miR-26a发挥作用），而重组质粒乙无此 功能。

取细胞，先用PBS缓冲液洗3次，然后用100μl/孔细胞裂解液裂解细胞，通过 Western-Blot方法检测PRRSV的Gp5蛋白和N蛋白表达情况（以β-act in蛋白为内参）。 Western-Blot检测Gp5蛋白所用的一抗为小鼠抗PRRSV的Gp5蛋白多抗（用于制备一抗的 抗原如序列表的序列的序列7所示，；制备方法参见文献：孙颖;马艳;李彬;江云波;肖 少波;方六荣;陈焕春.“抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定”.《动物医学进 展》2007年第11期），所用的二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(购于碧 云天，A0216)。Western-Blot检测N蛋白所用的一抗为小鼠抗PRRSV的N蛋白多抗（用于 制备一抗的抗原如序列表的序列的序列8所示；制备方法参见文献：夏向荣,李玉峰, 姜平.“PRRSV重组N蛋白的抗原性分析及其特异性抗体制备”.《畜牧与兽医》2003 年第09期），所用的二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(购于碧云天， A0216)。Western-Blot检测β-actin蛋白所用的一抗为β-actin小鼠单抗（购于碧云 天，AA128），所用的二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(购于碧云天， A0216)。Western-Blot结果见图2。重组质粒甲能抑制PRRSV的Gp5蛋白和N蛋白的表达 水平（根据microRNA的作用机理，是ssc-miR-26a发挥作用），而重组质粒乙无此功能。

取病毒液测定对于MARC-145细胞的TCID₅₀，通过Reed-Muench法（Reed,L.J.; Muench,H.(1938).A simple method of estimating fifty percent endpoints.The  American Journal of Hygiene 27:493–497.）计算病毒的TCID₅₀。结果见图3（三次 试验的平均值）。图3中，纵坐标为lg（每毫升病毒液的TCID₅₀值）。重组质粒甲能降低 所感染的MARC-145细胞得到的病毒液中PRRSV病毒的滴度（根据microRNA的作用机理， 是ssc-miR-26a发挥作用），而重组质粒乙无此功能。