猪IFITM家族基因的克隆及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

摘要

干扰素(Interferon，IFN)是一类由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性，现已广泛用于人医临床多种疾病的治疗，但干扰素的抗病毒作用并不是直接杀伤或抑制病毒，而是通过与细胞表面受体相互作用，诱导干扰素刺激基因(IFN stimulated genes，ISGs)表达多种抗病毒蛋白，从而抑制病毒的感染与复制。
　　 IFITM(Interferon induced transmembrane protein)蛋白基因家族是最早被确定的干扰素诱导基因(族)之一，包括IFITM1、IFITM2、IFITM3三个功能性成员，分别编码14.6、14.5和13.9kDa的蛋白，这些蛋白在抗病毒、诱导细胞分化、抗肿瘤、免疫监视方面起着显著作用。
　　 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是动脉炎病毒属的成员，引起猪的繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome，PRRS)，该病自1987年发生以来一直严重危害着世界养猪业，筛选有效的抗病毒基因有望为PRRSV的防控提供新的思路。为此，本研究主要克隆了猪IFITM基因并对其与PRRSV的相互作用进行了研究(本研究中猪IFITM基因指猪IFITM1，IFITM2，IFITM3三个基因)，主要内容如下：
　　 1.猪IFITM基因的扩增、序列分析及进化树的绘制
　　 通过对已知的其他物种IFITM基因的序列进行比对分析，预测了猪IFITM家族基因序列，并根据预测的序列分别设计特异性引物，从PK-15细胞中通过RT-PCR扩增获得猪IFITM基因。经测序分析发现猪IFITM家族的核苷酸序列全长分别为375bp、435 bp、438 bp，分别编码124、144、145个氨基酸残基，猪IFITM1与牛、人、鼠、猴的氨基酸序列同源性分别为71%、64%、57%、56%；猪IFITM2与牛、人、鼠的氨基酸序列同源性分别为76%、68%、54%；猪IFITM3与牛、人、鼠、猴的氨基酸序列同源性分别为73%、69%、62%、56%。系统进化树分析表明：不同物种IFITM家族的氨基酸序列存在较大差异，其中猪IFITM与牛IFITM的亲缘关系最近。
　　 2.猪IFITM的亚细胞定位
　　 将猪IFITM基因家族的3个成员分别克隆至pEGFP-C2中，构建真核表达质粒pEGFP-C2-IFITM1、pEGFP-C2-IFITM2、pEGFP-C2-IFITM3，转染PK-15、293细胞，DAPI染色，激光共聚焦显微镜下观察，发现猪IFITM家族定位于细胞膜。
　　 3.猪IFITM家族对PRRSV增殖的影响
　　 将构建的IFITM基因的真核表达质粒分别转染SJPL细胞和CD163-293细胞，然后接种PRRSV WUH3株，并于接毒后24h收毒，绝对定量和空斑试验检测PRRSV的增殖情况，结果证实猪IFITM家族显著抑制PRRSV的增殖
　　 4.PRRSV感染对猪IFITM家族的影响
　　 将pEGFP-C2-IFITMs真核表达质粒转染Marc-145细胞，接种PRRSV，DAPI染色，激光共聚焦显微镜观察，发现PRRSV感染不改变猪IFITM家族在细胞中的定位。
　　 用PRRSV感染PAM细胞，相对定量分析PRRSV感染对猪IFITM基因表达的影响，发现PRRSV在感染PAM细胞后9h能诱导猪IFITM基因的表达。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表(Abbreviation)

1 文章综述

1.1 PRRSV简介

1.2 天然免疫简介

1.3 IFITM简介

1.4 IFITM的功能

1.4.1 IFITM家族参与细胞粘着、分化、增殖

1.4.2 IFITM家族具有抗肿瘤的作用

1.4.3 IFITM家族参与疾病的引发过程

1.4.4 IFITM家族的抗病毒作用

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 菌株、细胞、毒株

3.1.2 引物、载体

3.1.3 主要试剂

3.1.4 各种试剂的配制

3.2 试验方法

3.2.1 DH5a感受态细胞的制备

3.2.2 PRRSV WUH3病毒的培养与收集

3.2.3 基因预测

3.2.4 RT-PCR扩增目的基因

3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测

3.2.6 PCR产物或酶切产物回收与纯化

3.2.7 PCR产物与载体的酶切反应

3.2.8 目的片段与相应载体的连接

3.2.9 连接产物的转化

3.2.10 质粒的小量制备和大提制备

3.2.11 重组质粒(阳性质粒)的鉴定及定量

3.2.12 转染

3.2.13 DAPI核染色

3.2.14 猪IFITM在PK-15细胞，293细胞中的定位，以及PRRSV对猪IFITM细胞定位的影响

3.2.15 瞬时表达猪IFITM观察其对PRRSV增殖的影响

3.2.16 空斑

3.2.17 RNA的提取及逆转录PCR

3.2.18 绝对定量PCR

3.2.19 相对定量PCR

3.2.20 统计学方法

4 结果和分析

4.1 猪IFITM基因预测、克隆、序列分析以及进化树的绘制

4.1.1 猪IFITM基因预测、RT-PCR扩增与克隆

4.1.2 猪IFITM的序列分析及进化树绘制

4.2 猪IFITM的真核表达及Western blotting鉴定分析

4.3 猪IFITM的亚细胞定位

4.4 猪IFITM与PRRSV的相互作用

4.4.1 PRRSV感染不改变猪IFITM在Marc-145细胞中的定位

4.4.2 猪IFITM抑制PRRSV的增殖

4.4.3 PRRSV感染PAM细胞上调猪IFITM的表达

5 讨论与结论

5.1 讨论

5.1.1 猪IFITM基因家族的克隆、序列分析及其进化树绘制

5.1.2 猪IFITM家族的亚细胞定位及真核表达

5.1.3 猪IFITM与PRRSV的相互作用

5.2 结论

参考文献

致谢