一种酿酒酵母及其补料分批发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的工艺

摘要

本发明公开了一种酿酒酵母及其补料分批发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的工艺。该方法通过补充碳源及添加维生素、无机盐及氨基酸等小分子物质对酿酒酵母的代谢网络进行扰动，强化S-腺苷甲硫氨酸的生成途径，使酿酒酵母活力得到大幅度提高。本发明成本低，操作简易，大幅提高了发酵单位及生产产量，有利于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种酿酒酵母及其补料分批发酵生 产S-腺苷甲硫氨酸的工艺。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，是甲硫氨酸的一种有机四价硫形式(金属硫)的磺 酞化合物，被称为“活性甲硫氨酸”。SAM是广泛存在于生物体内的一种重要代 谢中间体，它主要作为三种代谢途径的前体：转甲基作用和转硫基作用、转氨丙 基作用，其结构是1952年由意大利科学家Cantoni所发现的一种能改善细胞代谢 的生理活性物质，主要参与体内激素、神经递质、核酸、蛋白质和磷脂的生物合 成和代谢以及抗氧化剂谷胱甘肽的形成，与体内各种解毒过程关系密切，是维护 细胞膜正常功能、人体正常代谢和健康不可缺少的重要生命物质。

SAM是最具市场潜力的营养强化剂之一。1990年《美国营养补充品健康及 教育法》通过以后，这部法令允许使用和分配SAM做为一种可于柜台出售的食 物添加剂，并于当年通过了美国FDA随机双盲法验证。FDA批准以SAM为名称 作为抗抑郁，保肝护肝，治疗关节炎等为主要作用的食品补剂上市，迅速成为美 国最畅销的保健品之一，现已经成为风行欧美的高档特殊膳食补剂产品。SAM 还是一种有效的治疗抑郁症的物质，可以作为抗抑郁剂来治疗轻微的抑郁状态和 预防抑郁症，防止胆汁积淤；预防慢性活动性肝炎以及其他因素而造成的肝损伤。 预防由于缺氧而造成的神经细胞坏死即缺氧症；促进神经细胞和神经纤维的组织 再生。预防心脏疾病、癌症以及其他疾病的发生。SAM具有显著的治疗和保健 功效，副作用小，而且人们日常的饮食不能提供SAM，所以在我国必将有巨大 的应用研究前景。

国内至今未能实现SAM的工业化发酵生产，本发明利用酿酒酵母可以通过 细胞代谢积累SAM的特点，通过对该菌株的发酵过程补充添加一定量的碳源和 甲硫氨酸，促进便能够在细胞内催化ATP与L-甲硫氨酸反应，可在细胞内大量积 累SAM，为SAM的工业化生产提供借鉴。

发明内容

本发明的目的在于提出一种酿酒酵母，本发明的另一目的是利用该酿酒酵母 补料分批发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的工艺，提高发酵单位和产量，以降 低S-腺苷甲硫氨酸的生产成本。其主要是通过补充碳源及添加维生素、无机盐 及氨基酸等小分子物质对酿酒酵母的代谢网络进行扰动，强化S-腺苷甲硫氨酸 的生成途径，使其产量得到大幅度提高。

本发明的技术方案为：一种酵母，其分类命名为酿酒酵母，菌种的拉丁学名 是Saccharomyces cerevisiae，参据的微生物为：NJYHWG 71082，保藏日期是2012 年2月27日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.5815。

一种利用如权利要求1所述的酿酒酵母发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的工艺， 其具体步骤如下：将酿酒酵母CGMCC No.5815接种于固体培养基中，该固体培 养基组分为：葡萄糖50～70g/L，酵母浸膏3～8g/L，琼脂15～20g/L；在28～ 35℃的条件下培养18～24h；选取一个菌落，挑取菌体，接入装有种子液的培养 基的锥形瓶中瓶培养；种子液培养基组分：葡萄糖：30～50g/L，蛋白胨10～20 g/L，酵母浸膏5～8g/L，pH控制在6.0～7.5；调节转速120～200rpm，28～35 ℃培养18～24h得种子液；取发酵培养基体积5～20％的种子液培养基接入灭菌 后装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；发酵培养基组分：葡萄糖：40～80 g/L，酵母浸膏2～8g/L，无机盐0.465～1.73g/L，维生素0.1～0.3g/L，氨基酸 1～10g/L，pH保持在6.0～7.5；在发酵过程中进行补料添加葡萄糖和甲硫氨酸， 使葡萄糖浓度保持在50～70g/L，甲硫氨酸浓度保持在6～10g/L；控制温度、 通气量和转速，发酵培养40～60h得发酵液。

优选所述的无机盐组成为：NaH₂PO₄：0.2～0.8g/L、Na₂HPO₄：0.2～0.8g/L、 MgSO₄·7H₂O：0.05～0.1g/L、FeSO₄·7H₂O：0.005～0.01g/L、CaCl₂：0.005～0.01 g/L、MnCl₂：0.005～0.01g/L。

在种子液培养基和发酵培养基配制时，用氨水或氢氧化钠调节pH，使其保 持在6.0～7.5。

优选所述的种子液体积装液量为锥形瓶的10％～30％；其中发酵罐装液量为 发酵罐体积的20～50％。优选所述的维生素为硫胺素或钴胺素。

优选发酵进行6～15h时补料添加葡萄糖，使其浓度8～10h内保持在50～ 70g/L，流加所用的葡萄糖的浓度为100～200g/L。优选发酵进行3～5h时，每 隔20～40分钟补料添加甲硫氨酸，使其浓度保持在5～10g/L，发酵进行到第 10～12h时，改成每隔10～20分钟补料添加甲硫氨酸，使其浓度保持在2～8g/L 流加所用的甲硫氨酸的浓度为80～120g/L，发酵进行22～32h时停止补料添加。

优选发酵培养过程中通入无菌空气，通气量控制在2～5L/(L·min)；温度控 制在28～35℃；转速控制在120～200rpm。

CGMCC No.5815菌株具有下述性质：

1、形态特征：

在PDA培养基上，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，有光泽；在显微镜下 (40×)细胞呈圆形和椭圆形，细胞大小(6.0～8.5)×(5.2～6.5)。在麦芽汁 平板上呈乳白色、湿润粘稠有光泽，隆起较高。菌落圆形规则、直径约为2～6mL。 在麦芽汁液体培养基中菌体形态为卵圆形，近似球形，有不发达的假菌丝，单边 出芽。

2、生理生化特性

酿酒酵母CGMCC No.5815菌株的主要生理生化特征如表1所示：

表1：菌株的生理生化特性

注：+：利用或生长；-：不利用或不生长。

有益效果：

本发明公开了一种酿酒酵母；本发明还提供了一种补料分批发酵方法在S- 腺苷甲硫氨酸生产中的应用。该方法通过补充碳源及添加维生素、无机盐及氨基 酸等小分子物质对酿酒酵母的代谢网络进行扰动，强化S-腺苷甲硫氨酸的生成 途径，使酿酒酵母活力得到大幅度提高。本发明成本低，操作简易，大幅提高了 发酵单位及生产产量，有利于工业化生产。

保藏信息

上述酵母，其分类命名为酿酒酵母，菌种的拉丁学名是Saccharomyces  cerevisiae，参据的微生物为：NJYHWG 71082，该菌株是本实验室从南京福朝葡 萄园土壤中自主分离筛选得到，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。其简 称为CGMCC，保藏日期是2012年2月27日，保藏中心登记入册编号是CGMCC  No.5815。

具体实施方式

下面对本发明的实施案例作详细说明，本实施案例以本发明技术方案为前提 下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的担任过程，但本发明的保护范围不 限于下述的实施案例。

实例1：

将酿酒酵母CGMCC No.5815接种于固体培养基中，该固体培养基组分为： 葡萄糖50g/L，酵母浸膏3g/L，琼脂15g/L，在28℃的条件下培养18h。选取一 个呈圆形，表面光滑，边缘整齐，有光泽的较大菌落，挑取菌体，接入装有种子 液的培养基的锥形瓶中瓶培养。种子液培养基组分(g/L)：葡萄糖：30，蛋白胨 20，酵母浸膏5，氨水调节pH，使其控制在6.8。种子液装液量为锥形瓶体积的 10％。调节转速120rpm，28℃培养20h。移取体积比(种子液培养基/发酵培养 基)为5％的种子液接入灭菌后装有液体发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养， 发酵罐装液量(V/V)为20％。发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖：40，酵母浸膏 3，NaH₂PO₄：0.2、Na₂HPO₄：0.2、MgSO₄·7H₂O：0.05、FeSO₄·7H₂O：0.005、 CaCl₂：0.008、MnCl₂：0.005，硫胺素0.1，氨基酸10，氨水调节pH，使其保持 在6.8。发酵进行3h时，发酵进入菌体生长阶段，每隔20分钟补料添加甲硫氨 酸，使其浓度保持在10g/L；发酵进行到第10h时，每隔10分钟补料添加甲硫 氨酸，使其浓度保持在8g/L，流加所用的甲硫氨酸的浓度为80g/L，发酵进行 22h时停止补料添加。在补料添加甲硫氨酸的同时，当发酵进行8h时补料添加 葡萄糖，使其浓度保持在50g/L，维持补加葡萄糖8h，流加所用的葡萄糖的浓 度为100g/L。发酵培养过程中温度控制在28℃，通入无菌空气，通气量控制在 2L/(L·min)，调节转速为120rpm，发酵培养40h得发酵液。检测发酵液中S-腺 苷甲硫氨酸浓度为9.6g/L.。

实例2：

将酿酒酵母CGMCC No.5815接种于固体培养基中，该固体培养基组分为： 葡萄糖60g/L，酵母浸膏5g/L，琼脂18g/L，在30℃的条件下培养22h。选取 一个呈圆形，表面光滑，边缘整齐，有光泽的较大菌落，挑取菌体，接入装有种 子液的培养基的锥形瓶中瓶培养。种子液培养基组分(g/L)：葡萄糖：50，蛋白 胨10，酵母浸膏6，氢氧化钠调节pH，使其控制在6.2。种子液装液量为锥形 瓶体积的20％。调节转速160rpm，30℃培养22h。移取体积比(种子液培养基/ 发酵培养基)为20％的种子液接入灭菌后装有液体发酵培养基的发酵罐中进行发 酵培养，发酵罐装液量(V/V)为35％。发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖：60， 酵母浸膏8，NaH₂PO₄：0.4、Na₂HPO₄：0.5、MgSO₄·7H₂O：0.08、FeSO₄·7H₂O： 0.008、CaCl₂：0.01、MnCl₂：0.008，维生素硫胺素0.3，氨基酸8，氨水调节pH， 使其保持在6.2。发酵进行4h时，发酵进入菌体生长阶段，每隔30分钟补料添 加甲硫氨酸，使其浓度保持在8g/L，发酵进行11h时，每隔15分钟补料添加甲硫 氨酸，使其浓度保持在6g/L，流加所用的甲硫氨酸的浓度为100g/L，发酵进行 28h时停止补料添加。在补料添加甲硫氨酸的同时，当发酵进行12h时补料添加 葡萄糖，使其浓度保持在70g/L，维持补加葡萄糖9h。流加所用的葡萄糖的浓 度为150g/L。发酵培养过程中温度控制在30℃，通入无菌空气，通气量控制在 3.5L/(L·min)，调节转速为160rpm，发酵培养50h得发酵液。检测发酵液中S- 腺苷甲硫氨酸浓度为13.6g/L.。

实例3：

将酿酒酵母CGMCC No.5815接种于固体培养基中，该固体培养基组分为： 葡萄糖70g/L，酵母浸膏8g/L，琼脂20g/L，在35℃的条件下培养24h。选取 一个呈圆形，表面光滑，边缘整齐，有光泽的较大菌落，挑取菌体，接入装有种 子液的培养基的锥形瓶中瓶培养。种子液培养基组分(g/L)：葡萄糖：40，蛋白 胨15，酵母浸膏8，氢氧化钠调节pH，使其控制在7.3。种子液装液量为锥形 瓶体积的30％。调节转速200rpm，35℃培养24h。移取体积比(种子液培养基 /发酵培养基)为15％的种子液接入灭菌后装有液体发酵培养基的发酵罐中进行 发酵培养，发酵罐装液量(V/V)为50％。发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖：80， 酵母浸膏6，NaH₂PO₄：0.8、Na₂HPO₄：0.6、MgSO₄·7H₂O：0.1、FeSO₄·7H₂O： 0.01、CaCl₂：0.005、MnCl₂：0.01，钴胺素0.2，氨基酸2，氨水调节pH，使其 保持在7.3。发酵进行5h时，发酵进入菌体生长阶段，每隔40分钟补料添加甲 硫氨酸，使其浓度保持在5g/L；发酵进行12h时，每隔20分钟补料添加甲硫氨 酸，使其浓度保持在3g/L，流加所用的甲硫氨酸的浓度为120g/L，发酵进行22h 时停止补料添加。在补料添加甲硫氨酸的同时，当发酵进行15h时补料添加葡萄 糖，使其浓度保持在60g/L，维持补加葡萄糖10h。流加所用的葡萄糖的浓度为 200g/L。发酵培养过程中温度控制在35℃，通入无菌空气，通气量控制在5L/(L ·min)，调节转速为180rpm，发酵培养60h得发酵液。检测发酵液中S-腺苷甲硫 氨酸浓度为12.1g/L.。