尿中II型胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒主要包括有：生物素标记的CTX-II抗原：CTX-II抗原的浓度为4.5-5.5μg/ml；CTX-II单克隆抗体溶液，该CTX-II单克隆抗体滴度为1∶950-1∶1050；所述生物素标记的CTX-II抗原与CTX-II单克隆抗体溶液的用量比为1∶1。所述尿中II型胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。

说明书

技术领域

本发明属于医疗器械领域，具体地是涉及一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒及其 制备。

背景技术

软骨结构完整性的损伤是骨关节炎和类风湿关节炎的主要组织学表现。II型胶原蛋白是 软骨的主要有机成分。软骨降解后，II型胶原蛋白的片段(CTX-II)释放进入循环系统，随 后排入尿中。尿中的CTX-II片段可由尿中II型胶原降解产物检测试剂盒定量检测。

据报道，尿中II型胶原降解产物检测有助于预测骨关节炎的发展及其它临床和临床前研 究。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下：

一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，主要包括有：

(A)生物素标记的CTX-II抗原：CTX-II抗原的浓度为4.5-5.5μg/ml；

(B)CTX-II单克隆抗体溶液，该CTX-II单克隆抗体滴度为1∶950-1∶1050；

所述生物素标记的CTX-II抗原与CTX-II单克隆抗体溶液的用量比为1∶1。

进一步地，所述的尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，还包括有过氧化物酶偶联抗体和 包被链菌抗生物素蛋白的微孔板；所述酶偶联抗体的工作滴度为1∶4550-5050。

优选地，所述CTX-II抗原的浓度为5μg/ml，所述CTX-II单克隆抗体的滴度为1∶1000。

本发明另一目的是提供一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒的制备方法。

实现上述目的的技术方案为：

一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤：

1)制备生物素标记的CTX-II抗原；取CTX-II合成肽25mg，与10mL浓度为10mmol/L的 TRIS缓冲液混合，得抗原稀释液；取浓度为1.25mg/mL的生物素，抗原稀释液∶生物素＝1∶4 体积比混合，采用简易过碘酸钠法将生物素与CTX-II合成肽交联；取制备后的生物素标 记的CTX-II抗原，加入防腐剂和稳定剂；所述CTX-II抗原的浓度为4.5-5.5μg/ml；

2)制备CTX-II单克隆抗体溶液：取CTX-II单克隆抗体，用10mmol/L的TRIS缓冲液和 25mol/L的EDTA混合，加入红色素为显色剂，所述CTX-II单克隆抗体滴度为1∶950- 1∶1050。

优选地，所述红色素的浓度为0.03mg/ml。

所述CTX-II单克隆抗体的制备为：取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔58处 部位进行免疫接种，初次免疫注射1mg/mL浓度的CTX-II抗原0.2mL，第3周、第4周及第5 周注射1mg/mL浓度的CTX-II抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0.4mL；拉颈处死家兔， 收集血液，3000r/min离心30min后取上清，加入防腐剂和稳定剂，4℃密封保存。

所述尿II型胶原降解产物检测试剂盒还包括有过氧化物酶偶联抗体，该过氧化物酶偶联 抗体的制备为：取鼠抗兔IgG冻干粉0.1g，与10mL浓度为10mmol/L的TRIS缓冲液混合；取 HRP固体(辣根过氧化物酶)用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸钠法将HRP与鼠抗兔 IgG交联；取制备后的鼠抗兔IgG，用10mmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入 蓝色素为显色剂，蓝色素的浓度为0.08mg/ml，再加入防腐剂和稳定剂。所述酶偶联抗体的工 作滴度为1∶4550-5050，优选为1∶5000。

本发明所述试剂盒采用酶联免疫法，基于一种单克隆抗体对尿II型胶原片段，或对结 合于链霉抗生物素蛋白包被的微孔内表面的生物素标记合成肽的竞争性结合。

首先，生物素标记的合成肽结合于包被有链霉抗生物素蛋白的微孔板内表面。清洗之后， 加入标准品、质控品和尿样，然后加入单克隆抗体溶液。再次清洗，并加入过氧化物酶偶联 的兔抗鼠免疫球蛋白。再次清洗后，加入生色底物，用硫酸终止显色反应并测定吸光度。

本发明所述的尿II型胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的 优点。

具体实施方式

实施例1

(一)、本实施例所述的尿中II型胶原降解产物检测试剂盒的主要组成成份如下：

1.链霉抗生物素蛋白包被的微孔板

链霉抗生物素蛋白预包被的条形微孔板(12条×8孔)，置于框架中。

2.尿CTX-II标准品0

可直接使用的含有蛋白质稳定剂、去污剂和防腐剂的TRIS缓冲溶液，1瓶(至少3.0mL)。

3.尿CTX-II标准品1-5

可直接使用的合成肽溶于TRIS缓冲溶液中，合成肽的准确浓度标在各瓶上，5瓶(至少 0.4mL/瓶)。

4.尿CTX-II质控品

可直接使用的合成肽，2瓶(至少0.4mL)。

5.生物素标记的尿CTX-II抗原

可直接使用的生物素标记合成肽1瓶(至少12.0mL)。

6.一抗体溶液

可直接使用的单克隆抗体(溶于含蛋白质稳定剂、防腐剂和红色染料的TRIS缓冲溶液中) 1瓶(至少12.0mL)。

7.过氧化物酶偶联抗体

可直接使用的过氧化物酶偶联的兔抗鼠免疫球蛋白(溶于含去污剂、防腐剂和蓝色染料 的TRIS缓冲溶液中)1瓶(至少12.0mL)。

8.底物溶液

可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物(溶于酸性溶液中)。1瓶(至少12.0mL)。

9.终止液

可直接使用的0.18M硫酸溶液。1瓶(至少12.0mL)。

10.清洗溶液(50×)

含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液。1瓶(至少20.0mL)。

11.封口膜

孵育时密封微孔板的粘性薄膜。

所述试剂盒的制备如下：

一)标准品与质控品

1)来源：

CTX-II合成肽冻干粉购自Nordic Bioscience Diagnostic A/S公司。

2)质控品制备：

将CTX-II合成肽冻干粉与10mmol/L的TRIS缓冲液混合，质控品1中CTX-II浓度约为 1.50μg/L，质控品2中CTX-II浓度约为4.50μg/L，并加入1％的BSA和0.018％的Bronidox 5L 做为防腐剂和稳定剂，各取0.4mL分装，4℃密封保存。

3)标准品制备：

标准品0取3mL浓度10mmol/L的TRIS缓冲液，加入1％的BSA和0.018％的Bronidox 5L 做为防腐剂和稳定剂，4℃密封保存。

标准品1-5取CTX-II合成肽冻干粉，分别用10mmol/L的TRIS缓冲液稀释至CTX-II浓 度为0.75μg/L、1.25μg/L、2.50μg/L、5.00μg/L和10.00μg/L。各取0.4mL分装，4℃密 封保存。

二)生物素标记的CTX-II抗原

取CTX-II合成肽25mg，与10mL浓度为10mmol/L的TRIS缓冲液混合，得抗原稀释液； 取浓度为1.25mg/mL的生物素，抗原稀释液∶生物素＝1∶4体积比混合，采用简易过碘酸钠法 将生物素与CTX-II合成肽交联；取制备后的生物素标记的CTX-II抗原，加入1％的BSA和0.018％ 的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，4℃密封保存，所述CTX-II抗原浓度为5μg/ml。

三)一抗溶液

1)抗体制备：

取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔5-8处部位进行免疫接种，初次免疫注射 1mg/mL浓度的CTX-II抗原0.2mL，第3周、第4周及第5周注射1mg/mL浓度的CTX-II抗原 与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0.4mL。

拉颈处死家兔，收集血液，3000r/min离心30min后取上清，加入含有1％的BSA、0.1％的 Tween 20和0.0075％的Bronidox的溶液5L做为防腐剂和稳定剂，4℃密封保存。

2)一抗溶液制备：

取制备后的CTX-II单克隆抗体，用10mmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加 入红色素做为显色剂，其浓度为0.03mg/ml，取12mL分装，4℃密封保存，所述CTX-II单克 隆抗体滴度为1∶1000。

一抗浓度的选择：稀释度测定：先将0.1ml的生物素标记抗原加入预包被链酶抗生物素 蛋白的微孔板，洗涤后加一系列不同稀释度(1∶1000，1∶2000，1∶3000，1∶4000，1∶5000，1∶6000) 的一抗进行孵育，洗涤后加入0.1ml的过氧化物酶偶联抗体孵育，洗涤后加底物显色，加终 止液终止反应。在酶标比色计中测定不同稀释度的一抗OD值，选择OD值≥1.0的那个一抗 稀释度即为一抗的使用浓度。最终确定一抗的最佳工作浓度为1∶1000。

四)过氧化物酶偶联抗体

通用鼠抗兔IgG冻干粉购自英国Abcam公司。取鼠抗兔IgG冻干粉0.1g，与10mL浓度为 10mmol/L的TRIS缓冲液混合。取HRP固体用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸钠法将 HRP与鼠抗兔IgG交联。取制备后的鼠抗兔IgG，用10mmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA 混合，加入蓝色素做为显色剂，蓝色素的浓度为0.08mg/ml，再加入1％的BSA、0.1％的Tween 20和0.0075％的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，取12mL分装，4℃密封保存。所述酶偶联 抗体的工作滴度为1∶5000。

五)其他

预包被链菌抗生物素蛋白的微孔板、底物液、终止液和冲洗液均由其他商业公司提供。 实施例2：运用实施例1所述的试剂盒对尿中II型胶原降解产物检测

使用前，将所有溶液平衡至室温(18-22℃)。确定实验所需微孔板数量。每一样本设两 个平行孔。另外，每轮实验共需要14孔用于标准品和质控。将适当数量的微孔板置于塑料框 架上。将未使用的微孔板与干燥剂一起密封于锡箔袋中。具体包括以下步骤：

1)预孵育

向各孔加入100μL生物素标记的尿CTX-II抗原，用封口膜密封，室温(18-22℃)下孵 育30±5分钟，不要震荡。

2)清洗

清洗缓冲溶液(50×)以1体积浓缩缓冲溶液+50体积蒸馏水的比例稀释。手工清洗微孔板 5次。使用自动洗板机，通常清洗5次。确保每次手工或自动清洗后将微孔中的溶液倒干净。

3)一次孵育

向适当的孔中加入40μL尿CTX-II标准品(0-5)，质控品或待测尿样，再加入100μL一 抗体溶液。用封口膜密封微孔板，在冰箱中(2-8℃)孵育21±3小时，不要震荡。

4)清洗

见第2步。

5)二次孵育

向各孔加入100μL过氧化物酶偶联抗体溶液。用封口膜密封微孔板，室温(18-22℃)下 孵育60±5分钟，不要震荡。

6)清洗

见第2步。

7)与生色底物溶液孵育

向各孔加入100μL底物溶液，用封口膜密封，室温(18-22℃)下避光孵育15±2分钟， 不要震荡。

8)终止显色反应

向各孔加入100μL终止溶液。

9)测定吸光度

在2小时内以650nm为参照测定450nm下的吸光度。

检测范围

如果待测样本的吸光度低于标准5，建议用标准品0稀释样本并重新分析。

质量控制

【参考值(参考范围)】

各类人群的平均值和标准偏差举例如下。

【检验结果的解释】

结果处理

用四参数对数曲线拟合构建标准曲线，用内推法确定质控和患者样本中尿CTX-II的浓度。

结果举例：

用肌酐浓度校正

上述所得CTX-II值要用尿肌酐浓度校正。

用临床化学分析仪酶比色法确定样本中尿肌酐的浓度(mmol/L)，并用如下公式进行校 正：

CTX-II校正值(ng/mmol)＝1000×尿CTX-II(μg/L)/尿肌酐(mmol/L)

实施例3：试剂盒质量分析

一、批次间差异：＜7.0％

批次间差异由三个批次尿中II型胶原降解产物检测试剂盒测试三个尿样确定。

检测极限：0.20μg/L

检测极限为0.20ng/ml，此值为低于21个尿CTX-II标准品0吸光度测定平均值三个标准差 所对应的浓度。

二、精确度   ≤12％

对尿样进行十轮分析(双孔)确定精确度。

三、稀释/线性   96％

尿中II型胶原C端肽酶联免疫检测试剂盒的稀释回收率为96％。4个样本用尿CTX-II标准品 0适当稀释。CTX-II浓度用尿中II型胶原降解产物检测试剂盒测定，回收率用稀释因子校正。

DF：稀释因子；RC：回收率

四、干扰：

加入以下化合物至人尿样，未检测到对尿中II型胶原降解产物检测分析产生干扰。

尿素    最高    30g/L

肌酐    最高    10mg/L

葡萄糖  最高    5mg/L

抗坏血酸最高    5mg/L

白蛋白  最高    50mg/L。

五、特异性：

尿中II型胶原降解产物检测试剂盒所测抗原决定簇高度保守，因此测试可用于大部分其 它物种的尿样，包括非人灵长类、牛、马、猪、兔子、大鼠和小鼠。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范 围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。