一株对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌及其应用

摘要

本发明公开了一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。该植物病原真菌拮抗菌为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024。该植物病原真菌拮抗菌罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99可以防治香蕉枯萎病菌引起的植物病害；特别是可以与香蕉共生，在香蕉体内稳定的生存，能显著促进香蕉植株的生长并防治香蕉枯萎病的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及一株对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌及其应用，特别涉及一 株对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌及其在防治香蕉枯萎病中的应用。

背景技术

植物内生细菌是指一生或至少一生中的某一阶段能进入活体植物组织内，且它们 的存在并未使植物组织的表型特征和功能有明显改变的细菌。和病原细菌不同，内生 细菌和宿主植物之间是一种共生关系。1926年Perotti在许多健康植物根组织内发现 内生细菌，随后这方面的研究有了很大进展，目前人们发现几乎所有的健康植物体内 均存在大量的内生细菌。这些内生细菌能够在植物体内发挥一些特殊的作用而受到人 们的关注，其中具有促生或生防作用的有益内生细菌是植物病理学家研究的一个重点。 促生类内生细菌的作用机制有：合成或促进植物合成多种植物生长激素；利用固氮作 用为宿主提供氮元素；利用铁载体协助宿主吸收铁离子；合成某些小分子物质或者酶， 提高宿主植物对霜冻等有害环境条件的适应性等。生防类内生细菌的作用机制有：产 生抗菌物质，抑制病原生长；和病原物竞争生态位和营养物质；诱导寄主产生系统抗 性；提高宿主对病原的敏感性等。

具有促生或生防作用的内生细菌在农业生产中具有很强的应用潜力，特别是具有 生防作用的内生细菌是当前研究的一个热点。内生细菌能够存在于宿主组织内，和宿 主作为一个整体共同发挥作用。首先，宿主为内生菌提供水分、营养物质和生存场所， 使其基本不受外界环境的影响，和常规生防相比，防效稳定性得到了很大的提高。其 次，内生菌和宿主作为一个整体表现出抗病性，不必进行抗病种质的培育，节省时间 和资金。第三，内生菌能够在宿主组织内长期存在，和常规的农药防治相比成本低、 防效长，而且不存在对环境的污染问题。

铁是生物生长所必须的营养因子之一，有些微生物能够产生一种特殊的能与铁结 合的有机化合物，称为铁载体。它的主要基团是儿茶酚及异羟肟酸的衍生物，能牢固 地与3价铁结合，溶解3价铁并将铁转运入细胞。有些内生细菌能够产生铁载体，不但 通过争夺有限的铁元素而抑制病原物的生长，同时也改善了宿主的铁营养条件。在缺 铁的土壤中，这种效果尤为明显，在病害的生物防治中具有重要意义。

香蕉枯萎病(Banana Wilt Disease)又名巴拿马病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型 (Fusarium oxysporum.f sp.Cubense，FOC)侵染引起的以维管束坏死为特征的一种毁 灭性真菌病害，也是一种典型的土传病害。该病是目前香蕉产业的最大威胁，近年来 在我国香蕉主产区持续暴发并造成严重损失，生产上主要依靠农业措施或化学农药进 行防治。轮作等农业措施虽然效果较好，但成本高、耗时长，难以大面积推广普及。 化学农药存在着防效差、污染环境、抑制有益微生物和诱导病菌抗药性等问题。采用 抗病品种又存在育种周期长，所需人力和经费多而在生产中受到较大限制。采用具有 生防作用的内生细菌来进行该病的防治是一条值得期望的新途径，目前的研究主要集 中于有益菌株的筛选和盆栽防效评价。

发明内容

本发明的目的是提供一株对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌及其在防治香 蕉枯萎病中的应用。

本发明所提供的香蕉枯萎病菌拮抗菌为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99。

所述罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99，已于2012年04月20日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳 区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC NO.6024。所述罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.) BEB99分离自健康的香蕉植株内，为革兰氏阴性杆菌，菌体大小约0.9～1.2μm之间， 无芽孢，有荚膜，鞭毛极生。菌体在NA培养基平板上能形成乳白色的菌落，菌落边缘 规则，光滑稍突起，表面湿润，能产生铁载体。

以上述罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99为活性成分的生物菌剂也属于本发 明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

实验证明，本发明的对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌为罗尔斯通氏菌 (Ralstonia sp.)BEB99，对香蕉枯萎病菌有较好的抑菌作用，可以对该病害起到较好 的防治作用。

本发明的对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌为罗尔斯通氏菌(Ralstonia  sp.)BEB99，分离自健康的香蕉植株内，是一株香蕉内生细菌，实验证明该菌株接种 香蕉后能够在香蕉植株内部稳定存在。平板对峙试验表明该菌株对香蕉枯萎病菌有较 好的拮抗作用，其抑菌率达到46.43%。盆栽试验表明该菌株对香蕉枯萎病的防效可达 62.52%，同时对香蕉也有较好的促生作用。该菌株的获得，有望为香蕉枯萎病菌的防 治提供了一条环保、简单、有效的途径。本发明的罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 是一株具有良好生防应用前景的菌株。

附图说明

图1为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99和香蕉枯萎病菌的对峙培养实验结 果；图中，A为BEB99菌落对香蕉枯萎病拮抗效果，B为病原菌（FOC4）对照。

图2为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99菌液对香蕉枯萎病菌的抑菌作用； 图中，A为BEB99菌液对香蕉枯萎病的拮抗效果，B为病原菌（FOC4）对照。

图3为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99产铁载体实验；图中，A为罗尔斯通 氏菌(Ralstonia sp.)BEB99产铁载体的定量检测，B为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.) BEB99在铁载体培养基上产生的水解圈。

图4为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99菌液对香蕉杯苗的促生作用试验结 果；图中，A、D为清水对照处理，B、C为浸泡BEB99菌液处理。

图5为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99菌液对香蕉盆栽苗的促生作用试验 结果；图中，A、D为清水对照处理，B、C为浸泡BEB99菌液处理。

图6为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99菌液对香蕉枯萎病的防治试验，不 同处理香蕉植株的发病症状；图中，A为清水对照处理，B为病原菌(FOC4)对照处理， C为接种内生菌(BEB99)后7天接种病原菌(FOC4)处理，D为接种病原菌(FOC4)后7天 接种内生菌(BEB99)，E为药剂对照。

图7为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99菌液对香蕉枯萎病的防治试验，不 同处理香蕉球茎的发病症状；图中，A为清水对照处理，B为病原菌(FOC4)对照处理， C为接种内生菌(BEB99)后7天接种病原菌(FOC4)处理，D为接种病原菌(FOC4)后7天 接种内生菌(BEB99)，E为药剂对照。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例中的香蕉品种巴西蕉（Musa AAA，CV．BAXI）的袋苗和杯苗（袋苗： 装在小塑料袋子里面的幼苗，大概10株/袋；杯苗，装在塑料小杯子里的幼苗）可从 中国热带农业科学院试验场热作两院种苗组培中心购买。

实施例1、香蕉枯萎病菌拮抗菌的筛选及其鉴定

1、香蕉枯萎病菌拮抗菌的筛选

本菌株是从中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所香蕉种质圃健康巴西蕉 （Musa AAA，CV．BAXI）植株内部分离到的，具体方法为：称取健康香蕉植株（种植 8个月）组织1g，表面消毒后，放入有9mL无菌水的灭菌研钵中，加入少许灭菌的石 英砂研磨均匀，静置15min。取0.1mL稀释至10^-3、10^-4、10^-5浓度梯度，从各浓度梯 度悬浮液中取0.1mL，用无菌涂布棒涂于NA培养基（牛肉膏3g，细菌学蛋白胨10g， NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2）平板上，以最后1次洗过样 品的无菌水为对照以检测表面消毒效果。28℃倒置培养，连续观察7天，挑取菌落 形态不同的菌株，再次划线纯化保存备用。在倒好的PDA平板（马铃薯200g，葡萄 糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL）中央接入新鲜的香蕉枯萎病菌（购买自中国农 业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC NO.31272）菌块，在另一侧划线接种筛 选纯化后的菌株，对峙培养，筛选抑菌作用最强（抑菌活性最强）的菌株，结果得到 一株对香蕉枯萎病菌具有较强拮抗作用的菌株，将该菌株命名为BEB99，BEB99菌株对 香蕉枯萎病菌拮抗作用结果如图1所示。

2、BEB99菌株的种属鉴定

采用常规生理生化及16S rDNA序列分析对BEB99菌株进行鉴定，确认该菌株属于 罗尔斯通氏菌。该菌株的生理生化及基本生物学特性见表1。

表1.BEB99菌株的基本生物学特性

注：“＋”表示能够利用碳源（或氮源），“－”表示不能利用碳源（或氮源）。

依据《常见细菌鉴定手册》，BEB99菌株以上生理生化特征均与罗尔斯通氏菌属相 同，将其命名为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99。该罗尔斯通氏菌(Ralstonia  sp.)BEB99菌株，已于2012年04月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所），保藏号为CGMCC NO.6024。

以罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA 序列通用引物作为引物，PCR扩增出约为1.5kb左右的产物片段，测序结果表明序列 全长为1460个核苷酸，具有序列表中序列1的核苷酸序列；将该序列与罗尔斯通氏菌 (Ralstonia sp.)的其他菌株进行blast对比，结果表明罗尔斯通氏菌(Ralstonia  sp.)BEB99的16S rDNA序列与Ralstonia mannitolilytica（登陆号：AY043379）16S rDNA序列同源性最高，达99%。

实施例2、罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024的内生性测定

1、罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024的利福平耐性的获得

将罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99接种至含有5μg/mL利福平的NB培养液 中，摇菌培养至菌液变浑，取少量培养的菌液接种至含有10μg/mL利福平的NB培养 液中，摇菌培养至菌液变浑。按此方法逐步增加利福平的浓度进行培养，最终获得能 在含有400μg/mL利福平的NB培养液（牛肉浸膏3g，细菌学蛋白胨10g，NaCl 5g， 蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2）中正常生长的罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 菌体，按照实施例1中的方法确认该菌体的生物学特性以及抑菌活性与罗尔斯通氏菌 (Ralstonia sp.)BEB99相当后4℃保存备用。

2、罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024内生性测定

将获得的耐利福平的BEB99菌体（28℃、180rpm，NB培养液培养至OD₆₀₀值约 0.5）通过伤根灌菌法接种于巴西蕉（Musa AAA，CV．BAXI）袋苗根部，分别于第3、 5、7、9、15、20、25、30天对接种植株取样。表面消毒后研磨均匀取100μL的研磨 液涂布于分别含有400μg/mL的利福平的NA培养基平板上，28℃下培养5天，以接 种了无菌水的香蕉苗为对照。结果在各个时间段将所取样品制备研磨液后，涂布有接 种了步骤1获得的利福平耐性的罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99菌体的香蕉苗样 品的研磨液的平板上均获得了和接种时一样的单一乳白色菌落，经检测其拮抗活性以 及产铁载体能力与初始菌株罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99一致，按照实施例1 中的方法确认该菌体的生物学特性以及抑菌活性，表明该菌落为罗尔斯通氏菌 (Ralstonia sp.)BEB99的利福平耐性菌体，而涂布有接种了无菌水的抗性平板上没有 菌体生长，表明该菌株能够在香蕉植株内部稳定存在并正常繁殖。

实施例3、罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024产铁载体检测

有些微生物能够产生一种特殊的能与铁结合的有机化合物，称为铁载体。它的主 要基团是异羟肟酸的衍生物或者是儿茶酚，能牢固地与3价铁结合，溶解3价铁并将 铁转运入细胞。

通过下述实验检测本发明罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024产 铁载体能力:

1、铁载体培养基平板的制备（配置过程中所用的容器和用具都要经过6mol/L的 HCl溶液浸泡，双蒸水淋洗）：

1）首先制备10×MM9培养基（配方为：磷酸二氢钾3g，氯化钠5g，氯化铵10 g，双蒸水1000mL），121℃，20min高压灭菌。

2）取10mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶液6mL加入100mL容量瓶内 并用双蒸水稀释至50mL；

3）再取1.5mL l mmol/L FeCl₃溶液与7.5mL 2mmol/L刃天青(CAS)溶液混匀 后，沿玻棒缓慢加入至步骤2）所述装有十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶液的容量瓶 中；

4）称取4.307g无水双二甲胺溶解于约30ml双蒸水中，再小心加入6.25mL 12 mmol/L HCl，即得pH 5.6缓冲液。将此溶液转入步骤3）所述的容量瓶中，并用双蒸 水定容至100mL。

5）在步骤4）得到的溶液中加入步骤1）制备的10×MM9培养基100mL，NaOH 6.0 g，哌嗪-1,4-二乙醇磺酸（pipes,Sigma公司出品）30.24g，琼脂20g，双蒸水750mL， 调pH至7.4-7.8。高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃。

6）在一个无菌三角瓶中加入下列经过过滤除菌的试剂：10%（重量百分含量）水 解酪蛋白30mL，20％（重量百分含量）葡萄糖10mL，1mol/L MgCl₂ 1mL以及0.1 mol/L CaCl₂ 1mL，混匀后，缓慢加入100mL步骤5）得到的溶液，混匀后倒平板， 即得铁载体培养基平板。

2、罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024产铁载体检测

用无菌牙签挑取所获罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99单菌落接种在CAS平板 （上述步骤1制备的铁载体培养基平板）上，28℃培养2d后观察平板上橙黄色透明 圈的产生情况（图3B）。

铁载体定量检测：用铂金丝接种BEB99的新鲜菌苔于限铁SA液体培养基（蔗糖 20.0g，L-天门冬酰氨2.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，0.16μmol/L FeCl₃， 双蒸水1000mL）中，28℃摇床培养(150r/min)48h（OD₆₀₀为1.0）；菌悬液经12000 rpm离心1min，取上清液，以1:1的体积比加入CAS检测液[1mmol/L CAS(铬天青)， 0.1mmol/L FeCl₃，4mmol/L十六烷基三甲基溴化胺(HDTMA)；0.1mol/L磷酸盐缓冲 液pH 6.8，每100mL含Na₂HPO₄·12H₂O 2.427g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5905g，KH₂PO₄ 0.075 g，NH₄Cl 0.250g，NaCl 0.125g，使用时10倍稀释]，充分混匀，静止1h后，测定 630nm波长处的吸光值(A)，取双蒸水作为对照调零，以同法测定的未接种BEB99的 限铁SA液体培养基上清液的吸光值作为参比值(Ar)，并用公式[(Ar-As)/Ar]×100计 算铁载体的相对量。

按照Manjanatha的标准，铁载体的相对含量在0-0.2为极低产量菌株，0.2-0.4 为低产量菌株，0.4-0.6为中等产量菌株，0.6-0.8为高产量菌株，0.8-1.0为极高产 菌株。

结果表明，该罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99培养2d后，罗尔斯通氏菌 (Ralstonia sp.)BEB99菌株分泌的铁载体能螯合CAS检测液中的Fe³⁺形成橙色铁载体 分泌圈（图3B）。经铁载体定量检测，其铁载体的相对含量为0.969，属极高产菌株（图 3A）。

实施例4、罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024对香蕉枯萎病菌的拮 抗作用评价

1、平板对峙法测定

取直径0.5cm的FOC4（购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC NO.31272）菌饼接种于PDA培养基中央，然后用接种环蘸取内生细菌罗尔斯通氏菌 (Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024在菌饼的两侧约2.5cm处划线接种，以不接 种内生菌为对照。28℃培养7d，观察抑菌效果。结果见图1。结果表明，该菌株对 香蕉枯萎病菌有较好的拮抗作用，其抑菌率达到46.43%。

2、牛津杯法测定

将罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024菌株接种到NB培养液中， 于28℃、180rpm的摇床中振荡培养24h。将菌液在4000rpm离心3min，上清液 经0.22μm孔径的滤膜过滤得到无菌滤液。用无菌水将FOC4分生孢子洗下，浓度调 至1×10⁷个/mL，待PDA培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000 mL）冷却到45℃左右时加入FOC4孢子悬浮液（V/V为1：9)，混匀后倒平板。在平 板中间放置牛津杯，待培养基凝固后，向牛津杯中注入0.1mL的BEB99的无菌滤液， 以无菌培养液为对照。于28℃培养7d，观察抑菌情况。结果见图2。结果表明，BEB99 无菌滤液对FOC4的抑菌圈达2.85cm，表现出了较好的拮抗活性。

3、盆栽试验

香蕉枯萎病菌在PDA培养基上28℃培养7d，用无菌水洗下分生孢子，配制浓 度为1×10⁷个/mL的病菌孢子悬浮液，将株高为35cm的基因型一致的巴西蕉（Musa AAA，CV．BAXI）杯苗栽种于口径为22cm的花盆中。然后用NB培养液（28℃，180 rpm，48h）震荡培养的BEB99发酵液（浓度为1×10⁶cfu/mL），分别进行1）先浇灌 完BEB99发酵液，7d后浇灌病菌孢子悬浮液以及2）先浇灌病菌悬浮液，7d后浇灌 BEB99发酵液处理，每处理30盆（每盆1株苗），3次重复，每株蕉苗均分别浇100 mL BEB99发酵液和病菌孢子悬浮液，并设置以50%国光多菌灵可湿性粉剂（WP）800 倍稀释液浇灌100mL（药剂对照），病原菌（FOC4）孢子液（浓度1×10⁷个/mL）浇灌 100mL（病原菌对照），清水浇灌100mL（清水对照）处理。45d后根据地上叶片的 变色或萎蔫情况及假茎维管束变褐程度对发病程度进行分级，叶片或假茎分级不一致 时，以病级高的为准。按照下面的分级标准计算不同处理的病情指数和防效。

发病率（%）=枯萎病发病株/试验有效株×100

病情指数（%）=[∑(各级病株数×该病级)]/(调查总株数×最高病级)×100

防效（%）=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

香蕉枯萎病病情分级标准

注：病情级数按发病症状和程度不同分为0级、1级、3级、5级、7级、9级6个等级。

人工接种45d后，统计试验结果（图6、7），结果见表2。先浇灌内生细菌BEB99 的发酵液于香蕉苗根部，7d后接种枯萎病菌的处理，防效为62.52%，是药剂对照50% 国光多菌灵WP 800倍液的7.45倍。先接种病菌悬浮液，7d后再浇灌内生细菌BEB99 处理的防效较低，为32.05%。试验结果表明，先接种内生细菌BEB99后接种枯萎病 菌处理的防治效果明显优于其它几个处理，是一种比较好的香蕉枯萎病防治方法。

表2内生细菌BEB99对香蕉苗枯萎病的防治效果

实施例5、罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024对香蕉植株的促生作 用

1、浸根法：将巴西蕉（Musa AAA，CV．BAXI）袋苗洗净去根，将其浸泡于罗尔斯 通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024菌悬液(28℃、180rpm振荡培养24h， 配制成OD₆₀₀为0.5的菌液)中浸泡l h，然后将其种于口径为9cm的塑料杯里，以不 浸根的巴西蕉（Musa AAA，CV．BAXI）袋苗直接种于口径为9cm的塑料杯里为对照（CK）， 一个月后观察生长情况，并记录相关数据。

2、灌根法：将长出4-5片真叶杯苗，移栽到盆中，每盆浇灌罗尔斯通氏菌 (Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024菌悬液(28℃、180rpm振荡培养24h，配制 成OD₆₀₀为0.5的菌液)100mL，以不灌菌的香蕉苗为对照（ck），一个月后观察生长 情况，并记录相关数据。

选择香蕉生产过程中两个不同时期（杯苗和盆栽苗）接种内生菌，都表现出很好 的促生作用（图4，图5）；结果表明，罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99浸根或灌 根使香蕉的株高、假茎直径、生物量均有显著增加，结果见表3。

表3BEB99菌株对香蕉杯苗和盆栽苗的促生作用