一种加压毛细管电色谱仪检测对虾中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑残留的方法

摘要

本发明涉及一种加压毛细管电色谱仪检测对虾中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑残留的方法，步骤：样品制备；配制氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑标准溶液；采用加压毛细管电色谱进行分析：以反相键和C18为填料的毛细管电色谱柱作为检测柱；流动相采用11～13mmol/L，pH＝4～6的磷酸盐氢二胺缓冲液与乙腈的混合液，其体积比为90～70∶10～30；所加电压为-3～-5kv，柱压为9.6～9.8MP，柱温为常温，流动相的流速：40～60μL/min；进样量：0.9～1.1μL的工艺条件下，用紫外检测器在波长275nm处进行检测，同时绘制标准曲线；将样品经检测分析后根据其保留时间进行定量分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。本发明高效、准确，有机试剂消耗少，有较高的灵敏度，可以满足日常检测氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑药物的需求。

说明书

技术领域

本发明属于食品安全-兽药残留领域，具体是一种通过加压毛细管电色谱检测对虾 中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑残留的方法。

背景技术

氯霉素、甲砜霉素同属酰胺醇类抗生素，具有广谱抗菌能力，在水产养殖生产上常 被用于防治鱼、虾类细菌性传染病；甲硝唑则用于治疗几种滴虫感染。氯霉素、甲砜霉 素能抑制骨髓造血功能，引起再生障碍性贫血等毒副作用，甲硝唑可以致癌和致遗传变 异等毒副作用，许多国家禁止在动物饲料和治疗中使用，并规定动物性食品中氯霉素不 得检出。

食品中氯霉素类药物的残留检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气 相色谱-质谱法等。液相色谱法的灵敏度较低，且分析时间较长，气质、液质联用仪虽 然检测灵敏度和分辨率很高，但一般实验室很难配置这样的仪器。

加压毛细管电色谱(pCEC)是近几年来兴起的一种微分离技术，它结合了电泳的高效 性和高效液相色谱的保留机制，通过在填有HPLC填料的毛细管色谱柱的两端施加高 压，提高了样品的分离能力和效率，使以前需很长时间才能出现的峰现在只需很短时间 就可出现，并且试剂和样品的消耗量减少，近几年开始也用于兽药残留的分离。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种加压毛细管电色谱仪检测对虾中氯霉素、甲 砜霉素、甲硝唑残留的方法，具有快速、准确、灵敏度高的特点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种加压毛细管电色谱仪检测对虾 中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑残留的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)样品制备：将对虾去头后肌肉组织样品剪碎后均质，冷冻保存；

2)样品预处理：将样品经乙酸乙酯离心提取，正己烷脱脂旋转蒸干后，用乙腈溶 解残渣，再经0.20～0.24μm滤膜过滤后供毛细管电色谱测定用；

3)配制氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑标准溶液；

4)采用加压毛细管电色谱进行分析：以反相键和C18为填料的毛细管电色谱柱作 为检测柱；流动相采用11～13mmol/L，pH＝4～6的磷酸盐氢二胺缓冲液与乙腈的混合液， 其体积比为90～70∶10～30；所加电压为-3～-5kv，柱压为9.6～9.8MP，柱温为常温，流动 相的流速：40～60μL/min；进样量：0.9～1.1μL的工艺条件下，用紫外检测器在波长275nm 处进行检测，同时绘制标准曲线；

5)将样品经检测分析后根据其保留时间进行定量分析，利用外标法根据其峰面积 进行定量分析。

作为改进，所述步骤2)中的乙酸乙酯离心提取的具体过程为：准确称取2±0.01g 均质样品置于50mL离心管中，加入乙酸乙酯8～12mL，用涡旋混合器充分混匀4～6min， 3000～5000r/min离心8～12min，收集上清液，再向原离心管中加入8～12mL乙酸乙酯重 复提取一次，合并两次上清液；加入14～16mL正己烷脱脂两次后，溶液于35～45℃旋 转蒸发至干，用乙腈溶解后过膜上机使用。

作为改进，所述氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑标准溶液的配制为：分别称取氯霉素、 甲砜霉素、甲硝唑标准品10.0mg±0.01g，用50％甲醇水溶液溶解并定容于100ml容量瓶 中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液。

作为优选，所述流动相采用12mmol/L，pH＝5的磷酸盐氢二胺缓冲液与乙腈的混合 液，所述流动相的配制过程为：取乙腈、重蒸水、120mmol/L磷酸盐氢二胺按体积比为 20∶70∶10的比列配成流动相，超声波脱气20～40min。

再改进，所述氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑标准溶液检测前需用流动相稀释成 0.1～5μg/mL的标准工作液。

再优选，所述步骤4)的所述电压为-4kv，柱压为9.7MP，柱温为常温，流动相的 流速：50μL/min；进样量：1.0μL。

最后。所述步骤4)的毛细管电色谱柱选用规格EP-100-20/45-3-C18，内径100μm， 有效柱长20cm，填料粒径3μm ODS柱。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过加压毛细管电色谱对对虾中氯霉 素、甲砜霉素、甲硝唑残留的进行检测分析，可以有效解决基质中大部分干扰物质的影 响，具有快速、准确、灵敏度高的特点，并且有机试剂消耗少，检测成本低，不仅可用 于对虾的检测，还可应用于其他水产品，满足日常检测氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑药物 的需求。

附图说明

图1是加-4kV电压时氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑药物标准品的毛细管电色谱图；

图2是不加电压的uHPLC图；

图3是市售鱼肉样品的检测电色谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一种通过加压毛细管电色谱检测对虾中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑残留的方法，步 骤为：

1、样品制备：将对虾去头后的肌肉组织样品，用剪刀剪碎后均质，冷冻保存；

2、样品预处理：

将样品解冻，准确称取2±0.01g(精确至0.01g)均质样品置于50mL离心管中， 加入乙酸乙酯10mL，用涡旋混合器充分混匀5min，4000r/min离心10min，收集上清液， 再向原离心管中加入10mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次上清液。加入15mL正己 烷脱脂两次后，溶液于40℃旋转蒸发至干，用乙腈溶解后过膜上机使用。

3、配制氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑标准溶液：分别称取氯霉素、甲砜霉素、甲硝 唑标准品10.0mg±0.01g，用50％甲醇水溶液溶解并定容于100ml容量瓶中，配成质量浓 度为100mg/L标准储备溶液，避光冷藏保存。临用前用流动相稀释成标准工作液。

4、流动相配制及色谱条件：

取乙腈、重蒸水、120mmol/L磷酸氢二铵溶液按体积比为20∶70∶10的比列配成流动 相，超声波脱气30min后备用。

所用色谱条件：

(1)色谱柱选用规格EP-100-20/45-3-C18，内径100μm，有效柱长20cm，填料粒径3μm ODS柱；

(2)紫外检测：波长275nm；

(3)流动相：乙腈∶磷酸氢二铵溶液(12mmol/L，pH 5)＝20∶80(V/V)，

(4)流速：50μL/min；进样量：1μL；

(5)柱压：电压-4kV，柱压为9.7MP，柱温为常温。

5、工作曲线和检出限：

用流动相稀释标准储备溶液为0.1～5μg/mL混合标准工作溶液，按试验条件进行检 测，绘制标准曲线。试验表明，氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑在0.1～5μg/mL范围内线性 良好，线性回归方程、相关系数及检出限列于表1。

表1  标准工作曲线与检出限

6、回收率和精密度试验：

采用标准添加法对添加样品分别进行加标回收率和精密度试验，以观察方法的准确 性和重现性。在空白样品中添加两个不同添加量的氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑药物的混 合标准溶液，按照方法操作步骤进行回收率实验，同时每个添加浓度平行重复3次，计 算回收率和精密度，结果见表2

表2  样品加标平均回收率(n＝3)

从上述结果可知本实验建立的对虾中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑药物残留分析的毛 细管电色谱法，用乙酸乙酯溶液作为提取剂，可以有效沉淀虾肉组织中的蛋白质，对氯 霉素、甲砜霉素、甲硝唑的提取效率高，适用于水产品的提取，正己烷是常见的脱脂溶 剂，可以去除多余的脂质和类脂质；采用流动相为12mmol/L，pH＝5的磷酸氢二铵与乙 腈的混合液，其体积比为80∶20的毛细管电色谱进行分析检测，有机试剂消耗少，通过 施加外电压，可以减少氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑的保留时间，并且灵敏度得到提高， 该方法不仅能满足对虾中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑残留量的常规检测，也可以用于其 它水产品样品如贝壳类中的氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑的测定。

在本发明所建立的分析条件下，得到氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑药物标准品的毛细 管电色谱(图1)和不加电压的uHPLC图(图2)及市售鱼肉样品的检测谱图(图3) 从这些色谱图的分离效果可见，本发明的检测方法可以有效解决基质中大部分干扰物质 的影响，样品中杂质对氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑也没有干扰，也并且能有效缩短分析 时间。