自身免疫性脱髓鞘疾病及其它自身免疫疾病或炎性疾病的治疗方法

摘要

本发明涉及预防或抑制疾病发病和/或治疗疾病的方法，所述疾病为自身免疫性脱髓鞘神经病变和涉及巨噬细胞浸润的其它自身免疫疾病或炎性疾病。

说明书

相关申请

本申请要求美国专利申请序列号US 61/306,043的优先权，该美国专利申请 于2010年2月19日提交；其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

当机体自身免疫系统损伤神经时将发生自身免疫性多发性神经病变。这些 疾病的症状包括麻木、肌肉无力、肢体疼痛、痉挛、触碰敏感和腱反射减弱。 通常，可以将自身免疫多发性神经病变归类为脱髓鞘和轴突神经病变。

脱髓鞘神经病变中的一类为慢性炎性脱髓鞘神经病变(CIDP)。CIDP的 发病率为每100,000人中约9个病人(Laughlin等，Neurology 73：39(2009))。 而各种类型脱髓鞘神经病变的总发病率为每100,000人中约20个病人。另外一 种类型的脱髓鞘神经病变为急性炎性脱髓鞘神经病变(AIDP，格林-巴利综合 症)，其发病率为每年每100,000人中2-3个病人。至少一种类型的神经病变与 抗体的存在相关，所述抗体为抗髓磷脂相关糖蛋白(MAG)抗体的抗体。

身免疫性轴突神经病变包括血管炎性神经病变、感觉性神经节神经炎(舍 格伦综合症和其它胶原血管病)、自身免疫性自主神经病变、非全长依赖性小 纤维神经病变和副肿瘤性神经病变。

已使用皮质激素和/或免疫抑制剂治疗这些类型的自身免疫性神经病变，但 是能靶向至与神经病变发病相关的特定生物分子的新疗法可能更为有效。

发明概述

本发明涉及在所需哺乳动物中抑制自身免疫性脱髓鞘神经病变以及巨噬细 胞浸润的其它自身免疫疾病或炎性疾病的方法。该方法包括在有效抑制此类自 身免疫疾病或炎性疾病发展的条件下，向患有此类疾病的哺乳动物给予与巨噬 细胞清道夫受体1类(MSR1)结合的抑制剂。在本发明的一个实施方式中，抑 制剂是抗-MSR1抗体的Fab片段。此类抗体可以是其单克隆或多克隆或功能性 部分。哺乳动物可以是家兔、大鼠、小鼠、马、牛、山羊、灵长类或人，优选 人。

本发明的一方面涉及一种治疗哺乳动物自身免疫疾病或炎性疾病的方法， 该方法包括：在有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的条件下，向所需哺乳动物 给予MSR1抑制剂，其中疾病包括巨噬细胞浸润。MSR1抑制剂的例子包括抗- MSR1抗体、抗-MSR1抗体片段、抗-MSR1抗体的Fab片段、抗-MSR1抗体的 F(ab)₂片段，和/或这些抗体和抗体片段的功能等效物。在某些实施方式中，使 用MSR1抑制剂的组合。

当抑制剂是抗体时，可以是任意类型的抗体。例如，抗体可以是单克隆抗 体，和/或从单克隆抗体获得的抗体片段或Fab片段。在其它实施方式中，抗体 是多克隆抗体和/或从多克隆抗体制品获得的抗体片段或Fab片段。

在某些实施方式中，抗-MSR1的抗体、抗-MSR1抗体的抗体片段或Fab片 段来自重组抗体文库。重组抗体、抗体片段和/或Fab片段可以在真核细胞(例 如，哺乳动物或酵母细胞)或原核细胞(例如，细菌)中表达。抗-MSR1的抗 体、抗-MSR1抗体的抗体片段和/或Fab片段还可以通过体外技术产生。例如， 可以产生、获得或使用抗-MSR1的抗体、抗-MSR1抗体的抗体片段或Fab片段 的文库，其中抗体、抗体片段或Fab片段展示于噬菌体、细胞或核糖体。

抗体、抗体片段、Fab片段或其功能等效物可以结合于任意MSR1多肽或 肽，包括任意哺乳动物MSR1。例如，抗体、抗体片段、Fab片段或其功能等效 物可以结合的哺乳动物MSR1多肽和肽包括人、大鼠、小鼠、山羊、马、犬、 猫或鸟类的MSR1。在某些实施方式中，抗体、抗体片段、Fab片段或其功能等 效物可以与SEQ ID NO：1-9中任意一个所示的序列结合。

采用本发明所述方法进行治疗的哺乳动物可以是人类，或家养动物或动物 园的动物。

在某些实施方式中，疾病是自身免疫疾病，包括本文公开的任意自身免疫 疾病。例如，自身免疫疾病可以是自身免疫性脱髓鞘神经病变如慢性炎性脱髓 鞘多发性神经病变(CIDP)或格林-巴利综合症(GBS)。在其它实施方式中， 疾病是炎性疾病，包括本文公开的任意炎性疾病。

尽管并未限定为特定作用机制，但是MSR1抑制剂在哺乳动物中可以，例 如将此前已活化的巨噬细胞去活化、抑制巨噬细胞活化、抑制巨噬细胞相互作 用、抑制抗原提呈，和/或抑制细胞外粘附。

有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的条件可以包括给予治疗有效量的 MSR1抑制剂。这些治疗有效量的MSR1抑制剂能够将此前已活化的巨噬细胞 去活化、抑制巨噬细胞活化、抑制巨噬细胞相互作用、抑制抗原提呈，和/或抑 制细胞外粘附。在某些实施方式中，治疗有效量的MSR1抑制剂在哺乳动物中 减轻炎症、减少脱髓鞘、减少轴突丢失和/或减少神经元丢失。

有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的发病或持续的条件还可以包括，在有 效治疗疾病或抑制所述疾病发病的给药间隔内给予MSR1抑制剂。例如，在某 些实施方式中，抑制剂每日给予一次、两次或三次。在其它实施方式中，抑制 剂每周给予一次、两次或三次，或者每月给予一次、两次或三次。

附图的简要说明

为进一步研究MSR1和AIF-1在疾病发病过程中的作用，发明人生产了抗- MSR1和抗-AIF-1的Fab抗体片段，并在大鼠实验性自身免疫性神经炎 (EAN)模型中检测其作用。EAN是人自身免疫性脱髓鞘神经病变的实验性动 物模型。诱发EAN后，向大鼠给予抗-MSR1和抗-AIF-1的Fab抗体片段。

图1。EAN的临床过程中，用特异性和非特异性抗体治疗的效果。在第7 天和第12天(箭头指向)，向经P2肽的完全弗氏佐剂(CFA)免疫以诱导 EAN的动物，腹腔注射给予1mg MSR1或AIF-1特异性IgG的Fab片段，对于 同型对照则给予正常山羊IgG(Fab)。各实验组均显示了平均临床评分。在第 12-17天之间，未治疗的EAN大鼠与经抗-MSR1治疗大鼠之间的疾病严重程度 存在显著性差异p＜0.05(*)。

图2。与未经治疗的EAN动物相比，经抗-MSR1治疗的动物的炎性单核细 胞浸润更少。苏木精和伊红染色的坐骨神经的石蜡切片，坐骨神经来自疾病过 程第17天处死的代表性动物：图2A/D，未经治疗的EAN(100X/400X)；图 2B/E，抗-MSR1治疗的EAN(100X/400X)；图2C/F，正常对照 (100X/400X)。代表性的经抗-AIF-1或抗-IgG治疗的EAN坐骨神经与未经治 疗的EAN类似，数据未显示。

图3。如用抗大鼠MSR1 Fab片段免疫染色的人皮肤活检石蜡切片所示，抗 大鼠MSR1肽的抗-MSR1 Fab抗体与人细胞发生交叉反应。图3A(200X)、 3B和3D(400X)显示了用抗-MSR 1Fab片段进行免疫染色的人皮肤活检石蜡 切片，所述抗-MSR 1Fab片段用于对上述图1和2中所描述的EAN研究中。图 3C(200X)显示了用正常山羊IgG Fab抗体(阴性对照)染色的连续切片。

发明详述

在说明书的下文中，引用了作为本发明一部分的附图，并通过举例说明展 示了可以实施的特定实施方式。对这些实施方式进行详细描述以使得本领域技 术人员能够实现本发明，可以理解的是，可以利用其它实施方式，在不脱离本 发明范围的情况下，进行结构和逻辑上的改变。因而，下文对示例性实施方式 的描述并不是为了限制，本发明的保护范围由本发明的权利要求确定。

本发明涉及在所需的哺乳动物中抑制自身免疫疾病和炎性疾病的发病和/或 治疗所述疾病进程的方法。能够通过本发明的方法抑制或治疗的自身免疫疾病 和炎性疾病包括涉及巨噬细胞浸润的疾病。在某些实施方式中，自身免疫疾病 是自身免疫性脱髓鞘神经病变。

该方法涉及在有效抑制自身免疫疾病和/或炎性疾病发展的条件下，向哺乳 动物给予巨噬细胞清道夫受体1类(MSR1)的抑制剂。哺乳动物可患有自身免 疫疾病或炎性疾病，或易于患上此类自身免疫疾病或炎性疾病。

如本文所使用的，MSR1抑制剂抑制哺乳动物的自身免疫疾病和/或炎性疾 病的发病和/或治疗。因此，抑制剂是疾病抑制剂，并且在某些实施方式中，抑 制剂可能并不直接抑制MSR1的功能。相反，抑制剂与MSR1结合，进而有效 地治疗和/或抑制疾病。在其它实施方式中，抑制剂以抑制MSR1功能的方式与 MSR1相互作用并结合至MSR1。

在本发明的一个实施方式中，抑制剂是抗-MSR1的抗体或其Fab片段。此 类抗体可以是单克隆或多克隆抗体，抗体片段，或此类抗体和/或片段的功能等 效物。

哺乳动物可以是人或家养或动物园动物。所患疾病可以被抑制或治疗的哺 乳动物的例子包括家兔、大鼠、小鼠、马、牛、山羊、灵长类或人。在某些实 施方式中，哺乳动物是人。

巨噬细胞清道夫受体1类(MSR1)

MSR1是一种在巨噬细胞上表达的多配体受体(Usui等，Diabetes 56：363 (2007)；Husemann等，Glia 40：195(2002)；Platt等，J.Clin.Invest.108：649 (2001))。MSR1也被称为SR-AI/II、CD204、A类清道夫受体，成员1。它是 在巨噬细胞和某些肥大细胞和树突状细胞表面发现的跨膜受体。细胞外胶原区 域含有配体结合结构域。

MSR1识别多种内源性配体，其中某些内源性配体与抗原、乙酰化低密度 脂蛋白(LDL)、β-淀粉样蛋白、晚期糖基化终产物、细胞外基质，和凋亡细 胞的疾病和病症有关。

可以从本领域，例如NCBI数据库，获得不同类型和种属MSR1多肽的氨 基酸序列的示例。参见网站ncbi.nlm.nih.gov。因而，例如，NCBI数据库提供 了人巨噬细胞清道夫受体1类(MSR1)的氨基酸序列，其登记号为P21757.1 (gi：127357)。在下文中将该序列简称为SEQ ID NO：1。

  1 MEQWDHFHNQ QEDTDSCSES VKFDARSMTA LLPPNPKNSP

 41 SLQEKLKSFK AALIALYLLV FAVLIPLIGI VAAQLLKWET

 81 KNCSVSSTNA NDITQSLTGK GNDSEEEMRF QEVFMEHMSN

121 MEKRIQHILD MEANLMDTEH FQNFSMTTDQ RFNDILLQLS

161 TLFSSVQGHG NAIDEISKSL ISLNTTLLDL QLNIENLNGK

201 IQENTFKQQE EISKLEERVY NVSAEIMAMK EEQVHLEQEI

241 KGEVKVLNNI TNDLRLKDWE HSQTLRNITL IQGPPGPPGE

281 KGDRGPTGES GPRGFPGPIG PPGLKGDRGA IGFPGSRGLP

321 GYAGRPGNSG PKGQKGEKGS GNTLTPFTKV RLVGGSGPHE

361 GRVEILHSGQ WGTICDDRWE VRVGQVVCRS LGYPGVQAVH

401 KAAHFGQGTG PIWLNEVFCF GRESSIEECK IRQWGTRACS

441 HSEDAGVTCT L

该MSR1多肽的细胞外结构域包括SEQ ID NO：1所示序列的氨基酸77- 451。在下文中将该序列简称为SEQ ID NO：2。

 77                                        KWET

 81 KNCSVSSTNA NDITQSLTGK GNDSEEEMRF QEVFMEHMSN

121 MEKRIQHILD MEANLMDTEH FQNFSMTTDQ RFNDILLQLS

161 TLFSSVQGHG NAIDEISKSL ISLNTTLLDL QLNIENLNGK

201 IQENTFKQQE EISKLEERVY NVSAEIMAMK EEQVHLEQEI

241 KGEVKVLNNI TNDLRLKDWE HSQTLRNITL IQGPPGPPGE

281 KGDRGPTGES GPRGFPGPIG PPGLKGDRGA IGFPGSRGLP

321 GYAGRPGNSG PKGQKGEKGS GNTLTPFTKV RLVGGSGPHE

361 GRVEILHSGQ WGTICDDRWE VRVGQVVCRS LGYPGVQAVH

401 KAAHFGQGTG PIWLNEVFCF GRESSIEECK IRQWGTRACS

441 HSEDAGVTCT L

如本领域技术人员所公知，在包括MSR1多肽的人类多肽中，可能存在序 列变异。因而，至少存在MSR1的三种同种型。通过对该基因的选择性剪接可 以产生这三种不同的同种型。这些受体或同种型是巨噬细胞特异性的三聚体整 合膜糖蛋白。1型和2型同种型是功能性受体，其能够介导修饰的低密度脂蛋 白(LDL)的内吞。尽管3型同种型具有1型和2型同种型中介导此功能的结 构域，但是3型同种型并不内化修饰的LDL(乙酰化-LDL)。其具有不同的细 胞内加工并且被捕获在内质网中，导致其不能进行细胞内化。当共表达时，3 型同种型能够抑制1型和2型同种型的功能，这表明存在显著的负效应并且提 示存在一种在巨噬细胞中调节清道夫受体活性的机制。

例如，MSR1I型和II型同种型的1型的氨基酸序列在NCBI数据库中的登 记号为NP_619729.1(gi：20357512)。在下文中将该序列简称为SEQ ID  NO：3。

  1 MEQWDHFHNQ QEDTDSCSES VKFDARSMTA LLPPNPKNSP

 41 SLQEKLKSFK AALIALYLLV FAVLIPLIGI VAAQLLKWET

 81 KNCSVSSTNA NDITQSLTGK GNDSEEEMRF QEVFMEHMSN

121 MEKRIQHILD MEANLMDTEH FQNFSMTTDQ RFNDILLQLS

161 TLFSSVQGHG NAIDEISKSL ISLNTTLLDL QLNIENLNGK

201 IQENTFKQQE EISKLEERVY NVSAEIMAMK EEQVHLEQEI

241 KGEVKVLNNI TNDLRLKDWE HSQTLRNITL IQGPPGPPGE

281 KGDRGPTGES GPRGFPGPIG PPGLKGDRGA IGFPGSRGLP

321 GYAGRPGNSG PKGQKGEKGS GNTLTPFTKV RLVGGSGPHE

361 GRVEILHSGQ WGTICDDRWE VRVGQVVCRS LGYPGVQAVH

401 KAAHFGQGTG PIWLNEVFCF GRESSIEECK IRQWGTRACS

441 HSEDAGVTCT L

MSR1的2型同种型的氨基酸序列在NCBI数据库中的登记号为 NP_002436.1(gi：4505259)。在下文中将该序列简称为SEQ ID NO：4。

  1 MEQWDHFHNQ QEDTDSCSES VKFDARSMTA LLPPNPKNSP

 41 SLQEKLKSFK AALIALYLLV FAVLIPLIGI VAAQLLKWET

 81 KNCSVSSTNA NDITQSLTGK GNDSEEEMRF QEVFMEHMSN

121 MEKRIQHILD MEANLMDTEH FQNFSMTTDQ RFNDILLQLS

161 TLFSSVQGHG NAIDEISKSL ISLNTTLLDL QLNIENLNGK

201 IQENTFKQQE EISKLEERVY NVSAEIMAMK EEQVHLEQEI

241 KGEVKVLNNI TNDLRLKDWE HSQTLRNITL IQGPPGPPGE

281 KGDRGPTGES GPRGFPGPIG PPGLKGDRGA IGFPGSRGLP

321 GYAGRPGNSG PKGQKGEKGS GNTLRPVQLT DHIRAGPS

此外，在某些实施方式中，给予直接针对来自非人种属的MSR1多肽的抗 体可能是有用的。小鼠MSR1氨基酸序列的一个例子为登记号为 NP_001106797.1(gi：164664520)的序列。在下文中将该序列简称为SEQ ID  NO：5。

  1 MTKEMTENQR LCPHEQEDAD CSSESVKFDA RSMTASLPHS

 41 TKNGPSLQEK LKSFKAALIA LYLLVFAVLI PVVGIVTAQL

 81 LNWEMKNCLV CSLNTSDTSQ GPMEKENTSK VEMRFTIIME

121 HMKDMEERIE SISNSKADLI DTERFQNFSM ATDQRLNDIL

161 LQLNSLISSV QEHGNSLDAI SKSLQSLNMT LLDVQLHTET

201 LNVRVRESTA KQQEDISKLE ERVYKVSAEV QSVKEEQAHV

241 EQEVKQEVRV LNNITNDLRL KDWEHSQTLK NITFIQGPPG

281 PQGEKGDRGL TGQTGPPGAP GIRGIPGVKG DRGQIGFPGG

321 RGNPGAPGKP GRSGSPGPKG QKGEKGSVGG STPLKTVRLV

361 GGSGAHEGRV EIFHQGQWGT ICDDRWDIRA GQVVCRSLGY

401 QEVLAVHKRA HFGQGTGPIW LNEVMCFGRE SSIENCKINQ

441 WGVLSCSHSE DAGVTCTS

MSR1多肽序列的其它例子可以见于NCBI数据库中。例如，有用的MSR1 核酸和多肽序列包括用以下登记号表示的那些序列：

NM_001191939(RNA)，XP_001065601(蛋白)；

NM_138715(RNA)，NP_619729(蛋白)；

NM_002436(RNA)，NP_002436(蛋白)；以及

NM_001113326(RNA)，NP_001106797(蛋白)。

用上述登记号表示的多肽能够用于制备抗原肽，所述抗原肽可用于产生抗- MSR1的抗体。来自上述多肽序列的抗原肽的例子包括下列所述。

大鼠MSR1(SEQ ID NO：6)：RSGFPGPKGQKGEKGRAG(aa 328-345)

人MSR1，I(SEQ ID NO：7)：RPGNSGPKGQKGEKGSGN(aa 325-342)

人MSR1，II(SEQ ID NO：8)：RPGNSGPKGQKGEKGSGN(aa 325-342)

小鼠MSR1(SEQ ID NO：9)：RSGSPGPKGQKGEKGSVG(aa 332-349)

根据本发明，直接针对MSR1多肽的抗体，以及此类抗体的功能等效物可 用于治疗自身免疫疾病和炎性疾病。因此，MSR1多肽和MSR1多肽的片段， 包括MSR1和MSR1表位的抗原片段，可以用于产生抗-MSR1抗体。能够用于 产生抗-MSR1抗体的此类多肽的例子包括SEQ ID NO：1-5所示序列的任意一 个。而且，MSR1片段和抗原肽，包括MSR1多肽的任意细胞外结构域，能够 用于产生抗-MSR1抗体。能够用于产生抗-MSR1抗体的MSR1片段和抗原肽的 例子包括SEQ ID NO：2、6、7、8和9所示的序列。

能够用于本文所述方法的抗体的功能等效物包括嵌合抗体、修饰抗体、人 源化抗体、重组抗体和/或这些抗体、嵌合抗体、修饰抗体、人源化抗体和/或重 组抗体的片段。嵌合抗体包括非人类抗体的可变区。人源化抗体包括非人类抗 体的高可变区(CDR)。人源化抗体除高可变区外的可变区，例如框架可变 区，和恒定区均为人类抗体。修饰抗体能够去免疫化，使其对给定种属例如人 的免疫原性低于未经修饰的对应物的免疫原性。可以通过本领域公知的多种方 法制备人类抗体，包括免疫已转染人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(Hudson P  and Souriau C，Nature Medicine 9：129(2003))。可以由噬菌体展示文库或 mRNA(核糖体)展示文库通过分子克隆、产生多样性和提高的亲和性，以及 体外系统中的蛋白表达，产生工程化的重组人抗体(MacCafferty J等，Nature 348：552(1990)；见综述Benhar I，Expert Opin.Biol.Ther.7：763(2007)和Li J and  Zhu Z，Acta Pharmacol.Sin.31：1198(2010))。

抗体或抗体的功能等效物以亲和性和/或特异性与MSR1相互作用，例如结 合。在某些实施方式中，抗-MSR1抗体和/或此类抗体的功能等效物以高亲和性 和/或高选择性与MSR1结合。例如。抗体或功能等效物能够以至少10⁷M^-1的 亲和常数与人MSR1结合。在某些实施方式中，抗体或功能等效物能够以10⁸M^-1和10¹⁰M^-1之间或约10⁹M^-1的亲和常数与人MSR1结合。

在某些实施方式中，抗体或其功能等效物也可以与MSR1的细胞外结构 域，最优选人MSR1的细胞外结构域，相互作用或结合。

在某些实施方式中，抗体或其片段为重组或修饰的抗-MSR1抗体，其选 自，例如嵌合抗体、人源化抗体、去免疫化抗体或体外产生的抗体或其片段。

对于本申请的目的而言，合适的非人类抗体可变区和高可变区可以来自任 意非人类哺乳动物产生的抗体，单克隆抗体产生于所述非人类哺乳动物。人以 外的合适的哺乳动物的例子包括，例如家兔、大鼠、小鼠、马、山羊、美洲驼 或灵长类。优选小鼠。可以利用本领域任意公知的方法将抗体人源化或去免疫 化。

功能等效物进一步包括抗体片段，其结合特性与完整抗体相同或相当。此 类片段可以，例如，包含F(ab′)₂片段的一个或两个Fab片段。优选地，抗体片 段包含整个抗体的全部六个互补决定区，抗体片段也包括功能片段，所述功能 片段包含少于全部此类片段，如三个、四个、或五个CDR。

优选的片段为单链抗体，或Fv片段。单链抗体是至少包含抗体重链可变区 的多肽，该抗体重链可变区与轻链可变区连接，可以带有或不带互相连接的连 接子。因而，Fv片段包含整个抗体结合位点。这些链可以在细菌或真核细胞中 生产。

抗体和功能等效物可以是任意分类免疫球蛋白成员，如：IgG、IgM、 IgA、IgD，或IgE，及其亚类。Fab片段也可以来自任意此类免疫球蛋白，并且 功能等效物也可以是任意上述免疫球蛋白分类和亚类的等效物或组合。

本发明的抗体能够与MSR1结合，并且可以具有抑制其活性的功能。此类 抗体可能具有潜在治疗作用，特别是通过抑制巨噬细胞的功能治疗自身免疫性 疾病。

本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体或其功能等效物。本发明的 抗体能够与MSR1结合，并且可以具有抑制其活性的功能。此类抗体可能具有 潜在治疗作用，特别是通过抑制MSR1的功能治疗自身免疫性脱髓鞘神经病变 或涉及巨噬细胞浸润的其它自身免疫疾病。

可以通过本领域公知的技术生产单克隆抗体。该程序包括从哺乳动物(例 如，小鼠)的脾脏中获得免疫细胞(淋巴细胞)，该哺乳动物已在体内或体外 被目标抗原免疫。然后将分泌抗体的淋巴细胞与(小鼠)骨髓瘤细胞或转化细 胞融合，其能够在细胞培养过程中无限复制，由此产生永生化的分泌免疫球蛋 白的细胞系。培养得到的融合细胞或杂交瘤，筛选得到集落，以生产所需的单 克隆抗体。克隆产生此类抗体的集落，使其在体内或体外生长，以生产大量抗 体。对此类细胞融合的理论基础和实施方法学的描述参见Kohler等.，Nature 256： 495(1975)，其全部内容通过引用并入本文。

用全长天然抗原或代表全长抗原的一个或多个表位的肽对动物(例如，小 鼠)进行体内免疫，从而免疫哺乳动物淋巴细胞。如有必要，在至多数周时间 间隔内重复进行此类免疫，以获得足够的抗体滴度。在末次抗原加强后，处死 动物并取脾细胞。

可以通过标准的和公知的技术实现与哺乳动物骨髓瘤细胞的融合，或与其 它在细胞培养中具有无限复制能力的融合伴侣的融合，例如通过使用聚乙二醇 (“PEG”)或其它融合剂(Kohler G and Milstein C.，Eur.J.Immunol.6：511 (1976)，其整体通过引用并入本文)。该永生化细胞系，应选择为缺乏利用某 些营养物质所必需的酶，能够迅速生长并且具有良好的融合能力的细胞系，该 永生化细胞系优选鼠源性的，但也可以使用来自其它哺乳动物种属的细胞，其 它哺乳动物种属包括但不限于大鼠和人。此类细胞中的多数均为本领域技术人 员所公知的，其它细胞也经常被描述。

单克隆抗体也可以通过筛选重组组合文库获得，例如抗体噬菌体展示文 库。参见，例如，P_HAGE D_ISPLAY-A L_ABORATORY M_ANUAL，Barbas，等，eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，纽约，2001；和Kontermann & Dübel，A_NTIBODY E_NGINEERING，Heidelberg：Springer-Verlag.柏林，2001。

编码抗-MSR1抗体的核酸可以来自经MSR1多肽、表位或抗原肽免疫的动 物，通过使用动物B细胞或血浆细胞的RNA获得表达文库，然后筛选编码抗 体的序列来产生编码抗-MSR1抗体的核酸。参见，例如，Antibodies，A  Laboratory Manual by Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉 港，纽约，1988，和Molecular Cloning，A Laboratory Manual by Sambrook，等.， Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，纽约，(1989)，上述公开的内容通过 引用并入本文。

简言之，可以使用免疫细胞，该免疫细胞对特定抗原(如单核细胞)敏 感，或对来自用MSR1多肽、表位或抗原肽免疫的动物的脾细胞敏感。根据 Barbas等.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 88：7978-7982(1991)；以及美国专利号 5,580,717；5,972,656；6,113,898；和6,140,470中所描述的噬菌体展示技术处理 细胞。这些文件公开的内容通过引用并入本文。从细胞中分离总RNA，可以对 RNA进行处理以获得聚腺苷酸化RNA(poly-A RNA)。经寡d(T)引物杂交 后，逆转录RNA(mRNA)以产生相应的cDNA。将该cDNA用于分离编码本 发明抗体的核酸。可以通过聚合酶链式反应(PCR)对cDNA进行扩增，以获 得编码本发明抗体的核酸。在PCR中使用选定的引物，以分离核酸，该核酸编 码多肽片段，例如V_H、V_L、以及恒定区。

通过使用本领域公知的重组DNA技术能够将cDNA或PCR产物插入载 体，例如噬菌体、噬菌粒或质粒。参见，Sambrook等.(1989)。可以将含有 cDNA或PCR产物的载体引入细菌以生成表达文库，其成员表达cDNA或PCR 产物编码的多肽，例如全长轻链或重链多肽、单链可变多肽、或单链Fab或 Fab’。

该方法还能够用于生产融合至噬菌体衣壳蛋白的多肽。可以按照上述参考 文献和专利中所描述的对重组噬菌体文库进行筛选，以选择表达与E2糖蛋白或 E1E2复合物特异性结合抗体的文库成员。可以通过将文库与免疫抗原结合、除 去未结合的噬菌体、然后除去结合的噬菌体完成筛选。

宿主细菌细胞如E.coli或其它合适的细菌，可以用表达与选定的MSR1多 肽、表位或抗原结合的抗体的噬菌体文库成员转染。可以通过连续稀释和铺板 将得到的细菌细胞分离成集落，这样各集落单独表达其独特的抗体。噬菌体还 可以携带选择性标记，如抗生素抗性基因，这样通过在含有所述抗生素的培养 基中培养宿主细胞文库，可以鉴定出表达本发明抗体的宿主细菌细胞。通过用 MSR1多肽、表位或抗原肽进行结合检测，对来自单一集落的培养物进行检 测，以鉴定出表达具有特定免疫反应性抗体的集落。

在对表达具有特定免疫反应性的抗体的细菌集落进行选择后，可以采用已 知的核苷酸测序方法，确定选定的培养物中编码CDR、框架区，或者可变区或 恒定区的核酸序列。因此，可以从噬菌体文库获得编码本发明抗体CDR序列、 框架序列和/或恒定区的核酸。

可以根据Sastry等.，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.86：5728(1989)和Barbas等.， P_HAGE D_ISPLAY：A L_ABORATORY M_A NUAL.New York：Cold Spring Harbor  Laboratory Press (2001)中的描述，对来自源单核细胞mRNA的Fd和κ区进行 PCR扩增。使用mRNA逆转录获得的cDNA和用于重链序列或轻链序列扩增的 特异性引物进行PCR扩增。

信使RNA(mRNA)的PCR扩增可以用于克隆和表达来自B细胞的重链 序列(例如，Fd片段的扩增)和κ轻链序列，用在扩增产物末端掺入限制性位 点的寡核苷酸从单核细胞分离信使RNA(mRNA)。用于这些扩增的寡核苷酸 引物与已成功用于V_H和V_L序列扩增的那些引物类似(参见Sastry等.，Proc. Natl.Acad.Sci U.S.A.，86，5728(1989)和Barbas等.，P_HAGE D_ISPLAY：A  L_ABORATORY M_ANUAL.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))。 具有代表性的，在这些引物中并入限制性核酸内切酶识别序列，以使得扩增片 段克隆至适当载体(即，噬菌粒或λ噬菌体)的预定阅读框，以用于表达。

噬菌体通过类似挤出的过程通过细菌膜进行组装。例如，丝状噬菌体M13 可以用于此过程。该噬菌体具有406个残基的微小噬菌体衣壳蛋白(cpIII)， 其在挤出前表达并在E.coli外周胞质的内膜侧蓄积。cpIII的两个功能性质，即 感染性和正常(非多聚噬菌体)形态发生，大致分配于该基因的第一和第二部 分。cpIII的N-末端结构域结合至F′菌毛，使得其感染E.coli，而膜结合的C-末 端结构域P198-S406起形态发生的作用，即根据载体聚合模型在丝状体尾部末 端加帽。

可以通过构建噬菌粒载体将抗体片段链如Fab、Fab’或Fd链与cpIII的C- 末端结构域融合(参见Barbas等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978 (1991))。可以使用缺乏有序二级结构的柔性五氨基酸链(GGGGS；SEQ ID  NO：13)将已表达的片段链和cpIII结构域间隔开，以最小化相互作用。还可以 构建噬菌粒载体，使之包含编码Fab片段轻链的核苷酸。可以在单独的lac启动 子/操纵子序列的控制下放置cpIII/Fd片段融合蛋白和轻链蛋白，并通过pelB前 导序列将其引导至外周胞质区，以便在膜上进行功能性组装。载体中包含的噬 菌体F1基因间隔区可以使单链噬菌粒在辅助噬菌体的帮助下进行包装。使用辅 助噬菌体过度感染，可以引起两种形式的cpIII的表达。cpIII/Fd片段融合蛋白 与辅助噬菌体的天然cpIII之间会为了整合入病毒粒而竞争，因此使得正常噬菌 体的形态发生紊乱。得到的经包装的噬菌粒可以携带天然cpIII，其对于感染是 必要的，以及包括Fab片段的融合蛋白，其被展示并用于与抗原发生相互作用 以及用于选择。在噬菌粒方法中有必要在C-末端结构域融合cpIII，因为与感染 性N-末端结构域的融合将使得宿主细胞对感染具有抗性。结果为获得展示抗体 结合位点(“Phabs”)的噬菌体。抗体结合位点，例如Fab片段，展示于噬菌 体的衣壳。此项技术可以用于在丝状噬菌体如M13的噬菌体外壳上生产 Phabs，其展示重组产生的Fab片段，例如与抗原发生免疫反应的重组产生的 Fab片段。

已有关于在丝状噬菌体表面展示抗体Fab片段的噬菌粒载体(即，pComb 3或pComb3H)的描述(参见Barbas等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978 (1991))。pComb 3和pComb3H中包含了用于克隆重链Fd序列的Xho I和Spe  I位点，其中重链Fd序列经PCR扩增。还提供了用于克隆抗体轻链的Sac I和 Xba I位点，其中抗体轻链经PCR扩增。这些克隆位点与已知的小鼠和人PCR 引物相容(参见，例如Huse等.，Science 246：1275-128l(1989))。pelB前导序 列的核苷酸序列从λHC2和λLC2构建体中募集，如上文所述的Huse等中所描 述，并保留了阅读框。用Spe I和Nhe I对编码选定Fab的pComb 3和 pComb3H进行消化，以除去基因III片段，其包括编码抗体Fab片段的核苷酸 序列。因为Spe I和Nhe I产生相容的粘性末端，所以经消化的载体还可以重新 连接，以产生能生成可溶性Fab的噬菌粒。

可以通过对含有噬菌粒的细胞(例如，感染的E.coli XL-1蓝菌株)感染过 夜，以生产Phabs，其产生的典型滴度为10¹¹cfu/ml。通过使用编码不同抗生素 抗性的噬菌粒，在选择性板上根据滴度可以容易地确定不同克隆的噬菌体的比 率。在单通道浓缩实验中，可以用抗原-包被的板孵育克隆的混合噬菌体。通过 洗涤除去非特异性噬菌体，然后可以使用酸洗脱分离结合的噬菌体。

本发明的方法中使用的抗体或抗体片段还可以是多克隆抗体或其片段。

制备多克隆抗体的程序也是已知的。一般地，可以通过皮下给予动物天然 抗原或其肽(例如，与半抗原偶联的合成肽)生产此类抗体。能够用于生产多 克隆抗体的动物包括小鼠、大鼠、山羊、新西兰白兔、马、猴和其它动物。在 某些实施方式中，首先对动物进行取血以获得免疫前血清。可以根据选定动物 的种属注射适当体积的抗原。例如，家兔每个位点和多个位点(例如，六个不 同位点)可以注射的总体积为约100ul。注射材料的一个例子可以是含有有效 佐剂如弗氏完全佐剂的抗原乳剂。在首次注射约两周后对动物进行取血，并使 用相同的抗原定期加强，例如在六周内注射约三次。然后在各次加强注射后约 10天收集血清样品。再从血清中回收多克隆抗体。可以通过使用相应抗原的亲 和层析，通过抗原捕获抗体回收多克隆抗体。最后，将动物安乐死。例如，静 脉注射150mg/Kg戊巴比妥使家兔安乐死。用于制备多克隆抗体的该方法和其 它方法，包括在其它种属如山羊中制备，已在Harlow等，editors，Antibodies：A  Laboratory Manual(1988)中公开，其全部内容通过引用并入本文。

可以在转基因哺乳动物中，特别是经过遗传修饰以表达人抗体的转基因小 鼠中，生产基本是人类的抗体。制备嵌合抗体和人源化抗体的方法也是本领域 所公知。例如，制备嵌合抗体的方法包括在美国专利号4,816,397和4,816,567 中所描述的方法，其全部内容通过引用并入本文。制备人源化抗体的方法在美 国专利号5,225,539中有描述，其全部内容通过引用并入本文。

用于抗体人源化的一种方法称为CDR-移植。在CDR-移植中，将与抗原结 合直接相关的小鼠抗体区域，即CDR的互补决定区，移植至人可变区，构建出 “改造的”人可变区。然后将这些完全人源化的可变区与人恒定区连接，以构 建完整的“完全人源化”抗体。

为构建能够与抗原较好结合的完全人源化抗体，需要仔细设计改造的人可 变区。仔细选择将要移植入人可变区的CDR。可以在人可变区的框架区(FR) 的不同位置改变少量氨基酸。

例如，改造的人可变区可以在选定人轻链可变区的FR内有至多十个氨基 酸的改变，以及在选定人重链可变区的FR内有至多十二个氨基酸的改变。分 别将编码这些改造的人重链和轻链可变区基因的DNA序列，与编码人重链和轻 链恒定区基因，优选γ1和κ，的DNA序列连接。然后在哺乳动物细胞中表达改 造的人源化抗体，并将其针对靶点的亲和性与相应的鼠源性抗体和嵌合抗体比 较。

选择将被取代的人源化抗体残基以及制备取代物的方法均为本领域的公知 常识。参见，例如，Co等.，Nature 351：501-502(1991)；Queen等.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86：10029-1003(1989)和Rodrigues等.，Int.J.Cancer，副刊7：45-50 (1992)，其全部内容通过引用并入本文。对225抗EGFR单克隆抗体进行人源 化和改造的方法，作为一个例子，在WO 96/40210中有相关描述，其全部内容 通过引用并入本文。可以将该方法用于针对其它蛋白的抗体人源化和改造。

制备单链抗体的方法也是本领域的公知常识。一些例子包括欧洲专利申请 号502812和Wels等.，Int.J.Cancer 60：137-144(1995)中所描述，其全部内容通 过引用并入本文。也可以通过筛选噬菌体展示文库制备单链抗体。

用于生产抗体的功能等效物的其它方法已在WO 93/21319、欧洲专利申请 号239 400、WO 89/09622、欧洲专利申请号338 745、美国专利号5,658,570、 美国专利号5,693,780、和欧洲专利申请号332 424中公开，其全部内容通过引 用并入本文。

给予MSR1抑制剂

在实施本发明的方法时，通过全身或局部向对象给予抑制剂(例如，抗体 或其片段)实施给药步骤。可以给予单一抑制剂或抑制剂的组合。因此，例 如，可以口服、皮内、肌内、腹腔(ip)、静脉、皮下、或鼻腔给予抑制剂。

本发明的抑制剂可以单独给予或与适宜的药物载体一同给予，其可以是固 体或液体形式，如使用片剂、胶囊、粉末、溶液、混悬液，或乳剂。因此，在 某些实施方式中，抑制剂以包含在组合物中的形式提供，组合物例如，药物组 合物。

在有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的条件下给予抑制剂，在本文所述的 治疗方法的相关描述中，涉及的条件，如时间、抑制剂的量、抑制剂的浓度 等，均是普通医务人员根据优化治疗和/或抑制所述疾病发病的需要可以确定和 改变的。

一般给予例如有效量(例如，治疗有效量)的抑制剂。有效量的抑制剂能 够，例如足以在哺乳动物中减轻炎症、减少脱髓鞘、减少轴突丢失和/或减少神 经元丢失。在某些实施方式中，有效量的抑制剂在哺乳动物中使此前已活化的 巨噬细胞去活化、抑制巨噬细胞活性、抑制抗原提呈和/或抑制细胞外粘附。

抑制剂的有效量的例子包括抑制剂的剂量范围为约0.005μg/kg至约100 mg/kg，或范围为约0.01μg/kg至约60mg/kg。本文所描述的抑制剂所需有效量 的另一个例子为约0.5μg至约750mg。

还可以在有效治疗和/或抑制疾病的间隔内给予抑制剂。在某些实施方式 中，抑制剂每日给予若干次(例如，每日两次或三次)。在其它实施方式中， 抑制剂每日给予一次，隔日给予一次、每周给予两次或每周给予一次。在另外 的实施方式中，抑制剂每月给予两次或每月给予一次。抑制剂的给药间隔根据 抑制剂的半衰期不同而不同。因此，例如，基于抗体的抑制剂的半衰期范围可 以从单结构域抗体和scFv的数分钟至多个IgG分子的数周。但是，可以对治疗 抑制剂，包括治疗抗体或抗体片段的半衰期进行调整，以帮助或优化其对疾病 的治疗和/或抑制。例如，在某些实施方式中，通过与聚乙二醇(PEG)、IgG 或血清白蛋白来调节抑制剂(包括抗体或抗体片段抑制剂)的半衰期。采用本 领域已知的方法可以很容易地进行此类连接。

治疗或抑制的自身免疫性疾病包括脱髓鞘神经病变，如慢性炎性脱髓鞘多 发性神经病变(CIDP)和格林-巴利综合症(GBS)；影响脑的自身免疫疾病， 如多发性硬化症、视神经脊髓炎、急性脱髓鞘脑脊髓炎(ADEM)；肌肉的自 身免疫疾病，如多肌炎和皮肌炎；胃肠道的自身免疫疾病，如溃疡性结肠炎、 克罗恩病、原发性胆汁性肝硬化、原发性胆管炎、和慢性活动性肝炎；血管系 统的自身免疫疾病，如血管炎、颞动脉炎、变应性肉芽肿血管炎、肉芽肿血管 炎和大动脉炎；肾脏系统的自身免疫疾病，如IgA肾病、自身免疫性肾炎和肺 出血性肾炎综合症；关节的自身免疫疾病，如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎 和风湿性多肌痛；皮肤的自身免疫疾病，如大疱性类天疱疮、特应性皮炎、斑 秃、牛皮癣和天疱疮；肺部系统的自身免疫疾病，如哮喘、肺纤维化、肺动脉 高压、肺泡炎和肉状瘤；内分泌系统的自身免疫疾病，如青少年糖尿病、艾迪 生氏病、桥本氏甲状腺炎，以及造血系统的自身免疫疾病，如再生障碍性贫血 和特发性血小板减少；以及影响若干系统的自身免疫疾病如：红斑狼疮、修格 兰氏综合症和白塞氏病。

本发明的方法能有效起作用的其它退行性/炎性疾病包括糖尿病神经病变、 肾病、微血管炎导致的视网膜病、以及中风；肌萎缩性脊髓侧索硬化症 (ALS)；HIV-1神经病变或脑病、以及亨廷顿舞蹈病，已证实巨噬细胞参在 这些疾病中起作用。

此外，下述疾病可能与MSR1抗体增加有关，表明可以使用本发明的方法 对其进行治疗：硬皮病、多器官功能障碍综合症、急性冠脉综合症、阿尔茨海 默氏症、和牙龈卟啉单胞菌。

发明人此前已报道了在慢性炎性脱髓鞘神经病变(CIDP)患者的腓肠神经 和皮肤中，MSR1和AIF-1(同种异体移植炎性因子1)的表达量升高(Renaud 等，J.Neuroimmunol.159：203(2005)；Lee等.，J.Neurol.Sci.，290：115(2010))。 CIDP是一种髓鞘靶向，特别是外周神经靶向，的自身免疫疾病，其导致进行性 无力和感觉丧失。

对于CIDP，腓肠神经组织活检的结果显示，巨噬细胞介导脱髓鞘(Vital 等.，Ultrastruct.Pathol.24：363(2000))、活化的巨噬细胞或巨噬细胞簇数量增 加(Griffin等，Ann.Neurol.，27：Suppl.S64(1990)；Sommer等，Neurology，65： 1924(2005))，以及巨噬细胞清道夫受体1(MSR1、SRA I/II、CD204)mRNA 的表达增加(Renaud等，J.Neuroimmunol.159：203(2005))。巨噬细胞还表现 出通过Fas-配体依赖性机制，在实验动物中引起脱髓鞘神经病变(Dace等， PLos One，22：4e7121(2009))。

下述非限制性实施例举例说明了本发明的多个方面，包括在本发明研究过 程中使用的一些方法。

实施例

在下述说明中，引用了作为本文一部分的附图，其中举例说明了可能实施 的实施方式。对这些实施方式进行详细描述以使得本领域技术人员能够实现本 发明，并且可以理解的是，可以利用其它实施方式，在不脱离本发明范围的情 况下，可以进行结构和逻辑上的改变。因而，下文对示例性实施方式的描述并 不是为了限制，本发明的保护范围由本发明的权利要求确定。

通过下述实施例对本发明说明书进行了进一步解释，从任何方面都不应该 认为是对本发明的限制。所有引用的参考文献(包括本申请说明书全文中引用 的参考文献、授权专利、公开的专利申请)的内容清楚地和明确地通过引用并 入本文。这些实施例涉及用抗-MSR1抗体的Fab片段抑制MSR1，但可以容易 地想到将其替换为其它MSR1抑制剂。

实施例1 抗-MSR1和抗-AIF-1抗体，包括其Fab片段的产生

用0.5mg在完全弗氏佐剂(CFA)(首次注射)或不完全弗氏佐剂(3次 加强)(Sigma，MO)中偶联至KLH(钥孔戚血蓝素)半抗原的肽，免疫山羊 可以生产针对大鼠MSR1(氨基酸328-345：RSGFPGPKGQKGEKGRAG；SEQ  ID NO：6)和AIF-1(氨基酸127-140：KNKEHQKPTGPPAK；SEQ ID NO：10) (GenScript，NJ)肽序列的抗体。MSR1和AIF-1肽是人序列的大鼠同源物，其 在此前用于生产抗人MSR1和AIF-1抗体。用于体内治疗时，使用木瓜蛋白酶 对经抗原柱亲和纯化的IgG抗体进行消化，以获得Fab片段并除去Fc。通过 ELISA(酶联免疫吸附试验)在肽包被孔中监测免疫血清、纯化的IgG和Fab 的特异性活性。从正常山羊血清中分离经蛋白G-柱亲和纯化及Fab片段化的天 然山羊IgG，其作为同种型对照。

实施例2 通过给予抗-MSR1 Fab片段抑制实验性自身免疫性神经炎(EAN)

用200μg外周髓磷脂P2肽(氨基酸53-78： TESPFKNTEISFKLGQEFEETTADNR；SEQ ID NO：11)(Genemed Synthesis， TX)皮下尾根部免疫雌性Lewis大鼠，以诱导实验性自身免疫性神经炎 (EAN)，其中外周髓磷脂P2肽在含结核分支杆菌H37RA(Sigma，MO) (Lonigro等，2009)的CFA中。免疫后第7天，在临床疾病首次出现前，和免 疫后的第12天，腹腔(ip)给予EAN大鼠1mg山羊抗-MSR1、抗-AIF-1的 IgG Fab片段，或天然山羊抗体，或等体积的PBS。其它对照组为仅给予完全弗 氏佐剂(CFA)的正常大鼠，或未经处理的正常大鼠。每日评估一次动物的体 重和疾病的严重程度，直至第21天恢复。疾病的严重程度由两名观察者按照下 列分值以单盲方式评估，其中当临床症状落在两个等级之间时以0.5的方式增 加评分：0＝正常，1＝尾部颜色变淡，尾尖悬起，2＝尾部无力，3＝尾部麻 痹，4＝步态共济失调，5＝后肢轻度瘫痪，6＝后肢中度瘫痪，7＝后肢严重瘫 痪或截瘫，8＝中度四肢瘫痪，9＝濒死，10＝死亡。各组选择3只代表性动 物，对其坐骨神经进行福尔马林固定，石蜡包埋切片，切片用苏木精&伊红染 色，以评估第17天时的炎性细胞浸润情况，此时未经治疗的EAN大鼠的病情 接近顶峰。各只动物均在100X倍放大的纵向切片的8个视野中，计数细胞总 数。

利用Mann-Whitney配对检验和Kruskal-Wallis多重比较、Fisher精确检 验、以及单因素ANOVA(GraphPad软件，美国)分别确定各治疗组之间的临床 评分、疾病发生率、组织学考察的统计学显著性差异(p＜0.05)。

结果

用P2肽(氨基酸53-78：TESPFKNTEISFKLGQEFEETTADNR；SEQ ID  NO：12)免疫的九只大鼠中的八只在第11天时出现了神经病变症状，持续4至 9天，其平均最大临床评分为5.0±3.0。疾病最严重程度的范围为后肢无力至严 重四肢瘫痪。

然而，给予抗-MSR1 Fab后，平均临床评分降低至0.2±0.4(p＜0.05)。 经抗-MSR1抗体的Fab片段的治疗阻止了大多数大鼠EAN发病，6只大鼠中只 有1只发病。EAN发病的这只动物仅出现了2天的轻微神经病变临床症状(尾 尖跛行)(表1)。因此，抗-MSR1组的发病率显著低于未经治疗的EAN组 (p＜0.05)。在抗-MSR1抗体治疗组中，临床疾病的最严重程度(图1，表 1)显著降至0.2±0.4，而相比之下未经治疗的EAN大鼠为5.0±3.0(p＜ 0.05)。

在症状达到高峰期间，坐骨神经的单核细胞浸润的降低程度(图2，表2) 在这两组之间也具有显著性，在未经治疗EAN组观察到的结果为382±34个细 胞/mm²，而相比之下在抗-MSR1治疗组中为6±5个细胞/mm²(p＜0.001)。

抗-AIF-1或正常IgG Fab治疗组的临床评分分别为3.2±2.6和2.4±3.1，其 与未经治疗的EAN大鼠之间不存在显著性差异(图1)。抗-AIF-1或天然IgG  Fab治疗组的细胞浸润情况与未经治疗的EAN接近。然而，Fab抗-AIF-1抗体 和正常IgG Fab使疾病的严重程度有所降低，但其与未经治疗EAN动物组之间 的差异并没有统计学显著性(表1，图1)。

表2.坐骨神经的炎性细胞浸润

^a各组中3只代表性动物的平均值±标准偏差

^*与EAN组比较，在p＜0.001水平上存在显著性差异(单因素ANOVA)

这些数据表明抗-MSR1抗体(或其Fab片段)能抑制实验性自身免疫性神 经炎的发病或降低其严重程度。抗-MSR1抗体的Fab片段对EAN的显著抑制表 明，这为自身免疫性脱髓鞘外周神经病变以及其它巨噬细胞发挥病理作用的自 身免疫疾病提供了一种新型治疗剂。

因此，抗-MSR1抗体(或Fab)在实验大鼠中能抑制巨噬细胞活性，并阻 止炎性脱髓鞘神经病变。而且，这些抗-MSR1抗体(或Fab)能与人MSR1以 及大鼠MSR1结合(见实施例3)。因此，这些数据表明抗-MSR1抗体(或其 Fab片段)可以用于治疗涉及巨噬细胞的人类炎性疾病，包括CIDP或格林-巴 利综合症(GBS)。

实施例3.抗大鼠MSR1抗体(或其Fab片段)与人MSR1的交叉反应

实施例1中描述的抗-MSR1抗体针对大鼠MSR1而产生，以用于实施例2 描述的EAN大鼠模型的体内治疗。通过用大鼠MSR1肽325-342(SEQ ID  NO：6)免疫以产生这些抗大鼠MSR1抗体，其与SEQ ID NO：7和8所示的人 MSR1肽具有同源性。

为确定是否这些抗大鼠MSR1抗体(或其Fab片段)也能够与人巨噬细胞 上的MSR1结合，将人皮肤活检样品的石蜡包埋切片与EAN研究中使用的抗大 鼠MSR1抗体共同孵育。通过与生物素化的家兔抗山羊IgG F(ab)2的二抗孵 育，然后与载体亲和素：生物素化过氧化物酶复合物(ABC)和过氧化物酶显 色底物新星红共同孵育，对结合进行检测。使用苏木精对切片进行复染。使用 正常山羊IgG Fab抗体片段对人皮肤切片进行类似的免疫组化染色，将其作为 阴性对照。

如图3所示，由大鼠MSR1肽325-342(SEQ ID NO：6)免疫产生的抗- MSR1抗体(或其Fab片段)也能够与人巨噬细胞的MSR1结合。当使用该抗 大鼠MSR1 Fab抗体对人皮肤活检样品的石蜡切片进行免疫组化染色时，观察 到了阳性结合(图3A、B、D)。使用阴性对照正常山羊IgG Fab抗体未检测到 结合(图3C)。

参考文献

下述各文件的全部内容均通过具体引用并入本文。

Barbas CF，Kang AS，Lerner A，Benkovic SJ.Assembly of combinatorial antibody  libraries on phage surfaces：the gene III site.Proc Natl Acad Sci，USA 1991；88： 7978-7982.

Benhar I.Design of synthetic antibody libraries.Expert Opin Biol Ther 2007；7： 763-79.

Co MS，Queen C.Humanized antibodies for therapy.Nature 1991；351：501-2.

Dace DS，Khan AA，Stark JL，Kelly J，Cross AH，Apte RS.Interleukin-10 overexpression promotes Fas-ligand-dependent chronic macrophage-mediated  demyelinating polyneuropathy.PLos One.2009；22：4e7121

Griffin JS，Stoll G，Li CY，Tyor W，Cornblath DR.Macrophage responses in  inflammatory demyelinating neuropathies.Ann Neurol 1990；27：Suppl：S64-8.

Hudson PJ，Souriau C.Engineered antibodies.Nat Med 2003；9：129-134.

Huse WD，Sastry L，Iverson SA，Kang AS，Alting-Mees M，Burton DR，Benkovic SJ， Lerner RA.Science 1989；246，1275-1281.

Husemann J，Loike JD，Anankov R，Febbraio M，Silverstein SC.Scavenger receptors  in neurobiology and neuropathology：their role on microglia and other cells of the  nervous system.Glia 2002；40：195-205.

Kohler G，Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of  predefined specificity.Nature 1975；256：495-7.

Kohler G，Milstein C.Derivation of specific antibody-producing tissues culture and  tumor lines by cell fusion.Eur J Immunol 1976；6：511-9.

Laughlin RS，Dyck PJ，Melton LJ，Leibson C，Ransom J，Dyck PJ.Incidence and  prevalence of CIDP and the association of diabetes mellitus.Neurology 2009；73：39- 45.

Lee G，Xiang Z，Brannagan TH，Chin RL，Latov N.Differential Gene Expression in  Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy(CIDP)Skin Biopsies.J Neurol  Sci 2010；290：115-22.

Li J，Zhu Z.Research and development of next generation of antibody-based  therapeutics.Acta Pharmacol Sin 2010；31：1198-207.

Lonigro A，Devaux JJ.Disruption of neurofascin and gliomedin at nodes of Ranvier  precedes demyelination in experimental allergic neuritis.Brain 2009；132：260-73.

McCafferty J，Griffiths AD，Winter G，Chiswell DJ.Phage antibodies：filamentous  phage displaying antibody variable domains.Nature 1990；348：552-554.

Platt N，Gordon S.Is the class A macrophage scavenger receptor(SR-A) multifunctional？-The mouse′s tale.J Clin Invest 2001；108：649-54.

Queen C，Schneider WP，Selick HE，Payne PW，Landolfi NF，Duncan JF，Avdalovic  NM，Levitt M，Junghans RP，Waldmann TA.A humanized antibody that binds to the  interleukin 2 receptor.Proe Natl Acad Sci USA 1989；86：10029-33.

Renaud S，Hays AP，Brannagan TH 3rd，Sander HW，Edgar M，Weimer LH，Olarte  MR，Dalakas MC，Xiang Z，Danon MJ，Latov N.Gene expression profiling in  chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy.J Neuroimmunol.2005；159： 203-14.

Rodrigues ML，Shalaby MR，Werther W，Presta L，Carter P.Engineering a  humanized bispecific F(ab’)2 fragment for improved binding to T cells.Int J Cancer  Suppl.1992；7：45-50.

Sastry L，Alting-Mees M，Huse WD，Short JM，Sorge JA，Hay BN，Janda KD， Benkovic SJ，Lerner RA.Cloning of the immunological repertoire in Escherichia coli  for generation of monoclonal catalytic antibodies：construction of a heavy chain  variable region-specific cDNA library.Proc Natl Acad Sci USA 1989；86，5728-32.

Sommer C，Koch S，Lammens M，Gabreels-Feston A，Stoll G，Toyka KV， Macrophage clustering as a diagnostic marker in sural nerve biopsies of patients with  CIDP.Neurology 2005；65：1924-9.

Usui HK，Shikata K，Sasaki M，Okada S，Matsuda M，Shikata Y，Ogawa D，Kido Y， Nagase R，Yozai K，Ohga S，Tone A，Wada J，Takeya M，Horiuchi S，Kodama T， Makino H.Macrophage scavenger receptor-A-deficient mice are resistant against diabetic nephropathy through amelioration of microinflammation.Diabetes.2007；56： 363-72.

Vital C，Vital A，Lagueny A，Ferrer X，Fontan D，Barat M，Gbikpi-Benissan G， Orgogozo JM，Henry P，Brechenmacher C，Bredin A，Desbordes P，Ribiere-Bachelier  C，Latinville，D，Julien J，Petry KG.Chronic inflammatory demyelinating  polyneuropathy：immunopathological and ultrastructural study of peripheral nerve  biopsy in 42 cases.Ultrastruct Pathol 2000；24：363-9.

Wels W，Beerli R，Hellmann P，Schmidt M，Marte BM，Kornilova ES，Hekele A， Mendelsohn J，Groner B，Hynes NE.EGF receptor and p185erbB-2-specificc single- chain antibody toxins differ in their cell-killing activity on tumor cells expressing both  receptor proteins.Int J Cancer 1995；60：137-44.

本文中引用或提及的所有专利和出版物显示了本发明相关领域技术人员的 水平，所述引用的每一篇专利或出版物均通过引用的方式并入本文，就如同其 在本文中已经通过对每一篇都整体引用或者整体并入的方式参考并入本文。申 请人保留在本说明书中实际并入来自任意所述引用的专利或出版物的任意及所 有材料和信息的权利。

本文描述的具体的方法和组合物代表的是优选的实施方式，并且是示例性 的，而不是为了对本发明的范围进行限制。本领域技术人员在考虑本说明书时 可以想到其他目标、方面和实施方式，这些目标、方面和实施方式均包括在本 发明的范围内，其由本发明的权利要求所限定。对本领域技术人员显而易见的 是，在不偏离本发明的范围和主旨的情况下，可以对本文所公开的发明进行多 种替换和修改。本文所述的发明的实施，并不一定需要在本文中没有作为必要 条件明确公开的任意一个或多个要素或者一种或多种限制。可以以不同的步骤 顺序来合适地实施本文中举例说明的方法和过程，且其并不一定限制为本文中 或权利要求书中所说明的步骤顺序。除非上下文中另外明确指出，否则在本文 及本发明的权利要求书中使用的单数形式的“一个”、“一种”和“这种”包 括复数对象。因此，例如提及“一个抗体”，则包括多个(例如，抗体溶液或 一系列抗体制品)这种抗体，等等。在任何情况下，在任何情况下，本发明都 不应当被解释为受限于本发明所具体公开的具体的实施例或实施方式或方法。 在任何情况下，本专利都不能被解释为受限于专利商标局的任何审查员或任何 其他官员或雇员所作的任何声明，除非申请人明确且无限制或保留，清楚地将 这种声明记录在答复稿中。

本文所使用的术语和表达是用作描述性而非限制性术语，使用这些术语和 表达并不是为了排除所表现的和所描述的特征或其部分的任何等价形式，应当 理解的是在本发明所要求保护的范围内可以进行多种改变。因此，可以理解的 是，虽然已经通过优选的实施方式和可选的特征具体地公开了本发明，但是本 领域技术人员可以采用改变和变化的本文所公开概念，并且这些改变和变化仍 然在本发明的范围内，本发明的范围由本发明的权利要求书和声明来限定。

根据37C.F.R.§1.72(b)的规定提供了摘要，以便读者能够快速确定本发明 技术公开的性质和要点。可以理解，提交的摘要并非用于解释或限定权利要求 的范围或意义。

下述实施方式是本发明的一部分。

1.一种治疗哺乳动物自身免疫疾病或炎性疾病的方法，该方法包括：在有 效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的条件下，向所需哺乳动物给予MSR1抑制 剂，其中该疾病包括巨噬细胞浸润。

2.根据实施方式1所述的方法，其中所述MSR1抑制剂是抗-MSR1抗体、 抗-MSR1抗体片段、抗-MSR1抗体的Fab或F(ab)₂片段、任意这些抗体或抗体 片段的功能等效物，及其组合。

3.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体； 或来自单克隆抗体的抗体片段、Fab片段或F(ab)₂片段。

4.根据实施方式1或2所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体；或多克 隆抗体制品的抗体片段、Fab片段或F(ab)₂片段。

5.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述抗体、抗体片段、Fab 片段或F(ab)₂片段来自重组抗体文库。

6.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述抗体、抗体片段、Fab 片段或F(ab)₂片段在真核细胞中表达。

7.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述抗体、抗体片段、Fab 片段或F(ab)₂片段在原核细胞中表达。

8.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述抗体、抗体片段、Fab 片段或F(ab)₂片段通过体外技术生产。

9.根据实施方式8所述的方法，其中所述体外技术包括使用抗体、抗体片 段、Fab片段或F(ab)₂片段的文库，其中抗体、抗体片段、Fab片段或F(ab)₂片 段展示于噬菌体、细胞或核糖体。

10.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述抗体、抗体片段、Fab 片段、F(ab)₂片段或其功能等效物与包含SEQ ID NO：1-9任意一项所示序列的多 肽或肽结合，此类结合可以是特异性结合和/或高亲和性结合，包括以本文所述 的任意亲和常数结合(例如，亲和常数至少为10⁷M^-1或亲和常数在10⁸M^-1与 10¹⁰M^-1之间或约10⁹M^-1)。

11.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

12.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾 病，包括本文所描述的或本领域技术人员公知的任意自身免疫性疾病。

13.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述疾病是自身免疫性脱 髓鞘神经病变。

14.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述疾病或自身免疫性脱 髓鞘神经病变是慢性炎性脱髓鞘多发性神经病变(CIDP)或格林-巴利综合症 (GBS)。

15.根据实施方式1-11任意一项所述的方法，其中所述疾病是炎性疾病，包 括本文所描述的或本领域技术人员所公知的任意炎性疾病。

16.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中MSR1抑制剂在哺乳动物 中，使此前已活化的巨噬细胞去活化、抑制巨噬细胞活性、抑制巨噬细胞相互 作用、抑制抗原提呈，和/或抑制细胞外粘附。

17.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述有效抑制自身免疫疾 病或炎性疾病的条件包括给予治疗有效量的MSR1抑制剂。

18.根据实施方式17所述的方法，其中所述治疗有效量的MSR1抑制剂使此 前已活化的巨噬细胞去活化、抑制巨噬细胞活性、抑制巨噬细胞相互作用、抑 制抗原提呈或抑制细胞外粘附。

19.根据实施方式17或18所述的方法，其中所述治疗有效量的MSR1抑制 剂在哺乳动物中减轻炎症、减少脱髓鞘、减少轴突丢失和/或减少神经元丢失。

20.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述有效抑制自身免疫疾 病或炎性疾病的条件包括在有效治疗疾病或抑制疾病发病的给药间隔内给予 MSR1抑制剂。

21.根据前述任意一项实施方式所述的方法，其中所述抑制剂每日给予一 次、两次或三次。

22.根据实施方式1-20任意一项所述的方法，其中所述抑制剂每周给予一 次、两次或三次，或者每月给予一次、两次或三次。

已在本文中广泛和概括地描述了本发明。在本公开所述的概括说明下的每 个更小的种类和亚属也形成本发明的一部分。这也包括在本发明的概括说明 中，有条件的限制或者反面限制从种属中去除的任何主题，而不管所去除的主 题在本文是否被具体地叙述。

其他实施方式在本发明的权利要求书范围内。此外，如果本发明的特征或 方面以马库什组的形式被描述，那么本领域技术人员应了解的是，本发明还由 此以马库什组的任何单个成员或成员亚组的形式被描述。