一种诱导葡萄茋类物质积累的方法

摘要

本发明涉及一种诱导葡萄叶、葡萄茎及葡萄果实中茋类物质白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋积累的方法，包括双氧水诱导剂的制备、葡萄在体与离体材料的喷洒处理、以及葡萄离体材料的浸泡处理的相关方法。本发明技术方案能够有效、特异、全面的诱导上述材料中茋类物质含量升高，且具有操作简单、安全，便于在葡萄资源丰富的乡镇企业进行大规模应用的特点。本发明既可增加葡萄品质也可增加葡萄种植废弃物的综合利用，还可使葡萄树对病原菌产生一定的抗性，减少病害所引起的损失。

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导葡萄叶、葡萄茎及葡萄果实中茋类物质白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋积累的方法。

背景技术

茋类物质（Stilbenes）是植保素的重要组成成分，存在于一些药用植物和食用植物中，如决明、藜芦、虎杖、葡萄、花生。其生物合成依赖于植物苯丙烷次生代谢途径，生成的茋类物质、查尔酮类物质、木质素等产物作为植物抗毒素、UV保护因子、花和果实色素、细胞壁结构成分和信号传导分子等，在植物逆境生理及病理过程中发挥了重要的作用^[1]。白藜芦醇是茋合酶（Stilbene synthase, STS）合成的最主要的物质。该途径其它关键酶还有苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL），肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H），4-肉桂酸辅酶A连接酶（4-coumarate CoA ligase，4CL），这些限速酶共同决定了植物材料中茋类物质的积累水平。

茋类物质包括二苯乙烯单体或聚合而成的多种化合物，比如反式和顺式白藜芦醇（Trans & Cis-resveratrol）、虎杖苷（Polydatin）、紫檀茋（Pterostilbene）、白皮杉醇（Piceatannol）、赤松素（Pinosylvin）、葡萄抗毒素（viniferins）以及其它多聚体。茋类物质生物活性研究早期多集中在其抗菌活性方向。1992年Renaud提出著名的“法国悖论”（French paradox），即法国人饮酒量与冠心病发病率之间出现矛盾。同年Siemann与Creasy首先证实葡萄酒中含有天然的反式白藜芦醇，并且对于人的肝、皮肤、心脏及血液循环、脂代谢有着重要的调理药效。关于茋类物质的药理药效研究逐渐升温，至目前已经发现白藜芦醇、紫檀茋、白藜芦醇苷等活性成分在抗氧化、抗炎、心血管保护、雌激素样调节及抗肿瘤方面有特殊的功效，茋类物质的药用价值受到人们的广泛关注^[2,3,4]。

在茋类活性成分获取方面，选择合适的植物材料成为该领域热点问题。以最主要的茋类物质白藜芦醇为例，目前主要是从蓼科植物虎杖根茎中提取。虎杖在采挖后必须重新种植，导致生产成本偏高。我国新疆有大面积的葡萄种植，这使得利用大量葡萄资源获取茋类活性成分成为可能。

由于葡萄相关材料茋类物质含量较低，直接获取茋类物质的产率很低。新生葡萄叶含有一定量的白藜芦醇，且变化范围较大（0.04－46 μg/g）；成熟的葡萄皮中也含有一定量的白藜芦醇（50－100 μg/g），且以红皮葡萄含量较高；葡萄藤茎中含有微量的顺式白藜芦醇（3.5 μg/kg）。在这些材料中，白藜芦醇苷含量较白藜芦醇高，部分材料含有极少量的紫檀茋。所有材料中，葡萄果肉中茋类物质含量极低^[5]。

为了提高葡萄相关材料的可利用性，使用诱导方式升高其中茋类物质含量成为研究关注热点。在诱导方式方面分为生物诱导和非生物诱导，其中以生物诱导和紫外诱导诱导效率较高，对葡萄茋类物质有明确且显著的升高。但在实践操作中，生物诱导会影响在体葡萄的产量和品质并可能导致葡萄感病；而紫外诱导操作复杂，辐照量不易控制，使其不便于大田开展，这使得通过化学诱导剂进行诱导成为关注重点。

在通过各种化学诱导剂诱导茋类物质积累的方案中，诱导剂的选择成为诱导的关键。以葡萄茋类物质代表物—白藜芦醇为例，已知的葡萄材料白藜芦醇的化学诱导剂分为三大类：1、铝剂：氯化铝、硫酸铝^[6]；乙磷铝^[7]；2、重金属：硫酸铜^[8]；3、植物激素：茉莉酸、茉莉酸甲酯^[9]；乙烯^[10]；水杨酸^[11]。

分析上述化学诱导葡萄白藜芦醇积累的技术方案时，发现存在着下述几点不足： i.  上述诱导方案对离体葡萄组织诱导效果不佳；ii. 上述诱导方案对茋类物质合成途径影响专一性不高，在体诱导过程中可能会影响葡萄的品质及产量；iii. 上述诱导方案针对茋类物质如白藜芦醇苷、紫檀茋的诱导特征不明；iv.  上述诱导方案并未考虑到实际操作难度，在大田操作时，材料选择及诱导剂的使用方式决定了诱导成本，铝剂诱导方案对特殊叶材料选择、茎干注射、乙磷铝协同UV光照处理、硫酸铜协同壳聚糖等诱导技术实施起来费时费力，无法实现大规模诱导；v.  上述诱导方案未考虑到诱导剂的土壤和植株的残留毒性，在农业生产上酸性铝、可溶铜盐的植物毒性已被公认，激素类试剂也具有一定的残留毒性，这些诱导试剂使用中会在土壤蓄积，造成一定的环境毒性，影响后续作物种植，也会在植株及果实中残留，影响食用者健康；vi. 上述诱导方案未考虑到在大田应用时会对操作人员的影响，酸性铝、乙磷铝以及硫酸铜、植物激素均具有一定的动物毒性，实际操作中可能会对操作人员造成一定的毒害，甚至在果实产生蓄留，具潜在毒性。

2002年我国葡萄种植面积近600万亩。随着对葡萄相关产品需求的增加葡萄种植面积呈现快速上升趋势，2009仅新疆维吾尔自治区葡萄种植面积就高达150万亩。为了充分利用这一有利条件和资源，针对已有提高葡萄相关材料中茋类物质白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋含量方法的不足，本发明的现实意义在于提供一种增加葡萄品质、提高葡萄营养保健价值及葡萄生产相关副产品综合利用的方法。

参考文献

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发明内容

本发明即一种诱导葡萄叶、葡萄茎及葡萄果实中茋类物质白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋积累的方法，其特征在于采取方法如下：

a、双氧水诱导剂的制备：直接取市售2.5％至10％的双氧水，或取市售浓度为3%至50％双氧水用水稀释至过氧化氢终浓度为2.5％至10％，在其中加入表面活性剂Triton X-100致其水溶液重量百分比终浓度为0.01％至0.1%作为双氧水诱导剂备用；

b、葡萄在体材料的喷洒处理：将步骤a制得的双氧水诱导剂对葡萄树进行喷洒，将葡萄树地上部分以每100重量份喷洒1至10重量份液态诱导剂进行处理；上述处理时间8至24小时。

c、葡萄离体材料的喷洒处理：将步骤a制得的液态诱导剂按1至10重量份喷洒到20至50重量份离体葡萄叶、茎干及果实上进行处理；上述处理时间12至48小时。 

d、葡萄离体材料的浸泡处理：取1至10重量份离体葡萄茎干、叶片、果实，将茎干之切口下端、叶之叶柄近茎端、葡萄果实之穗轴下端浸泡于10重量份步骤a制得的液态诱导剂中进行处理；上述处理时间12至48小时。

 上述一种诱导葡萄叶、葡萄茎及葡萄果实中茋类物质白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋积累的方法，其特征在于所述双氧水诱导剂的制备所用的水是自来水、蒸馏水、去离子水任何一种或混合。

上述一种诱导葡萄叶、葡萄茎及葡萄果实中茋类物质白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋积累的方法，其特征在于所述葡萄离体材料的喷洒和浸泡处理中，优选采用避光方式按所述处理时间进行处理操作。

上述一种诱导葡萄叶、葡萄茎及葡萄果实中茋类物质白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋积累的方法，其特征在于所述葡萄在体及离体材料的处理中，优选环境温度范围为16摄氏度至38摄氏度。

 

本发明的有益效果

 [0017]   i. 葡萄离体组织茋类物质诱导的有效性是解决葡萄生产废弃物有效利用的关键；现有技术方案中重金属及激素类诱导方案对离体葡萄组织诱导效果不佳；本发明的有益效果在于所使用技术方案能够显著且稳定诱导离体葡萄叶片、葡萄茎干及果实中白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋含量升高;如图1所示HPLC结果中，相比空白对照（图1上）5％浓度双氧水诱导剂按重量份1：1浸泡处理诱导红地球葡萄7月龄离体叶片白藜芦醇含量显著升高14倍（图1下），达到263 μg/g鲜重。

ii. 葡萄材料茋类物质诱导特异性是制约诱导效果的关键；现有技术方案对茋类物质合成途径影响专一性不高；本发明的有益效果在于所使用技术方案对葡萄茋类物质生物合成途径的影响具有专一性；如图2、图3所示RT-PCR结果中，红地球葡萄7月龄离体叶片茋类物质合成途径相关限速酶基因在本发明技术方案限定的诱导处理浓度范围内，该合成途径的相关分子表达呈现一致性显著上调。

 iii.   葡萄材料茋类物质诱导全面性是制约利用的关键；现有技术方案针对茋类物质如白藜芦醇苷、紫檀茋的诱导特征不明；本发明的有益效果在于所使用技术方案对葡萄主要茋类物质中白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋均有诱导升高效果；如图4所示HPLC结果中，相比空白对照（图4上）2.5％浓度双氧水按重量份1：1喷洒紫香无核葡萄废弃叶片后，导致叶片中白藜芦醇（Res）、白藜芦醇苷（PD）、紫檀茋（PS）含量显著升高（图4下）。

iv.   在大田操作时，材料选择及诱导剂的使用方式决定了诱导成本；现有技术方案并未考虑到实际操作难度；本发明的有益效果在于所使用诱导方法操作简单，仅涉及喷洒、浸泡两种相对简单的操作类别，有利于进行大规模诱导操作。

v.   由于双氧水诱导剂具有自然分解特性，诱导操作结束后会自然分解为水和氧气，不会对葡萄材料产生残留蓄积性毒性，喷洒或浸泡后不用洗脱，诱导剂操作喷洒过程不会对操作人员造成人身毒害。

vi. 本发明还优化了离体材料的喷洒和浸泡处理采用避光方式，可避免离体材料温度升高进而使得双氧水诱导剂提前分解，也可避免了茋类物质在离体材料中的见光分解，增加了诱导效果。

vii. 本发明还优化了在体及离体材料的处理中环境温度范围为16摄氏度至38摄氏度。低于此温度葡萄材料茋类物质合成途径对诱导敏感度下降，而高于此温度后双氧水诱导剂分解速度增加。

viii. 本发明方法不需要精密仪器或自动化设备，能够在葡萄资源丰富的乡镇企业进行大规模应用，既可增加葡萄品质也可增加葡萄种植废弃物的综合利用，由白藜芦醇属于典型的植保素，其含量在实施过程中升高可使葡萄树对病原菌产生一定的抗性，减少病害所引起的损失。

 

附图说明

 图1：高效液相法证实诱导前（上）诱导后（下）本技术方案对葡萄叶白藜芦醇含量的影响。

图2：RT-PCR法证实本技术方案对葡萄叶茋类物质合成上游关键途径限速酶基因表达量的提升效果。

图3：RT-PCR法证实本技术方案对葡萄叶茋类物质合成酶基因表达量的提升效果。

图4：高效液相法证实诱导前（上）诱导后（下）本技术方案对四种主要茋类物质含量的影响。

 

具体实施方式

 

 下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任何一个或类似实例。

 实施例1

取市售过氧化氢浓度为50％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度2.5%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.01作为液体诱导剂备用；将上述步骤制得的液态诱导剂对田间种植新梢生长期美国红提葡萄树进行喷洒，将葡萄树地上部分以每100重量份喷洒10重量份液态诱导剂进行诱导处理8小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到1.5倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到3.3倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到1.1倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇12 μg/g，白藜芦醇苷42 μg/g，紫檀茋3.2 μg/g。

 实施例2

取市售过氧化氢浓度为28％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度5%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.05作为液体诱导剂备用；将上述步骤制得的液态诱导剂对田间种植开花期矢富罗莎葡萄树进行喷洒，将葡萄树地上部分以每100重量份喷洒5重量份液态诱导剂进行诱导处理16小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到3.1倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到4倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到2倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇15 μg/g，白藜芦醇苷44 μg/g，紫檀茋3.3 μg/g。受试株微抗霜霉病菌。

 实施例3

取市售过氧化氢浓度为20％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度10%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.1%作为液体诱导剂备用；将上述步骤制得的液态诱导剂对田间种植浆果生长期无核紫葡萄树进行喷洒，将葡萄树地上部分以每100重量份喷洒1重量份液态诱导剂进行诱导处理24小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到6倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到16倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到5倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇110 μg/g，白藜芦醇苷144 μg/g，紫檀茋12 μg/g。受试株中抗霜霉病菌，果实微抗白腐病。

 实施例4

取市售过氧化氢浓度为3％的双氧水，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.02%作为液体诱导剂备用；对田间种植浆果成熟期赤霞珠葡萄树进行喷洒，将葡萄树地上部分以每100重量份喷洒8重量份液态诱导剂进行诱导处理10小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到2.6倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到5倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到3倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇75 μg/g，白藜芦醇苷104 μg/g，紫檀茋6.3 μg/g。受试株微抗霜霉病菌。

 实施例5

取市售过氧化氢浓度为30％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度2.5%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.02％作为液体诱导剂备用；对田间种植采摘期紫香无核葡萄树进行喷洒，将葡萄树地上部分以每100重量份喷洒10重量份液态诱导剂进行诱导处理24小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到3倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到10倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到2.6倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇23 μg/g，白藜芦醇苷159 μg/g，紫檀茋44.1 μg/g。受试株中抗霜霉病菌。

 实施例6

取市售过氧化氢浓度为45％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度3%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.04%作为液体诱导剂备用；将上述步骤制得的液态诱导剂10重量份喷洒到50重量份的新梢生长期美国红提葡萄离体葡萄叶、茎干及果实上进行处理，避光处理48小时，环境温度25摄氏度；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到1.2倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到4倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇14.5 μg/g，白藜芦醇苷51 μg/g，紫檀茋3.8 μg/g。

 实施例7

取市售过氧化氢浓度为35％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度6%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.05%作为液体诱导剂备用；将上述步骤制得的液态诱导剂1重量份喷洒到20重量份开花期矢富罗莎葡萄离体葡萄叶、茎干及果实上进行处理，避光处理36小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到1.6倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到2倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到1.1倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇7.5 μg/g，白藜芦醇苷22 μg/g，紫檀茋1.6 μg/g。

 实施例8

取市售过氧化氢浓度为10％的双氧水，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.8%作为液体诱导剂按5重量份喷洒到30重量份浆果生长期无核紫葡萄离体葡萄叶、茎干及果实上进行处理，避光处理12小时，环境温度16摄氏度；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到3倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到4倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到2倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇27.5 μg/g，白藜芦醇苷36 μg/g，紫檀茋3 μg/g。受试果实微抗白腐病。

 实施例9

取市售过氧化氢浓度为15％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度7.5 %，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.1%作为液体诱导剂备用；将上述步骤制得的液态诱导剂10重量份喷洒到20重量份成熟期赤霞珠葡萄离体葡萄叶、茎干及果实上进行处理，避光处理18小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到1.2倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到2.5倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到1.1倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇37.5 μg/g，白藜芦醇苷52 μg/g，紫檀茋3.1 μg/g。

 实施例10

取市售过氧化氢浓度为3％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度2.5%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.02%作为液体诱导剂备用；将上述步骤制得的液态诱导剂8重量份喷洒到24重量份采摘期紫香无核葡萄离体葡萄叶、茎干及果实上进行处理，避光处理24小时，环境温度36摄氏度；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到2.2倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到5.5倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到3倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇12.7 μg/g，白藜芦醇苷70.4 μg/g，紫檀茋7.5 μg/g。

 实施例11

取市售过氧化氢浓度为45％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度3%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.01 %作为液体诱导剂备用；取1重量份新梢生长期美国红提葡萄离体茎干、叶片、果实，将茎干之切口下端、叶之叶柄近茎端、葡萄果实之穗轴下端浸泡于10重量份上述液体诱导剂中，避光处理48小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到8倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到5倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇29 μg/g，白藜芦醇苷102 μg/g，紫檀茋7.6 μg/g。

 实施例12

取市售过氧化氢浓度为28％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度5%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.02 %作为液体诱导剂备用；取10重量份开花期矢富罗莎葡萄离体茎干、叶片、果实，将茎干之切口下端、叶之叶柄近茎端、葡萄果实之穗轴下端浸泡于10重量份上述液体诱导剂中，避光处理24小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到12倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到6倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到3倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇113 μg/g，白藜芦醇苷99 μg/g，紫檀茋4.2 μg/g。受试株中抗白腐病。

  实施例13

取5重量份浆果生长期无核紫葡萄离体茎干、叶片、果实，将茎干之切口下端、叶之叶柄近茎端、葡萄果实之穗轴下端浸泡于10重量份含表面活性剂Triton X-100重量百分比终浓度为0.02%的市售过氧化氢浓度为2.5％的双氧水中，避光处理12小时；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到4倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到6倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到3倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇42 μg/g，白藜芦醇苷55 μg/g，紫檀茋4.5 μg/g。

 实施例14

取市售过氧化氢浓度为12 ％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度6 %，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.02 %作为液体诱导剂备用；取8重量份成熟期赤霞珠葡萄离体茎干、叶片、果实，将茎干之切口下端、叶之叶柄近茎端、葡萄果实之穗轴下端浸泡于10重量份上述液体诱导剂中，避光处理36小时，环境温度38摄氏度；HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到2倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到6倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到2倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇90 μg/g，白藜芦醇苷124 μg/g，紫檀茋74 μg/g。

 实施例15

取市售过氧化氢浓度为20％的双氧水，加水稀释至过氧化氢终浓度10%，加入表面活性剂Triton X-100致其重量百分比终浓度为0.01 %作为液体诱导剂备用；取2重量份采摘期紫香无核葡萄离体茎干、叶片、果实，将茎干之切口下端、叶之叶柄近茎端、葡萄果实之穗轴下端浸泡于10重量份上述液体诱导剂中，避光处理16小时，环境温度30摄氏度； HPLC测得果实中总茋类物质鲜重含量平均升高到3.2倍，叶片中总茋类物质鲜重含量平均升高到8倍，茎干中茋类物质鲜重含量平均升高到6倍。叶片茋类物质鲜重含量平均值白藜芦醇18.4 μg/g，白藜芦醇苷127.2 μg/g，紫檀茋35 μg/g。