一种口蹄疫疫苗新型复合氢氧化铝佐剂以及制备疫苗方法

摘要

本发明公开了一种口蹄疫疫苗新型佐剂的配方以及用该佐剂的口蹄疫疫苗制备方法。用氢氧化铝佐剂加上2种免疫增强剂PolyI:C和R848，再和口蹄疫抗原混合后免疫小鼠，发现该疫苗的效力类似甚至优于现行的矿物油进口佐剂ISA206。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种口蹄疫疫苗新型佐剂的配方以及疫 苗制备方法。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是危害偶蹄动物的烈性传染病，尤其对主要 畜种猪、牛、羊的危害特别严重，能造成畜种生产力下降和不良的社会影响，社会经济 损失巨大。因该病传染性极强，世界动物卫生组织(FAO/OIE)将其列为头号必报烈性 传染病，国际贸易予以严格限制。我国将该病列为一类动物传染病之首。在世界上许多 国家，尤其是非洲、亚洲和南美洲国家，该病发生次数频繁，流行严重。此外，不时出 现全球的流行性爆发。

疫苗是预防和控制口蹄疫采取的重要措施。口蹄疫免疫常用疫苗是油佐剂灭活疫 苗。该苗的生产采用的是病毒接种细胞、组织培养物，病毒增殖后，收获培养物，加化 学灭活剂(如二乙烯亚胺，BEI)使病毒失去感染性，与矿物油佐剂混合乳化制成疫苗。

天然免疫应答不仅是机体抵抗病毒和其他病原侵染的第一道防线，也是启动获得性 免疫应答的前提。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是近年来发现的在宿主抗 病原微生物的免疫应答中起重要作用的细胞表面受体分子(Medzhitov R， Preston-Hurlburt P.Janeway CA Jr.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals  activation of adaptive immunity.Nature 1997；388：394-397)。迄今为止，在哺乳动物中已 发现有10～15种TLR及其相应的配体或激动剂。TLRs广泛表达在各种免疫细胞，尤其是 先天免疫细胞的表面，如巨噬细胞和树突状细胞等，主要介导细胞免疫。

TLRs通过识别病原微生物及其特殊结构(TLRs激动剂一般是这种结构的类似物)， 介导宿主相关细胞因子的分泌和天然免疫应答的产生。TLR3识别具有双链RNA的病毒 感染，而单链RNA病毒在复制时能产生双链RNA，也能通过TLRs识别。病毒单链RNA 的相应识别受体是TLR7和TLR8。TLR9是识别带有CpG DNA病毒的受体。一些TLRs 激动剂，聚肌胞(polyI：C)是TLR3的激动剂(Kumar H，Kawai T，Akira S.Pathogen  recognition in the innate immune response，Biochem J.2009，420(1)：1-16)。Resquimod (R-848)是TLR7和TLR8的激动剂(Gibson SJ，Lindh JM，Riter TR，Gleason RM，Rogers LM， Fuller AE，et al.Plasmacytoid dendritic cells produce cytokines and mature in response to the  TLR7agonists，imiquimod and resiquimod.Cell Immunol 2002；218(1-2)：74-86)。氢氧化 铝免疫佐剂的使用历史已有80多年，比油类佐剂更具有安全性和低反应性，已广泛应用 于人兽疫苗，主要是形成抗原储存和缓释效应，刺激的细胞免疫较弱(Iyer S，HogenEsch  H，Hem SL.Relationship between the degree of antigen adsorption to aluminum hydroxide  adjuvant in interstitial fluid and antibody production.Vaccine 2003；21：1219-1223)。欧洲在 2005年已经批准氢氧化铝吸附的LPS的类似物单磷酸酯A(MPL)作为乙肝疫苗的佐剂 (Ennio De Gregorio，Elaine Tritto and Rino Rappuoli Alum adjuvanticity：Unraveling a  century old mystery，Eur.J.Immunol.2008.38：2068-2071)。研究表明，氢氧化铝与CpG 或LPS的联合使用免疫效果要优于其单独使用(Vajdy，M.，Selby，M.，Medina-Selby，A.， Coit，D.，Hall，J.，Tandeske，L.，Chien，D.et al.，Hepatitis C virus polyprotein vaccine  formulations capable of inducing broad antibody and cellular immune responses.J.Gen. Virol.2006.87：2253-2262.Wack，A.，Baudner，B.C.，Hilbert，A.K.，Manini，I.，Nuti，S.， Tavarini，S.，Scheffczik，H.et al.，Combination adjuvants for the induction of potent， long-lasting antibody and T-cell responses to influenza vaccine in mice.Vaccine 2008.26： 552-561)，这是由于氢氧化铝引起Th2效应，而TLRs引起Th1效应(Nemazee，D.，Gavin， A.，Hoebe，K.and Beutler，B.，Immunology：Toll-like receptors and antibody responses. Nature 2006.441：E4；discussion E4)。由于目前的文献所用的抗原模型均为乙肝、丙肝 等人医病毒，用动物病毒做抗原模型少见报道。并且，氢氧化铝作为兽用病毒疫苗的佐 剂使用较少，这是因为矿物油佐剂的效果要好于氢氧化铝，但是从动物福利以及肉食品 质量的角度看，矿物油引起的疼痛、副反应、注射部位的结节等要远远大于氢氧化铝。 并且，氢氧化铝佐剂更容易注射。

因此，本研究准备联合使用2种不同的TLR激动剂，提高氢氧化铝的佐剂性，提高其 细胞免疫效果，降低油性佐剂所带来的不良反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种口蹄疫复合型氢氧化 铝佐剂的配方及其疫苗制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种口蹄疫疫苗新型复合氢氧化铝佐剂，含20mg/ml氢氧化铝胶体佐剂、200μg/ml 的免疫增强剂PolyI:C和200μg/ml的R848。

所述的口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：1、常规方法制备氢氧化铝胶体佐 剂；2、常规方法制备并灭活口蹄疫抗原；3、在氢氧化铝胶体佐剂中分别加入过滤灭 菌的免疫增强剂PolyI:C和R848，浓度均为200μg/ml，制得口蹄疫复合型氢氧化铝佐剂， 氢氧化铝胶体佐剂浓度为20mg/ml。4、将口蹄疫复合型氢氧化铝佐剂与口蹄疫抗原以 体积比1∶1混合，置于4℃保存3天～5天，每天上午、下午各振摇2次，每次半小时。

用本发明方法得到的疫苗免疫小鼠后，可检测到抗体和细胞水平类似或者优于油佐 剂。

附图说明

图1PolyI:C和R848作为免疫调节剂与氢氧化铝联合免疫小鼠的最佳剂量确定。 PolyI:C的注射剂量为0.2μg～400μg只，R848的注射剂量为0.1μg～200μg只，每个剂 量组有三只小鼠。小鼠在注射免疫增强剂后的24小时，72小时，7天，14天进行采血检测 细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF)的含量。 细胞因子的含量通过商品化ELISA试剂盒进行检测。所得到的数据均为几何平均值± 标准差。(a)不同时间、不同剂量的PolyI:C诱导的小鼠外周血中的IL-4的含量；(b) 不同时间、不同剂量的PolyI∶C诱导的小鼠外周血中的TNF的含量；(c)不同时间、 不同剂量的PolyI:C诱导的小鼠外周血中的IFN-γ的含量；(d)不同时间、不同剂量的 R848诱导的小鼠外周血中的IL-4的含量；(e)不同时间、不同剂量的R848诱导的小 鼠外周血中的TNF的含量；(f)不同时间、不同剂量的PolyI∶C诱导的小鼠外周血中 的TNF的含量

图2按不同配方免疫小鼠后产生的抗体效价在不同时间的动态变化。按照3天、7 天、14天、21天、28天和35天的时间共采血6次，ELISA试剂盒检测口蹄疫抗体效 价。数值为平均值±标准差。

图3免疫21天后小鼠脾淋巴细胞中CD8⁺T淋巴细胞检测结果；(a)F+206免疫 组中的CD3CD8⁺T淋巴细胞的门内细胞百分比(10.7％)；(b)F+A免疫组中的CD3CD8⁺T 淋巴细胞的门内细胞百分比(8.4％)；(c)F+A+P免疫组中的CD3CD8⁺T淋巴细胞的 门内细胞百分比(11.5％)；(d)F+A+R免疫组中的CD3CD8⁺T淋巴细胞的门内细胞百 分比(11.5％)；(e)F+A+P+R免疫组中的CD3CD8⁺T淋巴细胞的门内细胞百分比 (12.2％)。

图4免疫21天后小鼠脾淋巴细胞中CD4⁺T淋巴细胞检测结果；(a)F+206免 疫组中的CD3CD4⁺T淋巴细胞的门内细胞百分比(21.6％)；(b)F+A免疫组中的CD3CD4⁺T 淋巴细胞的门内细胞百分比(17.9％)；(c)F+A+P免疫组中的CD3CD4⁺T淋巴细胞的门 内细胞百分比(19.9％)；(d)F+A+R免疫组中的CD3CD4⁺T淋巴细胞的门内细胞百分比 (19.0％)；(e)F+A+P+R免疫组中的CD3CD4⁺T淋巴细胞的门内细胞百分比(21.2％)。

图5各免疫组的免疫35天的小鼠脾淋巴细胞进行口蹄疫抗原体外刺激产生的2种 细胞因子(IFNγ和IL-4)的含量。脾脏在无菌条件下分离研磨，利用红细胞裂解液裂解 红细胞。然后在25×16计数板上计数，制成5×106/mL浓度的单细胞悬液。各设三孔 重复，每孔加入200微升5106细胞，然后加入100微升口蹄疫抗原(3μg/ml)。数据 统计：取三孔的几何平均数±标准差；(a)体外刺激免疫小鼠脾淋巴细胞的IFN-γ含量； (b)体外刺激免疫小鼠脾淋巴细胞的IFN-γ含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、PolyI:C和R848作为免疫增强剂与氢氧化铝联合免疫小鼠的最佳剂量确定

选18-22g的BALB/c小鼠作为实验动物。在BALB/c小鼠(n＝12/组)左后肢肌注 200μl Al(OH)₃+PolyI:C (0.2，2，20，40，200或400μg)或200μl Al(OH)₃+R848(0.1，1，10，20，100或200μg)。随后在注射后的24小时，72小时，7天，14天，对 试验小鼠进行采血，分离血清，用商品化试剂盒检测IL-4，TNF，INF-γ，以确定最佳免 疫增强剂剂量。

为了选择最佳免疫剂量，我们设计了一系列不同浓度的PolyI:C和R848，以确定在 小鼠体内最佳的注射剂量(图1)。不同的细胞因子反应不同的免疫反应。我们选取了 IL-4，TNF，和INF-γ三个指标来衡量其免疫增强剂效应。注入小鼠体内的免疫增强剂的 含量范围为0.1μg-400μg不等。当PolyI:C含量为20μg/只时，IL-4，TNF，INF-γ在不同 时间内，产生的含量达到了最大值。当R848为1μg/只或100μg/只时，TNF和INF-γ 的含量相对较高；而当R848为20μg/只时，细胞因子IL-4的含量是最高的，综合考虑 这些数据以及成本因素，确定R-848的免疫最佳剂量也是20g/只。

二.比较几种不同配方的免疫效果

将BALB/c小鼠随机分成六组，每组12只。口蹄疫灭活抗原浓度为3μg/ml。每只口 蹄疫灭活抗原免疫剂量均为200μl。按照以下几组配方在小鼠后肢外侧肌肉进行肌肉注 射：(1)PBS、(2)F+206、(3)F+A、(4)F+A+P、(5)，F+A+R、(6)F+A+P+R(F代表口蹄疫灭活 抗原，A代表强氧化铝佐剂，206代表ISA206佐剂，P代表PolyI:C，R代表R848)。所有的 小鼠在免疫前进行采血，然后再进行免疫。在免疫后的3、7、14、21、28、35天采血。 外周血经过4000转离心10分钟，收集血清，并且储存于-20℃，直到进行ELISA检测相应 指标。

1.抗口蹄疫抗体效价。

通过ELISA方法进行检测。从图3中可以看出，F+A组和F+206组在抗体效价数 值上差异不大，F+206组的最高抗体效价是1:128，而F+A+P+R组在第14/21天的时候 产生了较高的(分别是1:256，1:512)抗体效价，说明这个组合相对其他组产生的抗体效 价更高、更早，2种免疫增强剂PolyI:C和R848在促进抗体产生中起到了很重要的作用。

2.用流式细胞仪检测CD8⁺T细胞与CD4⁺T淋巴细胞。

脾脏从处死的小鼠体内无菌分离后，制成单细胞悬液(10⁶～10⁷/mL)。在2ml离心 管中加入100微升淋巴细胞悬液，加入双标记单克隆抗体CD3(ALEXA 488)/CD4(ALEXA647)或CD3(ALEXA488)/CD8(ALEXA 647)，室温避光20分钟，然后3000转/分离心5min，弃掉上清。每管加入2ml 的PBS缓冲液洗细胞，3000转/分，离心5min，弃掉上清，重复两次。最后每管加入 0.5ml的PBS悬浮细胞，四小时内上机检测。

流式细胞仪分析CD3CD8⁺T淋巴细胞在脾脏淋巴细胞中的组成比例结果(图3和图 4)显示，F+A+P+R组中其组成比例最高，达到12.2％，矿物油206的CD3CD8+T淋巴 细胞的组成比例是10.7％；F+A+P和F+A+R的比例分别是11.5％。而F+A组中，比例 最低，只有8.4％。免疫后21天小鼠脾脏中CD3CD4+T淋巴细胞检测结果显示，F+206 组中CD4⁺T淋巴细胞所占比例最高，达到21.6％，而F+A+R+P为21.2％，二者接近， 说明该组合与矿物油佐剂的效果接近，并且较F+A+R组或F+A+P组中比例高。说明 PolyI:C和R848联合作用在促进T细胞分化中比单独作用效果好。

3.体外刺激脾淋巴细胞测细胞因子产生情况

分离所有免疫35天的小鼠脾淋巴细胞，制成单细胞悬液。脾淋巴细胞(5×10⁶/ml) 在96孔板上培养，每孔0.1mL。然后用灭活的口蹄疫抗原100μL刺激免疫小鼠的脾淋 巴细胞，然后在37℃、含5％二氧化碳培养箱中孵育48h，最后通过离心96孔培养板， 细胞聚集在孔底部，收集上清液，用ELISA方法检测细胞因子(IL-4、IFN-γ)产生情 况。

免疫小鼠脾淋巴细胞体外刺激试验结果(图5)显示，针对特异性抗原分泌的IFN- γ，F+206组的数值最高，为489.16，F+A+R+P组的数值是462.62，二者数值接近。 而F+A组的数值为98.67，F+A+P的数值为144.15，F+A+R的数值是232.5。说明 复合型氢氧化铝佐剂比单纯使用某一种免疫增强剂的效果要好。IL-4产生量各组差异 不明显(P＞0.05)。其中F+206组的数值最高，为75.61，F+A+R+P组的数值是65.83， F+A组的数值为65.02，F+A+P的数值为60.95，F+A+R的数值是63.93。综合上述 数据，说明使用新型氢氧化铝组合佐剂(A+R+P)与矿物油206佐剂的效果接近。