法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-09-03
授权
授权
2013-01-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C11B3/00 申请日:20101027
实质审查的生效
2012-11-28
公开
公开
本发明涉及编码具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的多 肽的新DNA序列。本发明进一步涉及到新的具有磷脂酶活性但基本上 不具有脂肪酶活性的多肽。这些多肽是具有低分子量、高热稳定性和 耐高温性的酸性磷脂酶。另外，这些多肽在宽的pH值范围内有活性。 而且，本发明还涉及这些磷脂酶用于还原含磷化合物的用途，例如在 生产食用油中，以及这些磷脂酶用作面包改良剂、动物饲料添加剂以 及纺织品原材料加工过程的添加剂等的用途。
初榨的植物油（crude vegetable oil）含有的相关物质（例如游离 脂肪酸、磷脂、重金属和着色剂等）由于在储存过程中脂质的水解和 氧化修饰而会影响油的质量和保质期，并且使油的进一步加工复杂化。 所以，必须在提取初榨的植物油后对其进行精炼以除去杂质。在生产 高质量食用油的过程中，精炼过程包括脱胶、漂白和除臭步骤。
精炼油过程的第一步是脱胶。在脱胶过程中，除去对油的口味起 副作用并干扰油精制过程后续步骤的胶粘物质（主要是磷脂）。
由于磷含量是脱胶程度的一个指征，所得到的脱胶油的质量可以 通过确定残留的磷含量来评估。对于精制过程的后续步骤，脱胶油中 残留的磷含量需要低于10ppm。
磷脂是复杂的含磷脂质。磷脂（例如磷脂酰胆碱或卵磷脂）是由 在sn-1和sn-2位点被脂肪酸酯化以及在sn-3位点被酯结合的磷酸基 团酯化的丙三醇结构构成。例如，磷酸基团本身可以被伯醇基团等酯 化。在sn-1和sn-2位点，天然的磷脂含有不同的脂肪酸链，对植物而 言脂肪酸链主要是多不饱和酰基链。有两种类型的磷脂：能水合的和 不能水合的。为除去磷脂，需要应用不同的方法。
最简单的方法是水脱胶。在这个过程中，能水合的磷脂可以在水 的帮助下被洗掉并因此被从油中移除。依据初榨油的类型和质量，在 这一过程后脱胶油仍然含有80至200ppm的磷。
在酸脱胶方法中，用酸处理油。酸将不能水合的磷脂转变成能水 合的磷脂。能水合的磷脂成为油不溶性的。通过离心或过滤的方式将 所形成的油不溶性的浆体从油中移除。这一过程后，油中残余的磷含 量是大约25至100ppm。
酶促脱胶提供了一种用于从食用油中缓和地去除磷脂的高效的、 具有成本效益的且环保的方法。
磷脂酶是切割磷脂的酶，并且依据其在磷脂上的酶切位点分为酰 基水解酶（磷脂酶A1、A2和B）和磷酸二酯酶（磷脂酶C和D）。 磷脂酶A1（EC 3.1.1.32）水解磷脂分子sn-1位点处的脂肪酸，磷脂 酶A2（EC 3.1.1.4）特异性地切割磷脂中的sn-2酯键。作为反应产物， 形成溶血磷脂和游离脂肪酸。磷脂酶B（EC 3.1.1.5）非特异性地在sn-1 和sn-2位点处切割脂肪酸。磷脂酶C（EC 3.1.4.10）水解丙三醇和磷 酸基团之间的磷酸酯键形成磷酸单酯和二酰基甘油。磷脂酶D（EC 3.1.4.4）催化末端磷酸二酯键的水解形成切割产物磷脂酸和胆碱。
从牛和猪的胰腺以及从蜜蜂或几种蛇类的毒素中提取磷脂酶A2 是已知的。还可以从微生物（例如细菌和真菌）中提取磷脂酶，并且 可以利用重组技术产生足够的产量。
在专利EP 0 513 709中，第一次提出了有效的酶促脱胶方法。这 一新的方法第一次使用磷脂酶A2切割磷脂sn-2位点处的脂肪酸。用 大豆油和油菜籽油测试该方法时，磷含量为72至110ppm。反应体系 中含有相对于油重量的最高达5重量%(w/w)的水，并且在40℃或 60℃下，在pH值为5.0至5.5的条件下孵育最长达5小时。所产生 的溶血磷脂可以通过离心的方式从油中移除。这一过程之后，脱胶油 中残留的磷含量少于5ppm。
在脱胶过程中，将油与确定量的水混合。然后，使含有酶的水相 与油相混合使酶产生作用。此方式中水的含量应尽可能少。使用大量 的水会导致能耗和处理成本的增加。所以，在这一方面，用低含水量 (2%)的酶促脱胶方法是有利的。
在US2007/134777中提到，用磷脂酶A1进行的植物油的酶促脱胶 是在pH值4.0和5.0之间进行。实施这一方法的最佳pH值在4.5和5.0 之间。在这个pH值范围内，所释放的钙和/或镁离子可能会跟反应缓 冲液中的其它化学物质（阴离子）结合以形成难溶性的盐，所述盐沉 积在反应器的表面，并因而污染所用装置。移除这些污渍并清理所用 装置是费力的。为减少对装置内部的污染，反应优选在约4的pH值 下进行。但是，如果反应的pH值进一步降低的话，酶活性会降低或 功能性失活。
EP 0 904 357中描述了已发现黑曲霉（Aspergillus niger）中的磷脂 酶A能够用于食用油的脱胶。
WO2008/040466描述了烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中的一种 分子量为65kDa的磷脂酶可用于在最高达65℃的温度下含水量为 5%的食用油的脱胶。
EP 1 788 080描述了蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）中的磷脂酶 C用于60℃下含水量为15%（基于油计）的且持续时间为6小时的 油脱胶。在这一过程后，残留的磷含量小于5ppm。
WO2008/094847描述了在磷脂酶A1或A2与磷脂酶C的共同作 用下油脱胶过程的反应时间可以减少至30分钟。
磷脂酶还可以在食品工业和动物饲养工业中有多种用途，例如用 于制备生面团、用于制备烘焙产品和用于提高奶酪产量等。因此，仍 然需要在技术上通用的磷脂酶。
在生物技术中，磷脂酶用作磷脂提取中的生物催化剂。磷脂是极 性脂质，并且由于它们的亲脂性和亲水性结构特征而用作乳化剂。磷 脂酶应用的实例是：用于生产经修饰的卵磷脂，在酱汁、蛋黄酱和色 拉酱生产中用作食品乳化剂，用于生产即食粉末（例如奶粉、可可粉 和咖啡粉），在生产巧克力时用作助流剂和用作食品添加剂。在制药和 化妆品工业中，磷脂和溶血磷脂用于生产乳霜、乳液、凝胶和脂质体 制剂。
卵磷脂在生产清漆、颜料、磁带、特殊用纸、皮革和纺织品时也 是需要的。磷脂酶还可以在纺织工业中用于“生物精炼”以便在实施 后续加工步骤（例如染色）之前清除植物纤维。磷脂酶与其它酶的混 合物也可以用于此处。所述其它酶可以选自纤维素酶、半纤维素酶、 果胶酶、蛋白酶和氧化还原酶。
因此，现有技术中仍然需要对具有尽可能宽的且优化的应用领域 的磷脂酶。
所以，本发明的目的是提供具有改善的磷脂酶活性的蛋白和多肽。 具体地，所述新的磷脂酶在技术过程中不具有相关的脂肪酶活性。具 体地，所述具有磷脂酶活性的蛋白能够在一个大的pH范围内有活性 并且是高度的温度耐受的。
另外，具有磷脂酶活性蛋白的生产应是简单的、有成本效益的和 可商业化的。此外，本发明还提供了适合生产具有磷脂酶活性的蛋白 的表达构建体。
上述目标可以通过编码具有磷脂酶活性但基本上无脂肪酶活性 的多肽的DNA序列实现，其特征在于，所述DNA序列选自：a)含有 SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA序列；b)含有SEQ ID NO:1 所示编码序列的DNA序列；c)编码SEQ ID NO:2所示蛋白序列的 DNA序列；d)编码具有图7所示限制性内切酶图谱的质粒 pPL3949-Topo2.5的DNA序列，所述质粒保藏号为DSM 22741；e)能 够在严格条件下与a)、b)、c)或d)的DNA序列之一杂交的DNA序列； f)基于遗传密码简并性而与a)、b)、c)、d)或e)中DNA序列相关的 DNA序列；g)a)至f)中序列的互补链。
本发明进一步涉及一种具有磷脂酶活性但基本上无脂肪酶活性的多 肽，选自：a)一种由上述DNA序列的编码部分编码的多肽；b)一种具 有SEQ ID NO:2所示序列或由该序列获得的序列的多肽，可以通过对一 个或多个氨基酸的置换、插入、缺失得到；c)具有与SEQ ID NO:2中 第1至299个氨基酸有至少83%同一性的序列的多肽；d)由能够在严格 条件下与下述序列杂交的核酸序列编码的多肽：(i)SEQ ID NO:1的核苷 酸55至1106；(ii)SEQ ID NO:1的核苷酸55至1106中含有的cDNA序 列；(iii)由至少100个核苷酸组成的(i)或(ii)的部分序列；或(iv)(i)、(ii) 或(iii)的互补链；e)具有SEQ ID NO:2的多肽的变体，其含有对一个或 多个氨基酸的置换、缺失和/或插入；f)a)至e)中氨基酸序列的等位基 因变体。
另外，本发明涉及能够表达本发明的具有磷脂酶活性的多肽的表 达构建体或宿主。而且，本发明还涉及相应的表达质粒和载体。另外， 本发明涉及使用本发明的多肽进行植物油脱胶的方法，以及本发明的 多肽在食品技术领域（特别是制备生面团、烘焙食品或乳制品）或者 在动物营养中和在纺织品原材料加工（又称为精炼或生物精炼）中的 用途。
依据另一个实施方案，本发明涉及一种具有磷脂酶活性但基本上 不具有脂肪酶活性的多肽，其特征在于，其分子量范围为28至30kDa 并且优选地约为28.6kDa，具有广泛的最佳pH和耐高温性，并且其 可以从曲霉属生物体中分离。
本文中的耐高温性是指在具有2%的低含水率的油脱胶方法的条 件下，于60℃下6小时后，所述酶的活性仍保留在工业上可利用的 程度。如果其产生的油中残留的磷含量在技术上是可以忽略的，就说 明所述酶的活性保留在工业上可利用的程度。优选地，在酶促脱胶的 油中残留的磷含量低于10ppm，更优选低于5ppm。
本发明人出乎意料地发现，编码具有磷脂酶活性但基本上没有脂 肪酶活性并且具有低分子量和耐高温性的多肽的DNA序列可以从烟 曲霉属的株系中分离。所述磷脂酶是一种来自于丝状真菌的酸性磷脂 酶，计算的分子量约为28.6kDa，其能够水解来自卵磷脂的两种脂肪 酸中的至少一种。
与现有技术中已知的具有磷脂酶活性的多肽相比，本发明的磷脂 酶具有耐高温性(在60℃下)，因此还可以有利地用于具有2%的低 含水量(相对于油)且pH值为4.0的酶促脱胶过程中。这具有特殊的 经济效益，因为这样可以不必在脱胶过程中先将油的温度降低以使得 能够在进行酶促脱胶的同时酶不会失活，随后再升高油的温度以降低 进行分离油相与水相的离心步骤时油的粘度。本发明的具有磷脂酶活 性的多肽的温度耐受性对食品技术和动物营养领域中和纺织过程中 的其它应用也分别是有利的。
现有技术中已知的磷脂酶不包含在本发明的范围内。
所以，特别有利的是本发明中来自烟曲霉的磷脂酶能够在一个3 至5的大pH值范围内具有活性或者优选在这个范围内显示出广谱活 性。所以，本发明的磷脂酶不只有基本不具有脂肪酶活性这一优势。 它们还在一个大pH范围内具有酶活性，并因此可以在一个大pH范 围内应用。
迄今为止，来自烟曲霉的具有磷脂酶活性的酶(磷脂酶A、B、C 或D)已经在多篇出版物中被提及(Birch et al.,Comparison of extracellular phospholipase activities in clinical and environmental Aspergillus fumigatus isolates,2004,Med Mycol 42(1):81-86; Rementeria et al.，Genes and molecules involved in Aspergillus fumigatus virulence,2005,Rev Iberoam Micol 22(1):1-23)，但并未对 其进行精确表征。按照“概念性的翻译”（conceptual translation）， 从烟曲霉的基因组序列(Nierman et al.,Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus, 2005,Nature,438(7071):1151-6)中推导出几种假定的磷脂酶(A、B、 C、D)和溶血磷脂酶。因此，描述了例如一种具有241个氨基酸的假 定的磷脂酶A和三个具有高分子量的溶血磷脂酶Plb1、Plb2和Plb3。 另外，数据库示出了一种小的假定的细胞外脂肪酶，其含有299个氨 基酸，计算的分子量约为28.5kDa(GenBank EAL86100)；以及含有 409至587个氨基酸的多种脂肪酶。
Shen等人(Characterisation and expression of phospholipase B from the opportunistic fungus Aspergillus fumigatus,2004,FEMS Microbol Lett 239(1):87-93)成功从烟曲霉中克隆和表征了3个磷脂 酶B基因。分泌性蛋白AfPL1和AfPL3的分子量约为68kDa，其中 AfPL1有633个氨基酸，AfPL3有630个氨基酸。蛋白AfPL2是一 种细胞溶质蛋白，含有588个氨基酸，分子量约为63kDa。
另外，还从烟曲霉RH3949中分离出一种具有633个氨基酸的磷 脂酶(WO2008/040466)和一种具有611个氨基酸的溶血磷脂酶 (WO2008/040465)。
此外，从烟曲霉RH3949基因组中发现一个具有28至30kDa的 小分子量的酸性磷脂酶(pl 4.1)。
在这个“小”磷脂酶的蛋白测序过程中，N-末端前16个氨基酸与来 自烟曲霉Af293含有299个氨基酸的假定细胞外脂肪酶(GenBank EAL86100)的N-末端有93%的同一性。但是，来自RH3949的“小磷脂 酶”成熟序列(AA 30-299)与所述假定的细胞外脂肪酶序列仅有约82%的 同一性。这是特别意外的，因为已发现在另一个烟曲霉株系(A1163)基因 组中的对应位点处的序列与来自Af293的假定脂肪酶(GenBank EDP1054)有显著更高的同一性(Fedorova et al.,Genomic Islands in the Pathogenic Filamentous Fungus Aspergillus fumigatus,2008,PloS Genet.4.e1000046)。
与之相比，来自烟曲霉Af293(具有241个氨基酸的磷脂酶A， GenBank EAL85761)和烟曲霉RH3949(具有pl4.1的磷脂酶)的两个 N-末端磷脂酶序列之间没有相似性。
所以，本发明的磷脂酶与已知的来自烟曲霉的磷脂酶以及与来自 注释为密切相关的烟曲霉株系（如Af293）的磷脂酶的序列不同。
本发明使用的几条寡核苷酸引物是根据假定的细胞外脂肪酶 (GenBank EAL86100)的DNA序列数据(GenBank AAHF01000011)中 派生并合成的。
本发明人意外地发现，本发明中的DNA序列可以用来自Af293株系 的基因组序列的引物从曲霉株系RH3949中分离（参见，实施例4）。这 是意想不到的，因为用于扩增的RH3949株系（环境分离株）与Af293 （临床分离株）有表型差异，并且因此极可能还有基因型（序列）差异。 因此，用其它具有邻近Af293株系基因组DNA中N2-3948和Apal-3949 的结合位点的引物对从RH3949中扩增磷脂酶基因是不可能的。
基因扩增是通过对烟曲霉RH3949基因组DNA的聚合酶链式反 应(PCR)实施的。
本发明磷脂酶的耐温性和宽的最优pH值范围是出乎意料的，并 且是基于现有技术中记载的磷脂酶无法想到的。因为，现有技术中还 没有记载或仅仅是暗示过来自丝状真菌的天然磷脂酶具有这些性质。
将本发明中SEQ ID NO:2所示的磷脂酶序列与现有技术的磷脂 酶序列进行比较。发现该氨基酸序列与来自其他曲霉株系的已知氨基 酸序列有部分的相似性，例如与来自塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）的脂肪酶(WO98/45453)或来自臭曲霉（Aspergillus foetidus）的溶血磷脂酶(EP0808903)有60%的相似性；与来自黑曲霉 的磷脂酶(WO03/097825、WO98/31790)有59%的相似性。
序列SEQ ID NO:2与来自烟曲霉Af293的假定的细胞外脂肪酶 序列(GenBank EAL86100)(Nierman et al.,Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus, 2005,Nature,438(7071):1151-6)有最高82%的同一性。
本发明人出乎意料地发现，在对食用油进行酶促脱胶的条件下，本 发明的从烟曲霉RH3949中分离的磷脂酶没有显示出任何与此过程相关 的脂肪酶活性。另外，与迄今为止已知的来自其它曲霉株系的磷脂酶相 比，该酶具有明显较宽的最优pH值范围和耐高温性。因此，本发明中 的酶可以非常有利地用于食用油的酶促脱胶过程，因为它不水解油中的 任何三酸甘油酯键或其不显著的部分。
另外，本发明还涉及具有与SEQ ID NO:2的序列有至少83%同 一性的序列且具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的多肽。优 选地，本发明涉及具有与SEQ ID NO:2的氨基酸1至299有至少83% 同一性的序列且具有磷脂酶活性的多肽。优选地，在相应的序列具有 磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的情况下，与SEQ ID NO:2 的氨基酸1至299的同一性程度为至少90%，更优选至少95%，甚 至更优选至少97%以及尤其优选至少98%。
本发明的具有磷脂酶活性的多肽不具有任何明显的脂肪酶活性 或基本上不具有脂肪酶活性。本发明中的多肽基本不具有任何对油脱 胶的工业过程不利的脂肪酶活性，即，本发明的多肽基本上不对待脱 胶油中的可脂解性切割的化合物显示出任何活性。这意味着在食用油 的酶促脱胶的条件下，本发明的磷脂酶不具有任何与此过程相关的脂 肪酶活性。从技术上来讲，这意味着本发明中具有磷脂酶活性的多肽 对作为脂肪酶底物的棕榈酸对硝基苯酯的水解程度不明显和/或不能 检测。对于本发明中具有磷脂酶活性的多肽，磷脂酶活性与脂肪酶活 性的比例优选>1000:1，更优选为5000:1至10000:1，甚至更优选为 7000:1，最优选为7500:1。
序列同一性的程度优选地是通过以下方式确定的：确定较短序列 中的残基数，所述较短序列被包括比较中并在其它序列中具有“相应 的”的对应部分。对于本发明来说，同一性优选地是通过使用普通算 法的常规方式确定。依据本发明，只有相应的成熟蛋白的cDNA或氨 基酸用于比较。类似地，依据本发明，优选地通过已知的计算程序将 相同的序列对应部分确定为同源序列。这种程序的一个实例是Clone Manager Suite程序，它包括Align Plus程序部分并且由Scientific & Educational Software,Durham,NC,U.S.A发行。因此，上述的两个 DNA序列或氨基酸序列的比较是在保留默认值的情况下依据 FastScan-MaxScore方法或Needleman-Wunsch方法选择局部比对 来实施的。具体地，本发明使用具有“Compare Two Sequences/Local Fast Scan-Max Score/Compare DNA sequences”或用于氨基酸的 “Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as Amino Acids”功能的程序版本“Clone Manager 7 Align Plus 5”来计算同一 性。应用可从下述来源获得的算法：Hirschberg,D.S.1975，A linear space algorithm for computing maximal common subsequences. Commun Assoc Comput Mach 18:341-343；Myers,E.W.and W. Miller，1988，Optimal alignments in linear space，CABIOS 4:1,11-17； Chao,K-M,W.R.Pearson and W.Miller，1992，Aligning two sequences within a specified diagonal band，CABIOS 8:5,481-487。
本发明还涉及上述具有磷脂酶活性的多肽的插入分子和/或缺失 分子。因此，本发明中具有磷脂酶活性的经修饰的多肽可以通过在 N-末端和/或C-末端加入另外的序列而延长，并且由此得到的氨基酸 序列仍然必须具有磷脂酶活性且基本上不具有脂肪酶活性。由此产生 具有更多有利性质的杂交分子。例如，悬浮蛋白或它们的天然前体形 式可以被加入到大量分泌的蛋白中，这进一步增加了分泌效率。另外， 可以加入其它酶的活性序列片段以产生具有多种特异性的酶。此外， 可以加入极性或非极性的序列从而特异性地影响由此获得的酶的溶 解性或膜流动性。
根据本发明，具有磷脂酶活性的多肽的序列片段还可以被缺失， 但保留磷脂酶活性且基本上不具有脂肪酶活性。突变、延伸和缩短均 可以通过本身已知的方式实施，并借助于现有技术中公知的方法。缩 短的多肽与全长多肽相比通常具有增加的分泌峰值（secretion height）。与全长多肽相比，它们也可能显示出较高的热稳定性，因 为它们只包含“压缩的核心”（compressed core）。
这种变体的产生方法通常是现有技术中已知的。例如，所述多肽 的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变产生。用于诱变和改变核 苷酸序列的方法是现有技术中公知的（参见，例如Tomic et al.NAR, 18:1656(1990),Giebel and Sprtiz NAR,18:4947(1990)）。
对目的蛋白的生物学活性没有不利影响的适宜氨基酸置换的细节记 载于Dayhoff et al.,Atlas of Protein Sequence and Structure,Natl.Biomed. Res.Found.,Washington,D.C.(1978)中。优选保守性置换，例如将一个 氨基酸用另一个具有类似性质的氨基酸置换。这些置换可以分为两个大 组，总共四个分组，并且每个分组中的置换均称为保守性置换，这优选 地不影响所述蛋白的活性或折叠。
表述“蛋白”、“肽”和“多肽”基本上可以互换使用。有磷脂 酶活性的多肽或酶或者磷脂酶是指能够催化从磷脂（例如卵磷脂）中 释放脂肪酸的酶。磷脂酶活性可以通过使用任何本身已知的测量方法 来确定，所述方法中使用这些底物中的一种。
对于本发明中的多肽，表述“磷脂酶”或磷脂酶A是指具有磷脂 酶A1以及磷脂酶A2活性的酶。因此，磷脂酶A1或A2被分别按照 标准的酶EC分类命名为EC 3.1.1.32或3.1.1.4。
磷脂酶B或溶血磷脂酶是依据标准酶EC分类法命名为EC
3.1.1.5的多肽。
本发明还涉及编码具有磷脂酶活性的多肽的DNA序列，包括对 SEQ ID NO:1所示序列的突变、修饰或变异。另外，本发明还涉及 与上述序列在不严格或严格条件下杂交的序列。下述条件被认为是严 格的：在硫酸葡聚糖溶液中于65℃下杂交18小时(GenescreenPlus, DuPont)，随后于65℃下分别用下述溶液洗滤膜30分钟，首先用6x SSC洗、然后2x SSC洗两次、2x SSC洗两次、0.1%SDS洗、最后 用0.2x SSC洗(转膜和检测方法，Amersham)。
另外，本发明还涉及由遗传密码的简并性形成的与上述序列相关的 DNA序列，以及其等位基因变体。因此，遗传密码的简并性可能是由于 天然的简并性或特别选择的密码子选择。天然产生的等位基因变体可以 通过公知的分子生物学技术（例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术） 进行鉴定。
本发明还涉及利用重组技术生产具有磷脂酶活性的多肽的方法， 包括在能够促进所述酶的表达和随后对所述酶的提取的条件下，培养 含有本发明DNA序列的重组原核和/或真核宿主细胞。本发明进一步 涉及本发明中的多核苷酸序列用于制备探针的用途，所述探针用于检 测其它生物体中编码相应酶的相似序列或用于转化宿主细胞。
本发明中编码多肽的DNA序列可以用于转化任何宿主细胞，例 如真菌细胞、酵母细胞、细菌细胞、植物细胞或动物细胞。用这种方 式转化的细胞的特征在于分泌本发明的磷脂酶。如此产生的磷脂酶使 得能够有效地水解磷脂中的脂肪酸。
本发明还涉及表达盒，其可用于向宿主细胞引入编码本发明中磷脂 酶的DNA序列或开放读码框。它们优选地包含一个与所述开放读码框相 连的转录起始区域。这种表达盒可以包含多个限制性酶切位点用于插入 所述开放读码框和/或其它的DNA，例如转录调节子区域和/或可选择的 标记基因。所述转录盒在5’→3’转录方向上含有在微生物细胞中有功能 的转录起始区域和翻译起始区域、目的DNA序列以及转录终止区域和翻 译终止区域。所述终止区域可以是与所述转录起始区域天然对应的、可 以是与所述目的DNA序列天然对应的或者可以是来自其它来源。
所述表述“开放读码框”(ORF)是指编码序列中翻译起始密码子和 翻译终止密码子之间序列所编码的氨基酸序列。所述表述“起始密码子” 和“终止密码子”是指编码序列中确定蛋白合成（mRNA翻译）链起始 和链终止的一个由三个相邻核苷酸组成的单位（密码子）。
与核酸相关的“可操作连接”是指化合物作为同一核酸分子的部 分，并且相对于启动子的转录起始点处于合适的位置和方向。与启动 子功能性连接的DNA处于启动子的转录起始调控之下。编码序列可 以与调节子序列以同义方向或反义方向可操作地连接。对于多肽，可 操作连接是指所述连接作为同一多肽的一部分，也就是通过肽键。
本发明中可以应用任何启动子。启动子通常是指编码序列上游(5’) 的核苷酸序列，并通过提供正确转录必需的对RNA聚合酶和其它因子的 识别而控制编码序列的表达。本发明中所用的启动子可以包括最小启动 子，也就是从TATA盒起始的一段短的DNA序列和其它确定转录起始位 点的序列，所述转录起始位点连接调节子元件进行表达控制。
本发明中所用的启动子还可以包括一种包含一个最小启动子和 调节子元件并可以控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。 这种类型的启动子序列由位于上游的近侧和远侧元件构成，其中最后 命名的元件通常是增强子。所以，增强子是可以刺激启动子活性的 DNA序列，并且可以是启动子固有的元件或者是为提高启动子的表 达强度或组织特异性而插入的异源元件。增强子在两个方向都可以起 作用，并且甚至位于启动子的上游或下游时都可以起作用。增强子和 其他位于上游的启动子元件均会序列特异性地与介导他们作用的 DNA结合蛋白结合。启动子可以全部来自天然基因或者可以由来自 不同自然存在的启动子的元件组成，或者甚至可以由合成的DNA片 段组成。启动子还可以含有参与蛋白因子结合的DNA序列，所述蛋 白因子能够控制转录起始效率，作为对生理或发育相关的状况的反 应。
在没有上游的激活时，启动子元件（特别是失活的或者启动子活 性会显著降低的TATA元件）称为最小启动子或核心启动子。在一 个或多个合适的转录因子存在时，最小启动子的功能是使转录得以进 行。因此，最小启动子或核心启动子仅仅包含转录起始所必须的所有 基础元件，例如TATA盒和/或起始因子。
本发明还涉及含有本发明中DNA序列的载体构建体。这些载体 构建体可以包含双链或单链、线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬 菌体或其它载体，它们任选地本身是可传播或可移动的并且可以通过 以下方式转化原核或真核宿主：整合到细胞基因组中或以额外染色体 的形式存在(例如具有复制起始点的自主复制质粒)。
待用于转化细胞的载体、质粒、粘粒、人工酵母染色体(YAC)、 人工细菌染色体(BAC)和DNA片段通常包含本发明中编码磷脂酶的 DNA以及其它将被引入至细胞中的DNA，例如cDNA、一个或多个 基因。如果需要，这些DNA构建体还可以包括其它的结构，例如启 动子、增强子、聚合接头（polylinker）或调节子基因。选择用于转 化细胞的DNA片段或基因可方便地编码在所获得的转化（重组）细 胞中表达的蛋白，这使得所述转化细胞具有可筛选或可选择的特性和 /或使所述转化细胞具有改良的表型。
通过上述公开内容和普通的专业知识，本发明中可使用的载体的 构建是本领域技术人员已知的(参见，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.(1989)))。
本发明中的表达盒可以包含一个或几个限制性酶切位点，以将编 码磷脂酶的多核苷酸置于调节子序列的控制之下。所述表达盒还可以 包含一个与所述多核苷酸可操作连接的终止信号以及所述多核苷酸 正确翻译所需要的调节子序列。含有本发明的多核苷酸的表达盒可以 是嵌合的，也就是说其至少一个组分相对于其至少另一个组分是异源 的。所述表达盒中多核苷酸的表达可以受组成型启动子、诱导型启动 子、受调节的启动子、病毒启动子或合成启动子的控制。
所述载体还可以包括调节子元件例如启动子，或者可操控本发明 中的DNA序列以使得它们包含这种元件。可以使用的合适启动子元 件是现有技术中已知的，例如用于里氏木霉（Trichoderma reesei） 的cbh1启动子或cbh2启动子，用于米曲霉（Aspergillus oryzae）的 amy启动子，用于黑曲霉的xyl启动子、glaA启动子、alcA启动子、 aphA启动子、tpiA启动子、gpdA启动子、sucl启动子和pkiA启动 子。可用于酵母中表达的合适的启动子是现有技术中已知的，例如 pho5启动子或gap启动子可用于在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达，如aoxl启动子、 fmd启动子或mox启动子用于甲醇酵母（H.polymorpha）。
除本发明中的DNA以外，适合于导入细胞的DNA还可以包括从 任何来源衍生或分离的DNA。一个衍生DNA的实例是从给定生物体 中被鉴定为有用的片段，然后通过化学方法合成为基本上纯净的形式 的DNA序列。这种DNA的一个实例是一个合适的DNA序列，所述 DNA序列是例如使用限制性核酸内切酶得到的，从而使得其能根据 本发明被进一步操作，例如扩增。例如使用来自构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的用作标记基因的amdS基因及其调节序列，以及聚合接 头。
这种DNA通常是指重组DNA。因此，合适的DNA包括完全合 成的DNA、半合成的DNA、从生物来源分离的DNA以及来自导入 RNA的DNA。一般来说，导入的DNA不是受体DNA基因型的起始 部分，但是本发明中的基因还可以从给定基因型中分离，并且可任选 地被改变，和随后将所述基因的多个拷贝导入相同的基因型，例如增 加给定基因产物的产量。
所导入的DNA包括但不限于，来自例如细菌、酵母、真菌或病 毒基因的DNA。所导入DNA可以包括修饰的或合成的基因、部分基 因或嵌合基因，包括相同或不同基因型的基因。这还可以包括例如质 粒pUC18、pUC19的DNA。
本发明中使用的用于转化的DNA可以是环状的或线状的、双链 的或单链的。一般来说，DNA是嵌合体DNA，例如质粒DNA，所述 质粒还包括编码区，所述编码区的侧翼连接有调节子序列并且可支持 重组DNA在所述转化的细胞中表达。例如，DNA自身可以包含一个 在细胞中有活性的、来自于与该细胞不同的来源的启动子或者由其组 成，或者也可以使用一个已经存在于该细胞（即转化的靶细胞）中的 启动子。
一般而言，所导入的DNA相对较小，小于大约30kb，从而使其 对物理的、化学的或酶降解的敏感性尽可能小，所述敏感性随着DNA 的增大而增加。
合适的表达载体的选择依据宿主细胞而定。酵母表达载体或真菌表 达载体可以包含一个复制起点、一个合适的启动子和增强子以及任何必 须的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体位点和剪接受体位点、 转录终止序列和非转录的5’-侧翼序列。
适合的宿主细胞的实施例是：曲霉属（Aspergillus）、根霉属 （Rhizopus）、木霉属（Trichoderma）、链孢霉属（Neurospora）、 毛霉属（Mucor）、青霉属（Penicillium）等的真菌细胞，例如克鲁 维酵母属（Kluyveromyces）、酵母属（Saccharomyces）、裂殖酵母 属（Schizosaccharomyces）、毛孢子菌属（Trichosporon）、许旺酵母 属（Schwanniomyces）、汉森(氏)酵母属（Hansenula）、毕赤酵母属 （Pichia）等的酵母。适合的宿主系统是例如真菌，如曲霉属，例如 黑曲霉(ATCC 9142)或无花果曲霉(Aspergillus ficuum，NRLL 3135)，或木霉属(例如里氏木霉QM6a)；以及酵母，例如酵母属， 例如酿酒酵母或毕赤酵母属，例如毕赤酵母，或汉森(氏)酵母属，例 如甲醇酵母(DSMZ 70277)。这些微生物可以从已建立的保藏中心获 得，例如美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection, ATCC)、皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures,CBS)或德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)或 任何其它的保藏中心。
所述表达盒按照5’-3’转录方向可以包括：本发明的多核苷酸的转 录起始区域和翻译起始区域以及在体内或体外有功能的转录区域和 终止区域。所述终止区域相对于所述转录起始区域可以是天然的，或 者相对于所述多核苷酸是天然的或其它来源的。调节子序列可以位于 编码序列的上游(5’非编码序列)、内部(内含子)或下游(3’非编码序列)， 并且可能会影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性和/或翻译。 调节子序列可以包含但不限于增强子、启动子、抑制子结合位点、翻 译前导序列、内含子或多腺苷酸化信号序列。它们还可以包括天然的 或合成序列，以及由合成的和天然的序列相结合的序列。
本发明中使用的载体还可以包括用于增强表达的适合序列。
本发明中可以使用的启动子的实例是已知在真核细胞中控制表 达的启动子。可以使用任何能够在丝状真菌中表达的启动子。实例是 能够被淀粉或纤维素强诱导的启动子，例如来自曲霉属的葡萄糖淀粉 酶启动子或α-淀粉酶启动子，或者来自木霉属的纤维素酶(纤维二糖 水解酶)启动子，糖酵解代谢途径中的酶（例如磷酸甘油酸酯激酶 (PGK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)等）的启动子。优选纤维二糖水 解酶-I启动子、纤维二糖水解酶-II启动子、淀粉酶启动子、葡萄糖 淀粉酶启动子、木聚糖酶启动子或烯醇化酶启动子。
除使用特定启动子之外，其它类型的元件也可能影响转基因的表 达。具体地，证明了内含子有可能增强转基因的表达。
表达盒还可以包括其它元件，例如可以被内源或外源元件（例如 锌指蛋白，包括天然存在的锌指蛋白和嵌合锌指蛋白）调节的元件。
本发明中使用的表达盒还可以包括增强子元件或上游启动子元 件。
本发明中使用的载体还可以构建为使得它们包含增强子元件。因此， 本发明的构建体包含目的基因和一个3’DNA序列，该序列用作终止转录 并允许将所获得的mRNA多腺苷酸化的信号。可以应用任何使得从选定 的宿主生物体的分泌成为可能的信号序列。优选的信号序列是来自烟曲 霉的磷脂酶信号序列或来源于其的用于从丝状真菌的分泌的信号序列。
还可以使用特定的前导序列，因为转录起始点和编码序列起始点 之间的DNA序列，即非翻译的前导序列可能会影响基因表达。优选 的前导序列包含控制相连基因的最佳表达的序列，也就是说，它们包 含能够增加或保持mRNA稳定性并阻止不合适的翻译起始的优选一 致前导序列（consensus leader sequence）。这种序列的选择是本领域 技术人员所熟知的。
为提高鉴定转化体的可能性，所述表达盒中可以包括可选择或可 筛选的标记基因。这种标记基因是本领域技术人员所熟知的。
将所述表达盒或含有所述表达盒的载体构建体引入宿主细胞。将 构建体引入宿主细胞的多种技术是可用的并且是本领域技术人员所 熟知的。对微生物细胞的转化可以通过以下方式来实施：聚乙二醇、 氯化钙、病毒感染、DEAE-葡聚糖、噬菌体感染、电穿孔和其它现有 技术中已知的方法。真菌的转化可以按照et al.，Gene 61:155-164,1987实施。将重组载体引入至酵母中可以通过本身已知 的方法实现，包括电击穿、用原生质球、醋酸锂等。
一旦获得本发明的表达盒或DNA序列，就可以按照用本身已知的方 法导入，从而在适合的宿主系统中过表达所编码的多肽。然而，DNA序 列本身也可以用于转化本发明的适合的宿主系统以实现所编码的多肽的 过表达。
一旦本发明的DNA序列在适合的宿主细胞和适合的培养基中表 达，所编码的磷脂酶可以按照本身已知的方法从培养基（在磷脂酶分 泌到培养基中的情况下）或者从宿主生物体（在磷脂酶存在于细胞内， 例如细胞周质间隙中的情况下）中浓缩和/或分离。已知用于分离培 养基中不可溶部分和生物质的方法以及随后用于浓缩磷脂酶的方法 可以用于生产浓缩的磷脂酶溶液或用于制备磷脂酶的干燥品。例如， 过滤方法或离心方法可以用于移除不溶的组分，继而通过超滤法进行 浓缩或使用错流过滤法。干燥可以通过冷冻干燥或喷雾干燥、粒化法、 挤出法或其它方法实施。可使用已知的蛋白纯化方法分离本发明的磷 脂酶。例如，多种色谱或凝胶色谱方法可以单独使用或组合使用。依 据重组生产方法中所用的宿主细胞，本发明的酶可以或不可以通过糖 基化方式共价修饰。在真核细胞中，对分泌蛋白的糖基化为调控蛋白 折叠、构象稳定性、热稳定性和蛋白水解抗性提供了基础。对于磷脂 酶的特定用途，该酶的糖基化变体可能比非糖基化的变体更为优选。
本发明还涉及分离的或基本上纯化的核酸组合物和蛋白组合物。 分离和纯化的多核苷酸/多肽或其片段是指从其天然环境中分离并以 纯化的形式存在用于下一步使用的多核苷酸或多肽或其片段。分离的 多核酸片段或多肽可以以纯化的形式存在或者可以在非天然环境中 存在，例如在转基因的宿主细胞中。例如，分离的或纯化的多核苷酸 片段或蛋白或其生物活性部分如果是通过重组技术产生则基本上不 含其它细胞材料或培养基，或者基本上不含化学前体或其它化合物。 分离的多核苷酸优选地不含作为该核酸来源的生物体的基因组DNA 中天然位于该核酸侧翼(即位于该核酸的5’末端和3’末端的序列)的核 酸序列（优选蛋白编码序列）。例如，依照不同的实施方案，所述分 离的核酸分子可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb 或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在作为该核酸分子来源的细 胞基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼。基本上不含细胞材料的 蛋白包括具有少于约70%、50%、30%、20%、10%、5%(基于干重 计)污染蛋白的蛋白和多肽的组合物。如果本发明的蛋白或其生物活 性片段是以重组方法产生的，则所述培养基优选地包含少于大约 70%、50%、30%、20%、10%或5%(基于干重计)的化学前体或非 蛋白类化学物质。
本发明还涉及含有本发明的多肽的磷脂酶组合物。磷脂酶组合物 通常是液体或干燥的。液体组合物优选地包含纯化或富集形式的磷脂 酶。但是，可以添加助剂，例如稳定剂和/或甘油、山梨醇或单丙烯 乙二醇（monopropylene glycol）；添加剂，例如盐、糖、防腐剂、 调节pH值的试剂和蛋白质。典型的液体组合物是水性或油性悬浮液。
干燥组合物可以是冷冻干燥、喷雾干燥、粒化或挤出的组合物， 其可以只含有酶。干燥组合物可以是颗粒形式，其可以很容易地与例 如食品或饲料组分混合或者其优选地形成预混合物的组分。优选地， 所述酶颗粒的颗粒大小与所述混合物中其它组分的颗粒大小是相容 的。这使得安全且目的明确的试剂将酶合并到经加工的食品、预混合 物或动物饲料中。
干燥组合物还可以包含其它添加剂（例如盐，尤其是磷酸盐及其 无水形式）以及稳定剂（例如聚乙烯吡咯烷酮等）以在应用中调节某 些条件，例如pH值。
本发明中该实施方案的食品添加剂可以与其它食物组分以类似 的方式组合，由此生产经加工的食品产品。这种其它食品组分包含一 种或多种酶补充剂、维生素、矿物质或微量元素。然后，由此获得的 组合的膳食补充剂可以与其它食物组分（例如谷物和植物蛋白）以合 适的量混合以获得经加工的食品。将这些组分加工成经加工食品的过 程可以通过本身已知的加工装置实施。
在一个优选的实施方案中，本发明的磷脂酶组合物额外地包含有效 含量的一种或多种酶用于食品或动物饲料，或者用于食品或动物饲料生 产的前期或者用于纺织工业，优选地选自：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷 酶、漆酶、其它磷脂酶、磷酸酶、内切葡聚糖酶（特别是内切-β-1,4-葡 聚糖酶、内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶、内切-1,2-β-葡聚糖酶和内切-1,3-α-葡聚 糖酶）、纤维素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶（尤其是阿拉伯半乳聚糖-内 切-1,4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖-内切-1,3-β-半乳糖苷酶）、果胶- 降解酶（特别是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、 阿拉伯聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶、鼠 李糖聚半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶、果胶酸裂解酶和α-半乳糖醛酸酶 （α-galacturonidase））、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、 木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶、脂肪分解酶（例 如脂肪酶、二半乳糖苷-双甘油酯酶和角质酶）以及其它的酶，例如漆酶 和转谷氨酰胺酶。
本发明的磷脂酶还可以用于多种用途。实例是在烘焙中和在动物 饲养中以及在用可持续能量来源（例如油菜籽）中生产燃料中或者在 纺织品原材料加工中的应用。
一个优选的用途是本发明中具有磷脂酶活性的多肽在植物油脱 胶方法中的应用。例如，用本发明的多肽处理待脱胶的食用油，借此 将大部分磷脂酶水解并且随后将含有经水解的磷脂的水相从所述油 中分离。这一方法尤其适用于纯化含有磷脂的食用油，例如植物油， 如大豆油、油菜籽油和葵花籽油。
在磷脂酶处理之前，优选地将油预处理以除去粘性物质，例如通 过水蒸气精馏法（humid refining）。典型地，在用本发明中的磷脂 酶处理之初，油中含有50-850ppm以磷脂形式存在的磷。处理之后， 磷含量通常介于2-10ppm之间。
磷脂酶处理通常是通过以下方式实施的：将磷脂酶分散在水溶液 中，优选地是平均直径＜10μm的小滴。优选地，基于油计，水的含 量是0.5至5%重量(w/w)。任选地可以加入乳化剂。可以对其进行机 械搅拌以保持乳液状态。磷脂酶的处理可以在约3.5至约5.0的pH 值范围内进行。此方法的pH值范围可以是约3.5至约5，优选3.8 至4.5，最优选4.0至4.2，以使所述酶的性能最大化。pH值可以例 如通过加入柠檬酸、柠檬酸缓冲液、磷酸或盐酸进行调节。适合的温 度通常为30°-70℃，优选45°-65℃，最优选55°-62℃。反应时间通 常为1至12小时，优选2至6小时。适合的酶用量通常为120至3000 单位/千克油，优选250至2000，最优选750至1500单位/千克油。
磷脂酶处理可以分批进行（例如在一个带搅拌的釜中）或者可以 是连续的，例如在一系列带有搅拌的釜式反应器中。
磷脂酶处理之后是分离水相和油相。所述分离可以通过常规方式 进行，例如离心。所述溶液含有磷脂酶，并且所述酶可以再次使用以 提高该方法的经济效率。
所述处理可以通过本身已知的方法进行。
有利地，本发明的磷脂酶还可以用于制备生面团和烘焙食品，其中 有效量的本发明多肽在生面团中起作用。与没有加入本发明的具有磷脂 酶活性的多肽的生面团或烘焙产物相比，通过加入本发明的具有磷脂酶 活性的多肽，生面团或由该生面团制备的烘焙产品的一种或几种性质得 到改善。
在使用本发明的磷脂酶制备生面团的过程中，可将磷脂酶加入到 生面团本身中，加入到任何制备生面团的成分中和/或加入到制备生 面团的生面团成分的混合物中。因此，本发明中具有磷脂酶活性的多 肽本身可以加入到生面团制备的任何步骤中，或者加入到一个、两个 或更多个步骤。所述的有效量是指足以对生面团和/或烘焙产物中至 少一种目的性质产生可测量作用的磷脂酶的量。
本文所定义的表述“改良的特性”是指相对于没有加入本发明磷 脂酶的生面团或产物，由于所述磷脂酶的作用而得以改良的生面团和 /或从生面团得到的产物（尤其是烘焙食品）的任何性质。改良的性 质可以包括，例如：生面团强度提高、生面团的弹性提高、生面团的 稳定性提高、生面团的粘性减小、生面团的延展性提高、生面团的可 机械加工性改善、烘焙产品的体积增加、烘焙产品的屑状结构改善、 烘焙产品的柔软性改善、烘焙产品的香味改善和/或烘焙产品变味延 迟。确定这些性质的方法是现有技术中已知的。
本文中所定义的生面团是指面粉和其它成分的混合物，其坚硬到 足以进行揉或卷。生面团可以是新鲜的、冷藏的、预熟的或预烘焙的。
所述的“烘焙产品”是指用生面团制备的任何产品，并且是软或脆 的。可应用本发明中磷脂酶制备的烘焙产品的实例是，例如面包（尤其 是白面包、全麦面包或黑麦面包），通常是大面包（loaves）或法棍面包 式的法国面包、面团、口袋面包、玉米粉圆饼、玉米面卷（tacos）、蛋 糕、薄烤饼、饼干和糕点（pastry）、烤面包、双面烤面包（double baked bread）等。
在制备这些烘焙产品过程中，可以加入本发明中具有磷脂酶活性 的多肽和/或任何适合相应用途的制剂形式的一种或多种其它的酶， 例如干燥形式，以及液体或预混合物。另外，可向生面团中加入一种 或多种其他的酶。这些其他的酶可以是任何来源，以及例如可以来自 于哺乳动物和植物。优选地，它们来自于微生物，更特别优选地来自 于细菌或真菌。
依据优选的实施方案，其它的酶可以是淀粉酶，例如α-淀粉酶（适 合于生产可以通过酵母发酵的和延迟变质的糖）或β-淀粉酶、环糊精 葡聚糖转移酶、肽酶，尤其是外肽酶（适于增加香味）、转谷氨酰胺 酶、脂肪酶（适合于修饰存在于生面团或生面团的一部分中的脂质以 使生面团更柔软）、磷脂酶（可用于修饰存在于生面团或生面团的一 部分中的脂质以使生面团更柔软并增加生面团中的气体保留量）、纤 维素酶、半纤维素酶，特别是戊聚糖酶，例如木聚糖酶（可用于部分 水解戊聚糖以增加生面团的延展性）、蛋白酶（用于面筋软化，特别 是使用硬质小麦面粉时）、蛋白质二硫化物异构酶（例如，WO 95/00636中公开的蛋白二硫化物异构酶）、糖基转移膜、过氧化物酶 （用于增加生面团的稠度）、漆酶或氧化酶，例如醛醣氧化酶、葡萄 糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧合酶或L-氨基酸氧化酶（用于增 加生面团的稠度）。
这个/这些任选地另外加入的酶可任选地单独加入或与本发明中 具有磷脂酶活性的多肽一起加入作为发酵剂或生面团添加剂的组分。 本发明还涉及这种生面团的制备以及用这些生面团制成的相应烘焙 产品的制备。
本发明还涉及预混合物（例如以面粉组合物的形式）用于生面团和/ 或由生面团制成的烘焙产品的制备，其中该预混合物包含本发明中具有 磷脂酶活性的多肽。
本发明中具有磷脂酶活性的多肽还可以用作动物饲料的添加剂。 向饲料中加入磷脂酶能够提高动物对饲料的转化效率。因此，用这种 饲料喂养的动物的生长得到改善。因此，本发明中的磷脂酶可以本身 的方式或饲料浓缩物的方式加入。另外，磷脂酶还可以通过转基因植 物被加入到动物饲料中，其中所述磷脂酶是通过异源基因表达合成 的。EP0449376中公开了生产这种转基因植物的方法。
本发明中具有磷脂酶活性的多肽还可以用于纺织品原材料（例如 棉花纤维）加工中的洗涤过程，以促进对纤维的进一步处理。通过洗 涤得到的改善能够影响染色过程中的性能以及后续对纤维或其制成 的纺织品的机械加工和酶促加工。
从微生物烟曲霉中分离的磷脂酶基因储存在质粒pPL3949-Topo2.5 中，其依据布达佩斯协议的规定于2009年7月2日保藏于德国微生物菌 种保藏中心(DSMZ),Inhoffenstraβe 7B,D-38124Braunschweig，的登录 号为DSM 22741。
本发明进一步基于所公开的附图进行描述。示出如下：
图1：从烟曲霉中纯化的磷脂酶的等电点聚焦（IEF）凝胶
泳道1：来自等电点聚焦校准试剂盒的标记蛋白，pH 2.5-6.5
泳道2-3：箭头标记的为pl大约4.1的磷脂酶条带
图2：里氏木霉RH32664中表达的重组磷脂酶的温度优化曲线
图3：里氏木霉RH32664中表达的重组磷脂酶的pH优化曲线
图4：烟曲霉RH3949的染色体磷脂酶基因的核苷酸序列及由其 得到的氨基酸序列。内含子用斜体表示，氨基酸序列用粗体表示(SEQ ID NO:1)。
图5：烟曲霉RH3949的染色体磷脂酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
图6：烟曲霉RH3949的磷脂酶基因的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。
图7：载体pPL3949-Topo2.5的限制性内切酶图谱。
图8：表达载体pAB500-PL3949的限制性内切酶图谱。
参考实施例1
磷脂酶活性的测定
1个磷脂酶单位(PLU)相当于标准条件下每分钟从磷脂酰胆碱中 释放1μmol脂肪酸所需的酶量。
试剂:
底物乳液：
将1g Epikuron 200(从Lucas Meyer公司的大豆中纯化的磷脂酰胆 碱，现可从Cargill获取)、100ml去离子水和5ml 0.32M CaCl2溶液用 Ultra Turrax在24,000rpm下匀浆2分钟。底物乳液在4°-8℃下可稳定 3-4天。
其它溶液：
0.32M MgCl2溶液、新鲜的3.3mM柠檬酸-单水合物溶液、10mM KOH溶液、溶解于去矿物质水的1%Triton X100(Fluka公司)溶液。
酶溶液：
酶制剂溶于去离子水中。反应体系中酶的浓度应不超过2.5U g-1。
步骤：
主值
10ml底物乳液
10ml 1%Triton X100溶液
5ml 3.3mM柠檬酸-单水合物溶液
移液至一个25ml的广口锥形瓶中，置于40℃下10分钟。调整 pH值至大约3.3-3.5。
加入0.1ml酶溶液后，将分析体系在40℃下孵育10分钟。孵育时 间结束后，将所述溶液中用10mM KOH滴定至pH值为10.0，其中开 始的5ml KOH快速加入(持续时间：约1分钟)。记录KOH的消耗量。
空白值
将酶的母液加热至95℃持续15分钟从而将其灭活。冷却至室温 后，进一步的处理与用于主值的相同。
空白值不需要孵育。
评估：
VKOH(ml)空白值和主值之间KOH消耗量差异
cKOH(mol l-1)KOH溶液浓度
Δt(min)孵育时间
cs(g ml-1)样本浓度
v(ml)使用的体积
参考实施例2
pH 3.5时用于磷脂酶检测的快速测试
试剂：
底物乳液：
将1g Epikuron-200与100g Milli Q水和5ml 0.32M氯化钙溶液混 合，然后用Ultra-Turrax进行匀浆化(在约24000rpm下进行约1-2分钟)。
对于分析体系，将10ml该底物乳液与10ml1%Triton X-100溶液 和5ml 3.3mM柠檬酸-单水合物溶液混合。
游离脂肪酸，半微量测试(Boehringer)
（半微量测试包含反应混合物A、反应混合物B和N-乙基顺丁烯二 酰亚胺的试剂）。
步骤：
在微量滴定板中加入5μl稀释的酶溶液并与0.1ml底物乳液混合。
将所述底物/酶体系在水浴中于40℃下孵育10min。随后，将5μl 所述体系移液至另一个微量滴定板，加入到100μl反应混合物A中，于 40℃下在水浴中孵育5分钟。孵育结束后，加入5μl 1:1比例的反应混 合物B与N-乙基顺丁烯二酰亚胺的混合物，并在40℃下再次孵育5分 钟。
如果所述反应体系呈现红色，则说明磷脂酶活性存在。
参考实施例3
游离脂肪酸含量的测定
试剂：
乙醇（96%溶液）、甲苯
乙醇和甲苯以1:1的比例(体积比)混合；
0.1N乙醇制KOH（ethanolic KOH）
溶于乙醇的1%酚酞溶液
步骤：
称取约3g无水油至锥形瓶中，精确至小数点后四位，溶于20ml乙 醇-甲苯混合物中，混入2至3滴酚酞并用0.1N KOH溶液滴定至呈现稳 定的红色。
评估：
酸值是游离脂肪酸含量的指示。酸值是指中和1kg油中所含的游离 脂肪酸时所需的氢氧化钾的量（单位为克）。酸值(AN)依据下述等式计 算：
a 所使用的KOH溶液的量（单位为ml）
N KOH的当量浓度
E 称取的脂肪的量（单位为g）
56.1 KOH的摩尔质量（单位为g/mol）
酸值可以用于计算游离脂肪酸(FFA)的百分比含量:
282油酸的摩尔质量
参考实施例4
脂肪酶的检测
对橄榄油-琼脂上的脂肪酶的定量检测是依据与Kouker和Jaeger 所述方法(Applied Environ.Microbiol.,59:211-213(1987))类似的方法进 行。
为检测脂肪酶活性，使用由1%橄榄油生产的三丁酸甘油酯琼脂 (Fluka 91015)制成的琼脂平板。pH值调整至5.5。
脂肪酶活性的检测是依据Winkler and Stuckmann(1979)(J.Bac., 138:663-670(1979))用光度测定法进行的，以溶于0.5M柠檬酸/磷酸缓冲 液（pH 5.1）的乳化的棕榈酸对硝基苯酯(Sigma N2752)作为底物。
实施例1
从烟曲霉株系RH3949中提取磷脂酶
烟曲霉在装有50ml培养基的200ml摇瓶中于28℃和200rpm下 培养超过5天。所述培养基含有0.5%Epicuron 200(Lucas Meyer)、0.5% 玉米浆粉、0.2%NH4NO3、100mM KH2PO4和0.1%Triton X100。灭菌 前将pH值调整至6。将所述培养基用孢子悬液接种。5天后，通过过滤 将培养物上清液与菌丝体分离，并测量所述液体中的磷脂酶活性。
实施例2
从烟曲霉株系RH3949中纯化磷脂酶
步骤1：阴离子交换器，Macro Prep Q
为纯化磷脂酶，首先在Macro Prep Q阴离子交换器上进行蛋白分 离。
为此，将实施例1中所述培养物的浓缩培养物上清液用完全脱盐的 水稀释，直至所述蛋白溶液的电导率与缓冲液A相同。随后，用1M NaOH将所述蛋白样品的pH值调整至7，并上样至已用缓冲液A平衡 的柱子。在用缓冲液A清洗所述柱子后，用0-1M线性增加的NaCl梯 度洗脱磷脂酶。将具有磷脂酶活性的级分合并，并进一步纯化。
缓冲液A:5mM CaCl2+20mM Tris-HCl，pH 7.0
缓冲液B:5mM CaCl2+20mM Tris-HCl，pH 7.0+1M NaCl
步骤2：HIC，苯基琼脂糖凝胶6Fast Flow低分辨率
将步骤1中所述具有磷脂酶活性的蛋白样品与3.4M硫酸铵溶液以 1:1的比例混合，并用1M NaOH溶液调整pH值至7.0。将所述样品上 样至也已用缓冲液A平衡的苯基琼脂糖凝胶柱后，将磷脂酶用逐渐降低 的硫酸铵梯度洗脱。
缓冲液A:5mM CaCl2+20mM Tris-HCl，pH 7.0+1.7M硫酸铵
缓冲液B:5mM CaCl2+20mM Tris-HCl，pH 7.0
步骤3：凝胶过滤，Superose 12HR 10/30
作为最后一个纯化步骤，将所述蛋白用凝胶过滤柱进行分离。为此， 将步骤2中所述的磷脂酶样品在一个透析管(Naturin protein farce)中用 完全脱盐的水透析1.5小时并随后加以冻干。将冻干物用500μl完全脱 盐的水溶解。分为两次各250μl上样至所述柱上，并用缓冲液A洗脱。
缓冲液A：5mM CaCl2+20mM Tris-HCl，pH 7.0
将纯化的磷脂酶上样至IEF凝胶。结果见图1。
切下条带用于鉴定并依据上述的分析方法进行磷脂酶活性检测。
实施例3
N-末端蛋白测序
通过在Superose上进行最后一个纯化步骤后，将纯化的蛋白用非变 性凝胶进行分离。切下具有磷脂酶活性的蛋白条带并再次上样至SDS凝 胶以确定分子量。为确定N-末端氨基酸，将所述蛋白条带从非变性凝胶 转移至PVDF膜(Fluotrans转印膜，Pall)并且根据考马斯亮蓝染色程序 用氨基酸测序仪(Applied Biosystems Model 470A)确定N-末端氨基酸序 列。它们是：
1DVSAS VLQKLSLFAQ Y16(SEQ ID NO:3)
序列比较显示所述磷脂酶基因的N-末端氨基酸序列与烟曲霉株系 Af293(GenBank EAL86100)的细胞外脂肪酶基因有高度的序列相似性。
实施例4
用聚合酶链式反应（PCR）从烟曲霉株系RH3949中克隆染色体的 磷脂酶基因
由烟曲霉脂肪酶的染色体DNA序列数据获得用于磷脂酶DNA扩增 的不同寡核苷酸引物。依据Hynes,M.J et al.,(1983)Mol.Cell.Biol.3, 1430-1439中经改良的指导进行染色体DNA制备。用PCR法进行磷脂 酶基因的扩增。将PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO质粒中并测序。结果 显示，引物对N2-3948和3949-Apal获得含有本发明中磷脂酶DNA的 基因。
N2-39485′-AGAGTCTGCC TATATTCTCT CTGAAAGG-3′(SEQ ID NO.4)
3949-ApaI 5′-TATGACAATTTCCGTGATTACTG-3′(SEQ ID NO: 5)
100μl反应体系包括:10μl 10x缓冲液(200mM Tris/HCl,pH 8.4, 500mM KCl)、3μl 50mM MgCl2、2μl10mM dNTP、50pMol每条寡 核苷酸引物(N2-3948和3949-ApaI)、约10ng染色体DNA、5U Taq DNA 聚合酶(Invitrogen)。反应体系按如下方式处理：95℃变性/5min,45 循环(95℃/1min,45℃/1min,72℃/1min)以及随后72℃延伸/10 min。
所述PCR产物用Qiaquick柱进行纯化并克隆至pCR2.1-TOPO质粒 中。测序后，将一个含有本发明中磷脂酶DNA序列(图5,SEQ ID NO:1) 的转化体命名为pPL3949-Topo2.5(图7)。
编码磷脂酶的开放读码框含有1052个核苷酸，包括299个氨基酸。 磷脂酶基因含有三个内含子。
所得到的N-末端氨基酸序列通过蛋白测序确定的肽序列(实施例3, SEQ ID NO:3)相符。
所得到的分子量约为28.6kDa，与通过SDS-PAGE确定的约29 kDa(实施例8)相符。
信号序列的确定是借助于Nakai和Kanehisa(1992,Genomics 14, 897-911)等的计算机程序(PSORT)进行。依据该程序，磷脂酶基因含有 21个氨基酸的信号序列和8个氨基酸的前肽。
实施例5
构建表达载体pAB500-PL3949
表达载体pAB500-PL3949中，磷脂酶基因处于里氏木霉cbhl启 动子和cbhl终止子的控制下。为构建质粒pAB500-PL3949，通过PCR 法从pPL3949.Topo2.5质粒中扩增编码磷脂酶的基因。所得PCR产 物用AvrII/Pacl酶水解，随后插入pAB500质粒中里氏木霉cbh1启动 子之后的Spel和Pacl酶切位点之间。所得到的质粒命名为 pAB500-PL3949。
质粒pAB500的构建依据下述步骤进行：
通过引入更多的酶切位点(cbhl启动子和cbhl终止子之间的Sacll 位点中的Spel和Pacl)由质粒pALK487(WO94/28117)获得质粒 pAB487。Spel-Pacl酶切位点用于指导磷脂酶基因的克隆。
用PCR法从p3SR2质粒(GenBank 16371)中扩增带有其启动子和 其终止子的amdS基因。所得PCR产物用Ascl和Nrul酶切并插入 pAB487质粒的Ascl/Stul酶切位点之间，由此获得pAB500质粒。
实施例6
转化里氏木霉
用于转化和处理里氏木霉的技术是et al.(1987,Gene 61: 155-164)所述的那些技术。
用从质粒pAB500-PL3949中分离的线性化表达盒转化里氏木霉 RH32439。
筛选并用单孢子分离法纯化转化体。在所有的转化体中，选择那 些具有最高分泌能力的转化体并进一步用在实施例7中用于生产酶材 料。
实施例7
在摇瓶中通过发酵方式生产酶溶液
将携带实施例6中表达盒的转化体在摇瓶中用纤维素诱导的培养 基培养。将生长6天后获得的培养物的滤液用于表征所述酶(实施例8) 并用于分析油的脱胶方法(实施例9)。
实施例8
重组磷脂酶的表征
用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法确定分子量，得到 的本发明中磷脂酶的分子量约为29kDa。
对重组磷脂酶的N-末端测序是由Chromatec公司(德国)进行的。 通过测序得到的氨基酸序列与所述磷脂酶的N-末端序列(实施例3)相 符。
通过MALDI-MS方法进行的重组蛋白鉴定是由Protagen公司 (德国)进行的。结果证明本发明的磷脂酶蛋白序列是正确的。
在不同温度下用上述的确定方法确定酶活性的温度依赖性。磷脂 酶最适宜的温度是50℃(参见图2)。
用上述的确定方法在不同pH值下确定酶活性的最适宜的pH值。 为此，反应体系中的pH值用柠檬酸调节。
该酶在pH 3至5的宽pH值范围内具有活性(参见图3)。
脂肪酶活性用上述确定方法进行确定。本发明中烟曲霉的磷脂酶 具有非常低的脂肪酶活性。依据计算结果，磷脂酶活性与脂肪酶活性 的比率是7480:1(实验的变化限值为±10%)。
实施例9
用来自于含有烟曲霉RH3949基因的重组里氏木霉株系的培养物 上清液的酶进行油脱胶
将200g食用油(含磷量为163.6ppm的大豆油1；含磷量为161.6 ppm的油菜籽油；含磷量为592.8ppm的大豆油2以及含磷量为81.1 ppm的大豆油3)与0.42ml 46%柠檬酸溶液和水在400ml的玻璃烧杯 中混合。因此，总的含水量不应超过2%。通过加入7%NaOH溶液(0.6 ml)将所得反应混合物的pH值调整至pH 4.0。加入本发明的酶溶液 (50U)后，将所述反应体系借助于Ultra Turrax在24000rpm下混合2 min。随后，将所得混合物装入一个三颈的圆底烧瓶中并在55℃或 60℃下孵育，同时轻轻搅拌(200rpm)。
加入所述酶溶液后，每隔120min取出20ml样品。将所述样品在 4300x g下离心5分钟，加入氧化镁在850℃下灰化后，通过在830nm 下用光度测定法测定油中磷钼酸复合物来确定磷脂含量（ppm磷含量 表示）。
含有本发明中pAB500-PL3949质粒的重组里氏木霉株系被称为 RH32664。
在55℃或60℃条件下用来自于重组烟曲霉株系RH3949的磷脂 酶对食用油脱胶的过程所得到的结果见表2。
结果显示与用柠檬酸进行的水脱胶方法相比用本发明的酶脱胶方 法具有非常显著的脱胶效果。仅仅4小时后，残留的磷含量少于10 ppm。
表2:用来源自重组里氏木霉株系培养物上清液的本发明磷脂酶 (250U/kg食用油)进行的大豆油和油菜籽油的脱胶，含水量为2%且 pH为4.0
实施例10
油脱胶方法中游离脂肪酸含量
油脱胶方法中游离脂肪酸含量的确定是依据参考实施例3中所述 进行。将食用油与实施例9中所述的磷脂酶混合并在57℃下孵育6 小时。对磷脂的酶促水解是由切割脂肪酸的磷脂酶引起的。为进行比 较，用纯的食用油作为空白值进行相同的分析。
与空白值(BV)相比，在57℃下用磷脂酶处理食用油后所述样品中 游离脂肪酸(FFA)含量仅稍微升高并且差异(ΔFFA)是0.18%(表3)。
表3：磷脂酶处理油后游离脂肪酸的含量
机译： 酸性磷脂酶的克隆，表达及应用
机译： 酸性磷脂酶的克隆，表达及应用
机译： 酸性溶血磷脂酶的克隆，表达及用途
