髓鞘碱性蛋白的成像

摘要

本发明涉及用于髓鞘碱性蛋白检测的方法，所述方法包括鉴别处于髓鞘质相关神经病的风险中或诊断患有髓鞘质相关神经病的受试者，对所述受试者肠胃外施用试剂，和通过检测与髓鞘碱性蛋白的结合测定在所述受试者中的髓鞘形成。还提供了使用与髓鞘碱性蛋白特异性结合的试剂检测髓鞘质和其在样品中的局部浓度的定量测量的方法以及含有用于检测髓鞘碱性蛋白的试剂或其衍生物的试剂盒。

说明书

背景

在神经系统内的信息流动需要维持沿神经元的离子梯度。在许多 神经元中，这类梯度沿轴突的有效且高效的维持需要电绝缘。髓鞘质 (包盖轴突的富脂质的介电质)提供该绝缘功能。神经系统含有高水平 的髓鞘质，在许多有髓轴突集束在一起的情况下，其特别富集在诸如 脊髓束和脊神经根、外周神经系统中的神经和脑中的纤维束中，统称 为“白质”，与“灰质”相对。因为非神经系统组织缺乏髓鞘质，所以髓 鞘质的存在可以区别神经组织与其他组织类型；脊髓和脊神经根与脊 柱的非神经元件；及在脑中的白质与灰质。

体内或体外定性或定量地使得髓鞘质可见的能力赋予研究人员 和临床医师重要的诊断和治疗工具。例如，在手术期间视觉鉴别周围 神经的能力帮助外科医生避免切割或损坏神经。在图像引导的神经手 术方面的先前尝试利用不需要造影剂或通过逆运输进行轴突的荧光 标记的形式。在该第一方法中的挑战在于信号通常是模糊的。

在文献中广泛报道了动物模型中神经的逆标记。虽然该策略可以 起作用，但是存在许多内在问题。标记完全取决于注射造影剂的位置。 如果神经未能摄取造影剂，则该神经将不被可视化。在一些情况下， 需要神经刺激来便于逆运输。逆运输所需的长时间在临床上可能不可 行。

有髓神经和纤维束充当由临床前和基础神经科学研究人员进行 的解剖学研究中的有用标记。另外，髓鞘质鞘的形成是新神经元的产 生和功能稳定的重要步骤；因此髓鞘质标记的可利用性可辅助研究人 员研究这类方法。髓鞘质标记方法还可用于开发许多疗法、神经干细 胞研究和髓鞘质相关神经病的假定动物模型。脊髓的体内髓鞘质成像 帮助临床医师诊断并治疗脊髓病变，诸如神经压迫症或椎间盘突出以 及髓鞘质相关神经病，诸如对中枢或外周神经系统内的髓鞘质产生损 坏的多发性硬化。在这类条件下体内测定患者髓鞘形成量的能力将辅 助临床医师和研究人员诊断和预测髓鞘质相关神经病。

脊神经根可随着它们横越脊柱管而被损坏，但在椎间孔中特别易 损，在锥间孔中脊神经根连接在一起形成脊神经。综合征(诸如，颈 部神经根病、坐骨神经痛、椎间盘突出和根压迫症)由主要来自肿瘤 或其他病灶的压迫引起，所述压迫通常表现为背部或颈部疼痛。背部 或颈部疼痛可由多种肌骨胳机制引起且医师需要能够检查神经系统 以确定是否存在神经根或脊髓的压迫。使慢性颈部或背部疼痛的根源 成像或鉴别其的能力可以使外科医师能够有效治疗这些综合征。

的确存在标记髓鞘质的方法，包括使用市售的荧光髓鞘质染料来 鉴别髓鞘质含量高的组织。然而，除了几种染料(诸如，双-苯乙烯- 亚芳基染料，诸如1，4-双(对氨基苯乙烯基)-2-甲氧基苯(BMB)和 (E，E)-1，4-双(4′-氨基苯乙烯基)-2-二甲氧基-苯(BDB))以外，大部分公 开的染料不能穿过血液神经或血脑屏障。

髓鞘质为由中枢神经系统(CNS)中的少突胶质细胞和外周神经 系统(PNS)中的雪旺氏(Schwann)细胞形成的富蛋白质和脂质的基质。 因为CNS和PNS中的两种不同类型即分别为少突胶质细胞和雪旺氏 细胞的细胞都产生髓鞘质，所以根据髓鞘质的来源在蛋白质和脂质组 成方面存在相似和差异。在两种情况下，髓鞘质由约80％的脂质部分 和约20％的蛋白质部分组成。大量研究已经研究了两部分的分子组 分。

髓鞘质中的脂质部分含有胆固醇、胆固醇酯、脑苷脂、硫苷脂、 鞘磷脂、磷酯酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷酯酰丝氨酸、磷酰肌醇、甘 油三酯和甘油二酯。蛋白质部分由数种蛋白质组成，所述蛋白质包括 髓鞘碱性蛋白(MBP)、外周髓鞘蛋白22(PMP22)、连接蛋白32和髓 鞘质相关糖蛋白(MAG)，它们由PNS细胞和CNS细胞二者产生；蛋 白质髓鞘蛋白零(MPZ)，其仅由PNS产生；和蛋白脂质蛋白，其仅由 CNS细胞产生。

MBP为髓鞘质的占5％-15％的主要蛋白组分，其可解释为约 5mM浓度的MBP。技术(诸如圆二色谱、NMR和EPR光谱学、原子 力显微术等)提出MBP可具有带有β-折叠结构的核心元件的紧凑C形 式，但这仅在与脂质相关时才如此。髓鞘碱性蛋白与脂质的相互作用 可引起构象多变性且对于功能可能是关键性的。

与MBP选择性结合的试剂可引起髓鞘染色方面的改善且由此辅 助神经可视化。神经可视化可通过优化未结合和未特异性结合的染料 的消除并改善光学性质以允许髓鞘质与周围组织之间的对比度增强 来进一步改善。对于髓鞘质的体内可视化来说，理想的是在700-900nm 的近红外范围(NIR)中的光学性质。在NIR范围，水、血红蛋白和脂 质的吸附率极小且扩散降低，使得光子穿透率改善。并且，自发荧光 较低且NIR光深度穿透组织且受散射影响较小。

发明简述

本文提供检测髓鞘质相关神经病的方法，其包括鉴别处于髓鞘质 相关神经病的风险中或诊断患有髓鞘质相关神经病的受试者，对受试 者施用与髓鞘碱性蛋白特异性结合的试剂，和通过检测在所述受试者 中存在的所述试剂测定在所述受试者中的髓鞘形成。

在一个实施方案中，所述试剂包括式I的化合物、¹³C富集的式 I的化合物、¹⁹F-标记的式I的衍生物或式I的放射性同位素衍生物：

其中R¹为烷基，R²为给电子基团且R³为吸电子基团；或R²为 吸电子基团且R³为给电子基团。

在一个实施方案中，所述试剂包括式I的化合物、¹³C富集的式 I的化合物、¹⁹F-标记的式I的衍生物或式I的放射性同位素衍生物， 其中R¹为烷基，R²为给电子基团且R³为-SO₂R⁴，其中R⁴为烷基、 被取代的烷基、胺或被取代的胺。

在另一实施方案中，提供用于检测受试者中的髓鞘质相关神经病 的试剂盒，所述试剂盒包含与髓鞘碱性蛋白特异性结合的试剂和药学 上可接受的载体。

附图简述

在参考附图阅读以下详述时将更加透彻地理解本发明的这些和 其他特征、方面和优势，其中：

图1表示来自用髓鞘碱性蛋白(MBP)抗体(图1A)和BMB(图1B) 染色的大鼠的三叉神经组织切片的荧光显微检查的结果。放大率为 1000X。

图2表示来自用式Ia、Ib、II和III试剂对大鼠坐骨神经切片(顶 部版面)和三叉神经切片(底部版面)的离体(ex vivo)染色的结果。

图3表示来自用式Ia(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝CN)治疗的小 鼠的三叉神经和视神经的荧光体内成像的结果。

图4表示在小鼠的三叉神经上在MBP信号的位置与荧光团BMB 和式Ia化合物(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝CN)的位置之间的相关性。 对活小鼠给予BMB或式Ia化合物(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝CN)， 在足以清除和生物分布时间之后，将神经切除，切片，随后用MBP 抗体染色。

图5表示在存在和不存在纯化的天然样MBP的情况下对BMB 和式Ia化合物(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝CN)的Spectramax M5测 定。

图6表示在纯化的天然MBP、牛血清蛋白(BSA)或天然MBP的 脂质部分存在下来自对式Ia化合物(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝CN) 的Spectramax M5测定的数据。

图7表示来自用式Ia化合物对大鼠股神经切片(顶部版面)、坐骨 神经切片(中间版面)和三叉神经切片(底部版面)的离体染色的结果。

图8表示来自在用式I化合物(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝ SO₂CH₃)治疗的小鼠的臂丛中的神经的荧光体内成像的结果。

图9表示在存在或不存在纯化的天然样MBP或变性的MBP的 情况下对式Ia化合物(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝-CH₃)和式Ia化合 物(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝SO₂CF₃)的Spectramax M5测定。式 Ia化合物(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝SO₂CH₃)在400nm下激发且荧 光发射强度在610nm下读取。式I化合物(R¹＝CH₃、R²＝NH₂且R³＝SO₂CF₃)在430nm下激发且荧光发射强度在630nm下读取。

发明详述

以下详述是示例性的且并非想要限制本发明或本发明的应用和 用途。另外，并非想要通过前面的发明背景或附图描述中提出的任何 理论加以限制。

定义

为了更清楚且简明地描述并指出要求保护的发明的主题，对于专 用名词提供以下定义，其用于以下描述和随附权利要求书中。

“髓鞘质相关神经病”泛指其中神经元细胞的绝缘材料包盖部分 被损坏或功能障碍称为综合征、疾病或其他病理性病状的组成部分任 何病状，诸如但不限于多发性硬化、格-巴二氏综合征(Guillain-Barré syndrome)、脑白质病变、异染性脑白质病变、雷弗素姆氏病(Refsum’s  disease)、肾上腺脑白质病变、克拉伯氏病(Krabbe’s disease)、苯丙酮 酸尿症、海绵状脑白质病变(Canavan disease)、佩利措伊斯-梅茨巴赫 病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、亚历山大病(Alexander’s disease)、 糖尿病性神经病变、化学疗法引发的神经病或其任何组合。

“试剂”是指用于以允许化合物以所需浓度和功效施用的方式将 化合物引入受试者体内的溶液或载体。所述试剂可包括但不限于溶 剂、稳定助剂、缓冲剂和填料。

与不含髓鞘质的组织相比，如果试剂更频繁、更迅速、比较久地 或以更大亲和性与髓鞘质结合，则该试剂对于髓鞘质表现出“特异性 结合”。“非特异性结合”是指试剂与不含髓鞘质的组织的结合。对于 相关结合值，诸如特异性结合或非特异性结合，各样品应该在类似物 理条件(即，温度、pH、制剂和施用模式)下测量。一般来说，特异性 结合的特征在于试剂对靶具有比较高的亲和性和比较低到中等的容 量。当亲和常数K_a为至少10⁶M^-1时，通常将该结合视为特异性的。 较高亲和常数表示较大亲和性，且因此通常较大特异性。例如，抗体 通常与抗原以10⁶M^-1-10⁹M^-1或更高的亲和常数结合。“非特异性”结合 通常在中等到大容量下具有低亲和性。当亲和常数低于10⁶M^-1时，通 常发生非特异性结合。控制用以使试剂与组织接触的时间和方法来减 少非特异性结合。

“洗涤”泛指任何方法，诸如但不限于在非标记溶液或其他物质 (诸如但不限于水、盐水、缓冲盐水或乙醇)中浸渍或通过重复用非标 记溶液或其他物质冲洗，以在不消除与髓鞘质的特异性结合的情况下 提供用于从组织或组织样品中的非有髓组分中分解、分散或去除未结 合或非特异性结合的标记化合物的介质。

“基线荧光”是指，在未给予或结合任何荧光化合物的情况下在暴 露于电磁辐射的外部来源时由组织或组织样品发射的电磁辐射的频 率和幅值，其与在施用并结合荧光化合物并暴露于电磁辐射的外部来 源之后发射的辐射不同。

“代表组织切片的对照样品”是指具有与待分析的组织样品类似 的尺寸、形态或结构且具有一定髓鞘质水平的组织样品，由此样品的 髓鞘质水平充当可以与其他样品髓鞘质水平相比较的参考。

“肠胃外施用”是指将物质或化合物引入受试者的任何方式，其不 包括经口摄取或直接引入胃肠道，包括但不限于皮下注射、腹膜内注 射、肌肉注射、静脉内注射、鞘内注射、脑内注射、侧脑室注射、脊 柱内注射、鞘内注射、脑内注射、侧脑室注射或脊柱内注射或其任何 组合。

“药用载体”是指能将实际材料施用于应用部位、周围组织或制备 的组织切片以允许试剂具有有效的停留时间以便与靶特异性结合或 提供方便的释放方式的组合物。增溶策略可包括但不限于：调节pH、 形成盐、形成可离子化的化合物、使用共溶剂、络合、表面活性剂和 胶束、乳液和微乳液。所述药用载体可包括但不限于增溶剂、洗涤剂、 缓冲溶液、稳定剂和防腐剂。这些的实例包括但不限于HCl、柠檬酸、 DMSO、丙二醇、乙醇、PEG 300、环糊精、柠檬酸盐、乙酸盐、磷 酸盐、碳酸盐或三(羟甲基)氨基甲烷。

“脱髓鞘模型”是指在神经病性脱髓鞘的实验性研究中可利用的 神经元细胞的绝缘材料包盖部分的任何实验引发的损坏或功能障碍， 其包括但不限于实验性变应性脑脊髓炎。

“髓鞘再生”是指绝缘材料包盖神经元轴突的自发性、治疗性或实 验引发的修复、再生或其他形式的构建或功能。

“烷基”用以包括直链、支链或环状烃结构及其组合，包括低级烷 基和高烷烷基。烷基为C₂₀或以下的烷基。“低级烷基”是指1-6个碳 原子、优选1-4个碳原子的烷基，且包括甲基、乙基、正丙基、异丙 基及正丁基、异丁基和叔丁基。高级烷基是指具有7个或更多个碳原 子、优选7-20个碳原子的烷基，且包括正、异和叔庚基、辛基和十 二烷基。环烷基为烷基的亚组且包括3-8个碳原子的环状烃基团。环 烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和降冰片烷基。烯基和炔基 分别指其中两个或更多个氢原子被双键或三键置换的烷基。

“被取代”是指残基，包括但不限于烷基、烷基芳基、芳基、芳基 烷基和杂芳基，其中所述残基的至多3个H原子被低级烷基、被取代 的烷基、芳基、被取代的芳基、卤烷基、烷氧基、羰基、羧基、羧基 烷基、甲酰氨基、酰氧基、脒基、硝基、卤基、羟基、OCH(COOH)₂、 氰基、伯氨基、仲氨基、酰氨基、烷硫基、亚砜、砜、苯基、苄基、 苯氧基、苄氧基、杂芳基或杂芳氧基置换。

“给电子基团”是指为共轭π体系增加电子密度以使其更具亲核 性的化学基团。给电子基团可通过邻近π系统的原子上的孤对电子来 识别。给电子基团的实例包括但不限于-NR’R”、-NHR、-NH₂、-OH、 -OR、-NHCOR、-OCOR、-R、-C₆H₅和-CH＝CR₂。

“吸电子基团”是指从共轭π体系中除去电子密度提供亲核性更 低的结构的化学基团。吸电子基团可由邻近π体系、与更多电负性原 子具有数个键的原子或具有形式上的正电荷来识别。吸电子基团的实 例包括但不限于-COH、-COR、-COOR、-COOH、-COONH₂、 -COONHR、-COONR₂、-COCl、-CF₃、-CN、C＝C(CN)₂、-SO₃H、-NH₃⁺、 -NR₃⁺、-NO₂、-SO₂R、-SO₂NH₂、-SO₂NHR和-SO₂NR₂。

与非有髓组织相比，如果试剂更频繁、更迅速、比较久地或以更 大亲和性与髓鞘质结合或者如果其在有髓组织中更大程度地吸收或 更大程度地积聚，该试剂则对于髓鞘质表现出“特异性吸收”。一般来 说，特异性吸收的特征在于试剂对靶具有比较高的亲和性。

除非另外指出，否则在说明书和权利要求书中使用的表达成分的 量、性质(诸如分子量)、反应条件等的所有数字都被理解为在所有情 况下都由术语“约”修饰。因此，除非指出相反情况，否则以下说明书 和随附权利要求书中提到的数值参数都是近似值，其可视通过本发明 欲获得的所需性质而改变。起码不是试图对将等同原则应用于权利要 求书的范围加以限制，各数值参数应当至少可根据所记录的有效数字 的数且通过应用普通舍入技术解释。

许多本文所述的化合物可包含一个或多个不对称中心，且因此可 产生可根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的对映异构体、非对映异构 体及其他立体异构形式。所述试剂的化学结构例如包括不限于所有这 类可能的异构体以及其外消旋和光学纯形式。光学活性(R)-和(S)-异构 体可使用手性合成子或手性试剂制备或使用常规技术拆分。当本文所 述的化合物含有烯属双键或其他几何不对称中心时，除非另外说明， 否则希望所述化合物包括E几何异构体和Z几何异构体二者。同样， 还包括所有互变异构形式。

在某些实施方案中，提供利用试剂与髓鞘碱性蛋白的特异性结合 定性或定量检测在体外或体内样品中的髓鞘碱性蛋白的方法。与髓鞘 碱性蛋白的特异性结合可通过如下试剂进行，所述试剂包括式I的化 合物、¹³C富集式I的的化合物、¹⁹F-标记的式I的衍生物或式I的放 射性同位素衍生物

其中R¹为烷基，R²为给电子基团且R³为吸电子基团，或R²为 吸电子基团且R³为给电子基团。

在某些实施方案中，R¹可为1-6个碳原子、优选1-4个碳原子的 低级烷基，且包括甲基、乙基、正丙基、异丙基及正丁基、异丁基和 叔丁基。所述给电子基团可包括伯胺、仲胺或叔胺(-NH₂、NHR、NR’R”) 或烷氧基(-OR)。所述吸电子基团可包括腈基(-CN)、酯(-COOR)或砜 (-SO₂R)。

在各实施方案中，R²和R³通过苯环和烯属取代基的π双键轨道 共轭，由此为电子提供从给电子基团流动到吸电子基团的清晰路径。 所述给电子基团可在R²或R³位置，条件是吸电子基团在供选的位置 中。

在某些实施方案中，R¹为烷基，R²为给电子基团且R³为-SO₂R⁴基团，其中R⁴为烷基、被取代的烷基、胺或被取代的胺基。在某些 实施方案中，R¹可为1-6个碳原子、优选1-4个碳原子的低级烷基， 且包括甲基、乙基、正丙基、异丙基及正丁基、异丁基和叔丁基。所 述给电子基团可包括伯胺、仲胺或叔胺或烷氧基。R⁴可为1-6个碳原 子、优选1-4个碳原子的低级烷基，且包括甲基、乙基、正丙基、异 丙基及正丁基、异丁基和叔丁基。

在其他实施方案中，R⁴可用以改善水溶性且降低所得砜的logP。 R⁴可为被取代的烷基，诸如但不限于烷氧基；或醇。在某些实施方案 中，所述烷氧基可含有乙二醇单元或乙二醇封端的醇。例如，R⁴可为 (CH₂CH₂O)_nX或CH₂CH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nOX，其中n为1-6的整数， 且X为氢、甲基或乙基。加入丙基也可以消除对于β消除的潜在性。

在某些其他实施方案中，R⁴可为伯胺、仲胺或叔胺以形成磺酰 胺。所述胺基包括但不限于NH₂、NHR⁵和NR⁵R⁶，其中R⁵和R⁶为 烷基或被取代的烷基。R⁵和R⁶可能相同或可能不同且可形成环结构。 例如，R⁵和R⁶可为(CH₂CH₂O)_nX或CH(CH₂OX)₂、C(CH₂OX)₃，其中 n为1-6的整数且X为氢、甲基或乙基。在其他实施例中，R⁵和R⁶可来自环结构，诸如被取代的哌啶、哌嗪或吗啉。

在各实施方案中，R²和-SO₂R⁴通过苯环和烯属取代基的π双键 轨道共轭，由此为电子提供从给电子基团流动到吸电子基团的清晰路 径。

与BMB和BDB相比较，该共轭和从R²到R³以及从R²到-SO₂R⁴的“推-拉电子流动”可负责荧光期间较长波长的斯托克斯位移(Stokes  shift)。在应用中，当使用式I的试剂时，这可允许髓鞘质与周围组织 之间的对比度增强。

在一些实施方案中，与髓鞘碱性蛋白特异性结合的试剂可为放射 性同位素、¹³C富集的化合物或¹⁹F-标记的衍生物。在一些实施方案 中，所述式I化合物的放射性同位素衍生物可以制备并通过放射成像 实现成像。或者，可制备¹³C富集的式I的化合物或¹⁹F-标记的式I 的衍生物。

包括式I的化合物、¹³C富集的式I的化合物、¹⁹F-标记的式I的 衍生物或式I的放射性同位素衍生物的试剂可通过其发射信号(诸如 来自式I的放射性同位素衍生物的磁共振信号或发射辐射、自体荧光 发射或试剂的光学性质)检测。检测包括式I的化合物、¹³C富集的式 I的化合物、¹⁹F-标记的式I的衍生物或式I的放射性同位素衍生物的 方法可包括荧光显微术、激光共焦显微术、交叉极化显微术、核闪烁 扫描术、正电子发射断层摄影(“PET”)、单光子发射计算机断层摄影 (“SPECT”)、磁共振成像(“MRI”)、磁共振波谱学(“MRS”)、计算机断 层摄影(“CT”)或其组合，这取决于预期用途和医学或研究人员可采取 的成像方法。

例如，在某些实施方案中，为了MRI成像的目的，在式1中， R³等于-SO₂R⁴，R⁴可为氟烷基，诸如-CF₃、-CH₂CF₃或-OC(CF₃)₃。在 其他实施例中，R⁴可为-(CH₂CH₂O)_nQ或CH₂CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_mQ， 其中n为1-5的整数，m为0-4的整数，且Q为CH₂CF₃、CH(CF₃)₂或C(CF₃)₃。

类似地，在R⁴可为仲胺或叔胺以形成磺酰胺的情况下，所述胺 基可被氟烷基取代。在某些实施方案中，R⁴可为NHR⁵或NR⁵R⁶，其 中R⁵和R⁶可能相同或可能不同且等于-CH₂CF₃或-(CH₂CH₂O)_nQ，其 中n为1-6的整数且Q等于CH₂CF₃、CH(CF₃)₂或C(CF₃)₃。NR⁵R⁶也 可形成环结构，诸如氟烷基或氟烷氧基取代的哌啶、哌嗪或吗啉。

对于使用PET成像的成像方法，¹⁸F放射性同位素可通过其R¹、 R²、R³或R⁴取代基结合到式I中。在某些实施方案中，对于在MRI 成像中使用的¹⁹F-标记的衍生物来说，¹⁸F放射性同位素可结合到如以 上实施例中所述的R⁴取代基中。

所述的成像方法可适用于与髓鞘碱性蛋白检测有关的分析、诊断 或预测应用。所述应用可特别适用于手术中的神经标记、脊椎成像、 脑组织成像、非侵入性体内测量髓鞘形成水平和针对髓鞘形成的功能 和过程的研究的临床前和基础神经科学试验研究及髓鞘质的功能障 碍和修复。

在一个实施方案中，与髓鞘碱性蛋白特异性结合的试剂可在手术 之前对手术受试者肠胃外施用，使得试剂与髓鞘碱性蛋白结合且可从 不含髓鞘碱性蛋白的组织中清除。在另一实施方案中，所述试剂可通 过在手术期间涂覆、喷雾或局部注射到术野而直接应用，允许与所存 在的髓鞘碱性蛋白结合且手术部位通过灌洗洗涤以从所述部位清除 未结合的组合物。在手术期间，可对术野应用调到试剂的光谱激发特 征的光源。可通过调到试剂的光谱发射特征的滤光器观察所述试剂。 由于其与荧光剂的特异性结合，可区别神经和其他含髓鞘质组织与不 含髓鞘碱性蛋白的组织。这使得外科医师能够通过避免组织发荧光而 避免不注意地切割或损坏有髓组织，或便于对目标有髓组织准确地施 用治疗。在某些实施方案中，所述试剂包括式I化合物。

与髓鞘碱性蛋白特异性结合的试剂可在手术之前或在靶向神经 或其他含髓鞘质组织的治疗(诸如药物或手术神经阻滞)之前肠胃外施 用到受试者。在某些实施方案中，所述有髓组织可为脊椎管和椎间孔 的一部分。在其他实施方案中，所述有髓组织可为脑的一部分。在某 些实施方案中，所述试剂包括式I化合物、¹³C富集的式I的化合物、 ¹⁹F-标记的式I的衍生物或式I的放射性同位素衍生物。

在一个实施方案中，试剂(诸如包括式I化合物、¹³C富集的式I 的化合物、¹⁹F-标记的式I的衍生物的试剂)可在手术之前肠胃外施用 到手术受试者以容许与髓鞘碱性蛋白结合且在不消除特异性髓鞘碱 性蛋白结合的情况下从不含髓鞘碱性蛋白的组织清除。

在另一实施方案中，试剂(其为放射性同位素且与髓鞘碱性蛋白 特异性结合)可在治疗之前肠胃外施用到受试者以允许结合并从不含 髓鞘质的组织中清除。成像技术(诸如核闪烁扫描术、PET、SPECT、 CT、MRI、MRS或其任何组合)随后可用以帮助辨别含髓鞘质组织与 不含髓鞘质组织且可使用γ照相机、扫描仪或探针。所述试剂可为式 I化合物的放射性同位素衍生物。

在另一实施方案中，试剂(诸如包括式I的放射性同位素衍生物 的化合物)可肠胃外施用到怀疑患有脊椎病变或确定患有脊椎病变的 患者，所述脊椎病变诸如但不限于脊髓压迫症、脊神经根压迫症或椎 间盘突出。在与脊椎髓鞘碱性蛋白结合并在不消除特异性髓鞘碱性蛋 白结合的情况下从不含髓鞘碱性蛋白的组织中清除之后，脊椎可使用 诸如PET、SPECT或其任何组合的放射性同位素成像体内成像。

通过检查诊断性图像，临床医师可确定脊髓或相关神经根是否诸 如被脊柱或异物侵害及被侵害的脊髓或相关神经根在哪里。诸如CT 或MRI的另外扫描也可以结合PET或SPECT扫描进行以提供诸如脊 柱的元件的结构和相对定位的另外信息。在一个实施方案中，该方法 可应用到手术程序以使脊椎区手术中成像。

在另一实施方案中，髓鞘形成水平通过使与髓鞘碱性蛋白特异性 结合的试剂的放射性同位素衍生物体内成像获取。试剂肠胃外施用到 诊断患有或怀疑具有髓鞘质相关神经病的受试者。在与髓鞘碱性蛋白 结合并在不消除特异性髓鞘碱性蛋白结合的情况下从不含髓鞘碱性 蛋白的组织中清除之后，中枢或外周神经系统的部件可通过适于放射 性同位素体内成像的方法成像。这类方法包括PET和SPECT。通过 检查成像结果，临床医师可确定髓鞘形成量，这点通过由试剂的放射 性同位素衍生物发射并通过成像方法检测的信号的水平和解剖学定 位反映。在某些实施方案中，所述试剂为式I化合物的放射性同位素 衍生物。

为了确定患者体内髓鞘形成是否可能不足，可将其髓鞘形成水平 与认为或已知未患髓鞘质相关神经病的受试者所表现出来的髓鞘形 成水平作比较。在另一实施方案中，可确定脱髓鞘或髓鞘再生的速率。 在用认为或预期预防或减缓患有髓鞘质相关神经病的患者体内脱髓 鞘或促进髓鞘再生的已知或提出的治疗剂治疗之后，髓鞘形成水平通 过对用所述治疗剂治疗的患者随时间执行成像来评估。所述成像可在 不同的时间点进行且比较在一个时间点的髓鞘形成水平与在另一时 间点的髓鞘形成水平。

提示髓鞘质相关神经病的阳性结果可为如下结果：其中与对照样 品中的髓鞘碱性蛋白的基线测定相比受试者的髓鞘碱性蛋白的降低 在统计上为显著的。所述对照样品可得自未患髓鞘质相关神经病的类 似样品或得自随时间进行测量的同一受试者。

在又一实施方案中，可使活检哺乳动物组织样品或体外培养的组 织样品与特异性结合髓鞘碱性蛋白的试剂接触。所述试剂可包括式I 的化合物、¹³C富集的式I的化合物或¹⁹F-标记的式I的衍生物。与所 述试剂接触可用以确定所述组织样品中髓鞘碱性蛋白的定位、存在或 量。组织样品可从已在实验上控制以充当髓鞘质相关神经病的证实或 声称的模型或已接收经证实或声称用于髓鞘质相关神经病的治疗的 至少一种治疗剂的受试者取样。所述治疗剂可与目标在于研究髓鞘形 成的功能和过程及髓鞘质的功能障碍和修复的临床前评估或基础神 经科学研究相关。

可使活检或培养的组织切片的新鲜冷冻的恒冷箱切片或者固定 或包埋的切片或样品与特异性结合髓鞘碱性蛋白的试剂接触。所述样 品可使用诸如显微切片机、振动切片机或恒冷切片机制备的各种切片 技术制备。所述试剂可包括式I的化合物、¹³C富集的式I的化合物或 ¹⁹F-标记的式I的衍生物。

在与髓鞘碱性蛋白结合之后，样品可在不消除对髓鞘碱性蛋白的 特异性结合的情况下以适于从样品中除去任何未结合和非特异性结 合的标记的方式和介质洗涤。

许多检测、可视化或定量技术(包括但不限于荧光显微术、激光 共焦显微术、交叉极化显微术、自动射线摄影术、MRI、MRS或其 他适用方法或其任何组合)中的任一种随后可用以评价组织样品中对 髓鞘碱性蛋白具有特异性结合的试剂的存在或量且可代表髓鞘碱性 蛋白的存在或量。在某些实施方案中，所述试剂可包括式I的化合物、 ¹³C富集的式I的化合物或¹⁹F-标记的式I的衍生物。用所述试剂标记 和所述试剂的检测、可视化或定量也可以结合用特异性结合除髓鞘碱 性蛋白以外的物质的至少一种其他化合物的标记和所述至少一种其 他化合物的检测、可视化或定量来进行。

实施例

给出以下非限制性实施例且它们描述本发明的各种实施方案。

实施例1：制备神经组织切片

从雄性Sprague Dawley大鼠或雄性CD-1小鼠中收获包括坐骨神 经、股骨神经、臂丛神经、三叉神经、视神经和阴茎神经的各种神经。 组织通过用福尔马林灌注和/或后固定来固定。在后固定之后，将组 织在于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备的20％蔗糖溶液中超低温保护。 随后使用在OCT介质中的甲醇和干冰将神经快速冷冻。在一些情况 下，使用PVDF膜来帮助保持神经立在OCT介质中。在Leica显微 切片机上切薄切片(5-10μm)且在用抗体或小分子化合物染色之前保 存在-80℃的冷冻器中。

实施例2：通过抗体进行神经组织切片的组织评估

将一些神经用苏木素和伊红染色以鉴别基本神经形态。对于一组 髓鞘蛋白，将神经的系列切片染色，所述髓鞘蛋白包括髓鞘碱性蛋白 (MBP)、髓鞘蛋白零(MPZ)、髓鞘质相关糖蛋白(MAG)和外周髓鞘蛋 白22(PMP22)和雪旺氏细胞蛋白2′，3′-环状核苷酸3′-磷酸二酯酶 (CNPase)和S100。在表I中示出抗体供应商、目录号和稀释度。神经 在自动Ventana Discovery XT免疫染色器(Roche)上染色。将非石蜡组 织在细胞调适溶液(Cell Conditioning Solution)CC1(Ventana)中预处 理。随后将载玻片在10％血清中阻断(物质通过二次抗体的宿主测定)。 一次抗体和二次抗体经应用手册应用且在加热(37℃)下在免疫染色器 中培育1小时，在期间进行漂洗。随后将载玻片从免疫染色器中移出 并在Dawn洗碗液中漂洗以从载玻片上除去矿物油。载玻片随后通过 Vectashield^TM封固剂盖上盖玻片。所有二次抗体都购自Jackson  ImmunoResearch实验室且为Cy3或Cy5缀合的并以1∶200的稀释度 使用。在盖上盖玻片之后，使用对于各二次抗体设定的适当过滤器将 载玻片在Zeiss Axioimager显微镜上以20X成像。

表I：在神经表征中使用的抗体

实施例3：测量小分子荧光团的光学性质

将荧光团试剂溶解在二甲亚砜(DMSO)中以制备10mM储备溶 液。取出等分试样以制备在甲醇、水或DMSO中的10nm-1μM的荧 光团溶液。进行这三种溶剂的光学测量。使用Perkin Elmer Lambda 20 UV/VIS光谱仪测量吸收光谱。使用PTI稳态荧光计产生发射光谱。

实施例4：通过荧光团进行神经的离体染色

将荧光团溶解在DMSO中以制备10mM储备溶液。将含有神经 组织切片的载玻片用PBS漂洗3次。将组织切片用在PBS或99μL DMSO、100μL克列莫佛(cremaphor)、600μL大鼠血清和200μL PBS 的混合物中稀释的各荧光团的10μL溶液培育20分钟。随后将载玻 片用PBS洗涤3次，每次5分钟，盖上Vectashield盖玻片且在Zeiss  Axioimager显微镜上以200X放大率成像。使用常规过滤器方盒 (cube)(激发滤器：387nm，11nm带通，409nm二向色镜；发射滤器： 409nm长通)来收集图像用于检查形态并用于图像分析。

还进行用荧光团和各种髓鞘质抗体对神经共同染色。这些载玻片 使用如上所述的相同流程(具有一些改变)在Ventana Discovery XT上 染色。将荧光团直接加到一次抗体溶液中，最终荧光团浓度为10μM 和最终抗体稀释度见表1。载玻片使用Zeiss Axioimager显微镜以20X 成像且分析如下：在所有情况下使用原始标记图像格式图像。在表示 荧光团通道的各图像内，绘出表示含神经组织、相邻组织和没有组织 的区的数个圆形目标区域。所有目标区域的尺寸相同，且表示图像的 所有区。在二次抗体通道中绘出相同的共同定位的目标区域。相对于 彼此绘制来自各目标区域的平均通道信号强度。在X轴上绘制二次抗 体通道且在Y轴上绘制试剂通道。随后计算回归系数。

实施例5：分离来自大鼠脑中的天然髓鞘碱性蛋白

使用来自大鼠脑的纯化的髓鞘碱性蛋白来进一步评估荧光团结 合。使用自Cell Biology(细胞生物学)(2006)3.25.1-3.25.19中的现有流 程的改进程序分离粗髓鞘质。根据来自NeuroReport 5(994)689-692 的流程进行从粗髓鞘质中分离天然髓鞘碱性蛋白。简短地讲，将3个 来自雄性Sprague Dawley大鼠的大鼠脑解剖，置于72ml 0.30M的冷 蔗糖溶液中，切块并均质化。将组织匀浆在等体积的0.83M蔗糖溶液 上分层，在4℃下以75,000g进行超速离心分离30分钟，且在两种蔗 糖溶液的界面处收集粗髓鞘质。

收集的髓鞘质部分通过在Tris-Cl缓冲液(含有20mM Tris-Cl(pH 7.45)、2mM乙二胺四乙酸钠、1mM二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂混合 物)中均质化来进行渗压震扰。另外加入Tris-Cl到最终体积为228ml。 将悬浮液在4℃下以75,000×g离心分离15分钟。使沉淀再进行两次 均质化和在4℃下以12,000g的超速离心分离，每次15分钟。使沉淀 再悬浮在72ml的0.3M蔗糖溶液中。使等体积的0.83M蔗糖溶液在 再悬浮的沉淀上分层且使整个样品在4℃下以75,000g进行超速离心 分离30分钟。从界面处收集纯化的髓鞘质且使其再悬浮在228ml Tris-Cl缓冲液中。通过在Tris-Cl缓冲液中另外均质化并如上所述离 心分离进行过量蔗糖的冲洗。

使髓鞘质沉淀再悬浮在5体积的缓冲液1(含有冷500mM NaCl/20mM Tris-HCl/2mM β-巯基乙醇，pH 8.5)历时30分钟，且随后 在JA20上以15,000rpm离心分离20分钟。将这重复两次。使沉淀溶 解到2％CHAPS溶液中，在冰上培育30分钟，随后在Beckman 42.1 转动体上以40,000rpm离心分离45分钟。将CHAPS提取物装载到用 1％CHAPS溶液预平衡的羟基磷灰石柱(1.6×5cm)上。使脂质结合的 MBP在未吸附的通过部分中洗脱。所述通过部分使用Amicon filter YM3浓缩。将浓缩物装载到用缓冲液2(含有1％CHAPS、20mM  Tris-Cl(pH 8.5)、1mM β-巯基乙醇、1mM二硫苏糖醇、0.5mM EDTA、 0.5mM EGTA、1mM 1，10-菲咯啉、1mM乙酸锌)预平衡的光谱凝胶 AcA 44凝胶过滤柱上。将脂质结合的MBP浓缩，使用50％硫酸铵盐 析，冷冻干燥并在氮气下在4℃下储存。使样品进行标准变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳和Western印迹(Western blot)。用于凝胶电泳的试剂和 标准物得自Invitrogen。将市售的小鼠MBP(Sigma)用作对照物。

实施例6：荧光团与分离的天然髓鞘碱性蛋白的结合

Spectramax荧光测定：将0.5nmol的荧光团移液到低荧光96孔 板中。使用Spectramax M5多模态读板器(Molecular Devices)，扫描吸 光度以及当在峰值吸收波长下激发时的发射性质。牛血清蛋白和天然 MBP各自以0.5nmol(1当量)和2nmol(4当量)加到荧光团中，并再次 测量荧光团的吸收性质和发射性质。

Bligh-Dyer萃取：将天然MBP的冷冻干燥样品以1mg/mL的浓 度重构到在20mM Hepes(pH 7.4)中缓冲的0.5％CHAPS中。使用 Bligh-Dyer萃取法从该蛋白质的400μL样品中萃取脂质。简短地讲， 向各200μL蛋白样品中加入750μL氯仿∶甲醇(1∶2，v∶v)且充分涡旋样 品。随后，加入250μL氯仿且使样品涡旋。接着，加入250μL蒸馏 水且使样品再次涡旋，接着以1000g离心分离旋转5分钟。收集底部 部分(脂质部分)且将其在氮气下干燥，之后将其重构到适当缓冲液中 用于实验。在如上所述的Spectramax荧光测定中测试脂质部分以排除 试剂与MBP的脂质组分的特异性结合。

实施例7：体内成像

将圈养在符合AAALAC的设施中的CD-1小鼠(25-40g)称重且通 过引发并维持在2.5％异氟醚下麻醉。将动物的背部置于热垫上。用 一个手紧紧握住皮肤，同时用装有30号针头的300μl注射器腹腔内 或静脉内(仅制剂II)注射在制剂1(100％DMSO且以10,000g离心分 离20分钟)或制剂2(10％DMSO、5％Chremophor EL^TM、在磷酸盐缓 冲盐水中的75％小鼠血清，以10,000g离心分离20分钟)中的 50μMole/kg的试剂。允许动物从麻醉中恢复并假设正常活动4小时。 那时，随后它们通过引发且保持在2.5％异氟醚下麻醉。将它们用100μl Fatal Plus(戊巴比妥(pentobarbital))如上注射。到达腹腔和腹部。切断 下腔静脉且经心脏穿刺以约1毫升/分钟输注12ml磷酸盐缓冲盐水， 接着输注12ml磷酸盐缓冲福尔马林。使关键神经暴露并使用装有对 于荧光团适合的滤波器组的Zeiss Lumar V.12手术显微镜成像。

在一些情况下，根据体内成像进行神经组织切片的离体组织评 估。将关键神经切除，在4℃下用福尔马林后固定过夜，且随后在于 磷酸盐缓冲盐水中制备的20％蔗糖溶液超低温保护。随后使用在OCT 介质中的甲醇和干冰将神经快速冷冻。在Leica显微切片机上切薄切 片(5-10μm)且在用抗体染色之前保存在-80℃的冷冻器中。用于用抗体 染色的程序如上所述。

实施例8：合成式I-IV的中间体

合成各种化合物且测试对含髓鞘质的体外或体内样品的特异性 结合。所述化合物基于表II中所示的取代基样式分类。使用BMB和 BDB来比较结合和光学性质。

表II

如所示，式Ia和Ib具有优选的结构。式Ia表示如下结构，其中 R²为在相对于OR¹基团的邻位的完全共轭的取代基上的给电子基团。 R³为在相对于OR¹基团的间位且相对于R²取代的基团的对位的完全 共轭的取代基上的吸电子基团。

式Ib为其中给电子基团的位置和吸电子基团的位置颠倒的化合 物，其中R²为在相对于OR¹基团的间位的完全共轭的取代基上的吸 电子基团。R³为在相对于OR¹基团的邻位且相对于R²取代的基团的 对位的完全共轭的取代基上的给电子基团。

式III表示具有两个给电子基团的化合物。式IV表示具有两个吸 电子基团的化合物。

未端氨基部分的引入通过使用根据以下流程制备的新结构单元 (building block)4-叔丁氧基甲酰氨基苄基膦酸酯进行。

Horner-Wittig烯化的通用方法：向含有醛和膦酸酯(各1当量官 能团)的干燥小瓶中加入干燥四氢呋喃(5ml/mmol，相当于0.2M反应 物浓度；对于双官能底物，在反应过程中后来可能需要另外的THF 以溶解所得磷酸二乙酯钾)。随后加入叔丁醇钾(1.2当量/膦酸酯基团) 且在N₂下将混合物加热到60℃且通过GC-MS或LC-MS监测。在这 些条件下在1.5小时内完成大多数反应。随后将反应混合物使用旋转 蒸发仪浓缩，用盐水稀释且用二氯甲烷萃取。将干燥的萃取物浓缩， 使粗产物吸附在硅胶上且通过MPLC用己烷-乙酸乙酯、己烷-二氯甲 烷或二氯甲烷-甲醇梯度纯化。

4-氨基苄基膦酸二乙酯：向4-硝基苄基膦酸二乙酯(283mg， 1.03mmol)在丙酮-水(2.9ml/0.6ml)中的溶液中加入锌粉(270mg，4当 量)，接着加入氯化铵(330mg，6当量)。使反应物升温到约45℃，随 后在15分钟内回到室温。GC-MS表明30分钟完全转化。加入氢氧 化铵(2ml，25％)和乙酸乙酯(3ml)，用盐水(3ml)洗涤混合物且分离有 机层。用EtOAc萃取水层两次，干燥合并的有机层且在减压下除去 溶剂。将橙色油在20毫托和30℃下干燥1小时，之后用于下一步。

4-叔丁氧基甲酰氨基苄基膦酸二乙酯：向4-氨基苄基膦酸二乙酯 (0.499g，2.05mmol)在含水THF(6.5ml THF/1.6ml水，80/20v/v)中的 溶液中加入叔丁氧基羰基酸酐(495mg，1.1当量)和碳酸氢钠(258mg， 1.5当量)。在室温下搅拌混合物20小时。加入盐水(5ml)且将混合物 用EtOAc萃取，干燥且通过MPLC(己烷/乙酸乙酯45-100％)纯化。 LC-MS(ESI⁺)：366(M+Na⁺)；385(M+CH₃CN+H⁺).¹H-NMR(CDCl₃)： 1.23(t，J＝12Hz，6H)；1.52(s，10H)；3.12(d，J＝75Hz，2H)；4.04td，J＝7Hz， 0.8Hz，4H)；6.58(brs，0.85H)；7.22(dd，J＝6Hz，0.8H，2H)；7.36(d，J＝6Hz， 2H)。

4-溴-2-甲氧基苯甲醛二甲基乙缩醛：向4-溴-2-甲氧基苯甲醛 (5.2g，24.2mmol)在甲醇(20ml)和原甲酸三甲酯(14ml，5.5当量)中的 溶液中加入对甲苯磺酸(46mg，0.01当量)且将混合物回流3小时。加 入碳酸钾(125mg，0.03当量)和硅胶，在减压下除去溶剂且将固体残 余物装入装载柱中且通过MPLC(己烷-乙酸乙酯40-80％梯度)纯化。 MS(EI⁺)：262，260(1/1，M⁺，10％)；231，229(1/1，90％)；215，213(1/1， 10％)；199，170，150，118，92，75，45(100％)。

4-甲酰基-2-甲氧基苯甲醛二甲基乙缩醛：在-30℃下向上述芳基 溴(5.99g，22.9mmol)在干燥乙醚(65ml)中的溶液中加入痕量的1，10- 菲啉，接着加入n-BuLi在己烷中的2.6M溶液。在加入1.2ml后，如 由橙-粉红色着色所指示所有水分都已用尽。此时，加入10ml n-BuLi 溶液(1.09当量)，将混合物温热到0℃且在该温度下搅拌45分钟。将 浅粉红-橙色悬浮液冷却到-78℃且用逐滴加入的N-甲酰基哌啶(5ml， 1.95当量)处理。使混合物温至室温并在20℃下搅拌1小时。加入水 且将有机层用水洗涤3次且用盐水洗涤1次。将含水废物用乙醚萃取 且将合并的有机层干燥并在减压下浓缩以接近定量产率给出所需产 物，纯度99％(GC-MS)。MS(EI⁺)：210(10％，M⁺)；179(100％)；163，135， 119，91，75，45(90％)。

(E)-4-(4-(二甲氧基甲基)-3-甲氧基苯乙烯基)苄腈：向含有在THF (12ml)中的4-甲酰基-2-甲氧基苯甲醛二甲基乙缩醛(452mg，2.15mmol) 和二乙基膦酸4-氰基苄酯(545mg，1当量)的干燥小瓶中加入叔丁醇 钾(290mg，1.2当量)。混合物变为绿色且在室温下在10分钟内变成 胶状。将混合物温和回流10分钟，用盐水稀释且用乙酸乙酯萃取。 将溶液干燥且使粗产物通过具有EtOAc的硅胶SPE滤心。MS(EI⁺)： 309(12％，M+)；278(100％)；262，234，219，204(15％)，190(20％)，165， 139，75，45(95％)。

(E)-4-(4-甲酰基-3-甲氧基苯乙烯基)苄腈：向(E)-4-(4-(二甲氧基甲 基)-3-甲氧基苯乙烯基)苄腈(70mg，0.227mmol)在含水THF(5ml水 /25ml THF)中的溶液中加入对甲苯磺酸(1mg，0.02当量)且将混合物 回流30分钟。将混合物在减压下浓缩，用EtOAc萃取(3X)，干燥且 将溶剂在真空中除去以给出所需产物，纯度99％(GC-MS)。MS(EI⁺)： 263(100％，M+)；246(40％)，232，216，203(60％)，190(65％)，176，140， 88。

合成式Ia化合物

4-(4-(4-氰基苯乙烯基)-2-甲氧基苯乙烯基)苯基氨基甲酸叔丁酯： 向干燥小瓶中加入(E)-4-(4-甲酰基-3-甲氧基苯乙烯基)苄腈(142mg， 0.54mmol)、叔丁氧基甲酰氨基苄基膦酸二乙酯(223mg，1.2当量)和 干燥四氢呋喃(3ml)。在手套箱中，加入固体叔丁醇钾(91mg，1.5当 量)且使混合物回到通风柜中并加热到60℃历时90分钟。将混合物用 盐水稀释，用EtOAc萃取，干燥且通过MPLC(己烷/乙酸乙酯)纯化。 产量：224mg(92％)。MS(ESI⁺)：452(M⁺)；475(M+Na⁺)；495(M+ CH₃CN+H⁺)。

4-(4-(4-氨基苯乙烯基)-3-甲氧基苯乙烯基)苄腈)，(式Ia，R¹＝ CH₃，R²＝NH²，R³＝CN)：向4-(4-(4-氰基苯乙烯基)-2-甲氧基苯乙烯 基)苯基氨基甲酸叔丁酯(27.4mg，60.6mmol)在二氯甲烷(4.8ml)中的溶 液中加入三氟乙酸(1.2ml)且将混合物在室温下搅拌3小时。将溶剂在 减压下除去且用碳酸氢钠溶液中和并用EtOAc萃取。粗产物通过 MPLC(在二氯甲烷中的1％三乙胺，0-2.5％梯度甲醇)纯化以给出所需 染料，经LC-MS检测纯度＞98％(LC-MS)。MS(ESI⁺)：352(M⁺)；353 (M+H⁺)；394(M+CH₃CN+H⁺).¹H-NMR(丙酮-D6)：3.97(s，3H)； 4.8-4.95(br s，1H)；5.67(d，J＝20Hz，1H)；6.70(dd，J＝4Hz，0.4Hz，2H)； 7.14-7.40(m，8H)；7.76-7.83(m-q-样，4H)。

合成4-(4-(4-氨基苯乙烯基)-3-甲氧基苯乙烯基)苯甲酸甲酯(式 Ia，R¹＝CH₃，R²＝NH₂，R³＝CO₂Me)。

4-甲氧羰基苄基膦酸二甲酯：将甲基苯甲酸4-溴甲酯(2.29g， 10mmol)和亚磷酸三甲酯(5.9ml，5当量)的混合物加热，同时在100℃ 下搅拌1.5小时。在减压下除去过量亚磷酸酯且将残余油(纯度99％， GC-MS)在不进一步纯化的情况下用于下一步。MS，m/e：258(M⁺， 50％)；227(60％)；198(90％)；162(35％)；149(100％)；121(42％)； 118(40％)；109(58％)；90(50％)。

(E)-4-(4-(二甲氧基甲基)-3-甲氧基苯乙烯基)苯甲酸甲酯：该化合 物根据通用Horner-Wittig方法由4-甲酰基-2-甲氧基苯甲醛二甲基乙 缩醛(630mg，3mmol)、4-甲氧基羰基苄基膦酸二甲酯(775mg，1当量) 使用tBuOK(404mg，1.2当量)作为碱在无水THF(15ml)中制备；将 混合物在70℃下加热90分钟，随后如先前所述处理且通过MPLC用 己烷/乙酸乙酯0-30％梯度纯化。产量：795mg(76％)。MS，m/e：342(M⁺) 15％；311(M⁺-MeO，100％)；294(5％)；234(4％)；164(12％)；139 (10％)。

(E)-4-(4-甲酰基-3-甲氧基苯乙烯基)苯甲酸甲酯：该化合物根据 对于(E)-4-(4-甲酰基-3-甲氧基苯乙烯基)苄腈的合成所述的程序通过 (E)-4-(4-(二甲氧基甲基)-3-甲氧基苯乙烯基)苯甲酸甲酯的酸水解，因 此在于6ml THF/1.5ml水溶液中的1.7mg三氟甲磺酸吡啶盐存在下 由258mg乙缩醛(0.75mmol)制备，回流30分钟并冷却后以接近定量 产率获得作为长松散针状物的所需产物(220mg)。MS，m/e：296(M+， 100％)；264(15％)；234(35％)；164(45％)；138，114，82(6％)。

4-(4-(4-甲氧基羰基苯乙烯基)-2-甲氧基苯乙烯基)苯基氨基甲酸 叔丁酯：向干燥小瓶中加入(E)-4-(4-甲酰基-3-甲氧基苯乙烯基)苯甲酸 甲酯(222mg，0.75mmol)、叔丁氧基甲酰氨基苄基膦酸二乙酯(262mg， 1.02当量)和干燥四氢呋喃(4ml)。在手套箱中，加入固体叔丁醇钾 (101mg，1.2当量)且使混合物回到通风柜中并加热到70℃历时90分 钟。将该混合物用盐水稀释，用EtOAc萃取，干燥且通过MPLC(己 烷/乙酸乙酯-10％二氯甲烷，5-80％梯度)纯化。产量：300mg(82％)。 MS(ESI⁺)：485(M⁺)；508(M+Na⁺)；549(M+CH₃CN+Na⁺)。

4-(4-(4-氨基苯乙烯基)-3-甲氧基苯乙烯基)苯甲酸甲酯(式I，R¹＝ CH₃，R²＝NH₂，R³＝CO₂CH₃)：向4-(4-(4-甲氧基羰基苯乙烯基)-2- 甲氧基苯乙烯基)苯基氨基甲酸叔丁酯(300mg，0.62mmol)在用42ppm 戊烯(48ml)稳定的二氯甲烷中的溶液中加入三氟乙酸(12ml)且将混合 物在室温下搅拌45分钟。在减压下除去溶剂且将残余物吸收到二氯 甲烷中，用碳酸氢钠溶液中和且用二氯甲烷萃取水相。经Na₂SO₄干 燥有机相且在减压下除去溶剂，给出所需染料，纯度＞98％(LC-MS)。 MS(ESI⁺)：386(M+H⁺)；427(M+CH₃CN+H⁺)。

合成式Ib化合物

(E)-4-(4-(二甲氧基甲基)-3-甲氧基苯乙烯基)苯基氨基甲酸叔丁 酯：在手套箱中向含有在THF(10ml)中的4-甲酰基-2-甲氧基苯甲醛 二甲基乙缩醛(408mg，1.93mmol)和4-叔丁氧基甲酰氨基膦酸二乙酯 (668mg，1当量)的干燥小瓶中加入叔丁醇钾(265mg，1.2当量)。将混 合物在N₂下密封，加热到70℃且在该温度下搅拌1小时。向冷却的 混合物中加入三乙胺(0.5ml)，将粗产物用乙酸乙酯稀释且吸附在硅胶 上。产物乙缩醛通过MPLC使用己烷/乙酸乙酯10-60％梯度纯化。 MS(ESI+)：422(M+23，M+Na⁺)。产量：451.4mg(66％)。

(E)-4-(4-甲酰基-3-甲氧基苯乙烯基)苯基氨基甲酸叔丁酯：向乙 缩醛(451.4mg，1.13mmol)在THF/H₂O(6.6ml 80/20v/v，5.3ml THF/1.3ml H₂O)中的溶液中加入催化量的三氟甲磺酸吡啶盐 (2.6mg，0.01当量)且将混合物加热到60℃历时30分钟。此时的 LC-MS(水/乙腈，0.1％甲酸铵)表明在没有损失Boc基团的情况下完全 转化。粗混合物在减压下吸附在硅胶上且通过MPLC(氧化硅)20-60％ B梯度纯化，其中溶剂A为己烷且溶剂B为在乙酸乙酯中的10％ CH₂Cl₂。产量：319.1mg(46.8％)。H-NMR(丙酮-D6)：1.52，(s，9H)；4.06 (s，3H)；7.24(1H，d，J＝16Hz)；7.31(1H，d，J＝6Hz)；7.42-7.48(m，2H)； 7.62(4H，dd，J＝15，6Hz)；7.74(1H，d，J＝6Hz)；8.58(s，1H)；10.42(s， 1H)。

4-(4-(4-氰基苯乙烯基)-3-甲氧基苯乙烯基)苯基氨基甲酸叔丁酯： 向干燥小瓶中加入(319.1mg，0.903mmol)、4-氰基苄基膦酸二乙酯 (233mg，1.02当量)和干燥四氢呋喃(4.7ml)。在手套箱中，加入固体 叔丁醇钾(121.5mg，1.2当量)且使混合物回到通风柜中并加热到60℃ 历时75分钟。将粗混合物用乙酸乙酯稀释，吸附在硅胶上且通过 MPLC用己烷(A)/乙酸乙酯-10％二氯甲烷(B)，20-85％(B)梯度纯化以 给出作为柠檬色固体的标题化合物(384mg，94％)。MS(ESI⁺)：452(M⁺)； 475(M+Na⁺)；495(M+CH₃CN+H⁺).H-NMR(丙酮-D6)：1.51(s，9H)； 4.01(s，3H)；7.15-7.28(m，2H)；7.3-7.42(m，2H)；7.54-7.659m，4H)； 7.68-7.84(m，7H)；8.53，(s，1H)；C-NMR(丙酮-D6)：55.14，79.26， 100.81，118.26，124.37，127.12，128.96，132.45，139.64，142.82，152.73， 157.70。

4-(4-(4-氨基苯乙烯基)-2-甲氧基苯乙烯基)苄腈(式Ib，R¹＝CH₃， R²＝NH₂，R³＝CN)：向上述氨基甲酸酯(200mg，0.44mmol)在用42ppm 戊烯稳定的35ml二氯甲烷中的溶液中加入三氟乙酸(8.8ml)且将混合 物在室温下搅拌45分钟。等分样品的分析表明完全转化。将反应混 合物在减压下蒸干，将残余物吸收在二氯甲烷中，用NaHCO₃水溶液 洗涤，分离有机相且将粗产物吸附在硅胶上且通过MPLC使用己烷 (A)/二氯甲烷+1％三乙胺+1％MeOH(B)10-50％(B)梯度纯化。MS (ESI⁺)：352(M⁺)；353(M+H⁺)；394(M+CH₃CN+H⁺)。

合成式II化合物

4-(4-(4-二甲氨基苯乙烯基)-3-甲氧基苯乙烯基)苯甲酸甲酯(式I， R¹＝CH₃，R²＝N(CH₃)₂，R³＝CO₂CH₃)：向所述氨基酯(式I，R¹＝CH₃， R²＝NH₂，R³＝CO₂CH₃)(231mg，0.6mmol)在1，2-二氯乙烷(6.1ml)中 的溶液中加入甲醛(1.44ml，37％，3当量)、冰乙酸(0.34ml，10当量) 和三乙酰氧基硼氢化钠(385mg，3当量)的水溶液且将混合物在室温下 搅拌16小时。加入水(12ml)。分离有机相，用二氯甲烷萃取水相，用 硫酸钠干燥合并的有机相且在减压下除去溶剂。产量：240mg(98％)。 MS(ESI⁺)：414(M+H⁺)；455(M+CH₃CN+H⁺)。

4-(4-(4-二甲氨基苯乙烯基)-3-甲氧基苯乙烯基)苯甲酸甲酯(式 II，R¹＝CH₃，R²＝N(CH₃)₂，R³＝CH₂OH)：在0℃下向上述4-(4-(4- 二甲氨基苯乙烯基)-3-甲氧基苯乙烯基)苯甲酸甲酯(240mg，0.58mmol) 在无水THF(6ml)中的溶液中加入LiAlH₄(35mg，95％，1.5当量)且将 混合物搅拌35分钟。等分样品的分析表明完全、干净地转化为所需 产物(式III，R¹＝CH₃，R²＝N(CH₃)₂，R³＝CH₂OH)。随后在强烈搅 拌下在0℃下小心加入罗谢耳盐(Rochelle salt)的水溶液(10ml)，将混 合物用乙酸乙酯萃取，干燥且在减压下蒸发。将残余物吸附在硅胶上 且通过MPLC用己烷/乙酸乙酯30-60％梯度纯化。产量：204mg(92％)。 MS(ESI⁺)：386(M+H⁺)；427(M+CH₃CN+H⁺)。

流程1：通用合成

合成式III化合物

合成1，4-双(溴甲基)-2-甲氧基苯)：向NBS(N-溴代丁二酰亚 胺)(34.5g，190mmol)在无水CCl₄中的悬浮液中加入过氧化苯甲酰 (50mg)。将反应悬浮液在回流的CCl₄下在氮气氛下加热且搅拌过夜。 反应后面是GCMS(100μl，在2ml CH₂Cl₂中)。在加热1小时之后， 反应混合物变澄清，但GCMS表示极少转化。再次加入过氧化苯甲 酰(100mg)且另外回流13小时。随后通过GCMS分析反应物。将所 得反应物在布氏漏斗上过滤以除去丁二酰亚胺以及未反应的NBS。除 去溶剂提供浅褐色滤饼。随后将滤饼用己烷(3×200ml)洗涤。将洗涤 液合并且蒸发以提供白色非晶固体(6.83g，26％)。GCMS(m/z)：293 (M+)，213(分子离子)，133(短暂的15分钟方法，75-300℃，以20℃/ 分钟匀变历时10分钟，在300℃下保持5分钟)。

合成(2-甲氧基-1，4-亚苯基)双(亚甲基)二膦酸四乙酯：将反应设置 在7ml小瓶中且宽松地盖上以避免过压。将二苄基溴与12ml P(OEt)₃(3当量)一起引入所述7ml小瓶中。随后在加热块中在135℃下加热过 夜。GCMS表示原料完全转化。GCMS(m/z)：408(M+)，271，215，104。 (保留时间：8.9分钟)。

合成4，4′-(1E，1′E)-2，2′-(2-甲氧基-1，4-亚苯基)双(乙烯-2，1-二基)双 (硝基苯)(式III，R¹＝CH₃，R²＝R³＝NO₂)：向装有NaH(150mg， 4.17mmol)的烘干的3-颈圆底烧瓶中装入二膦酸酯(1.0g，2.45mmol) 的溶液。反应混合物首先在氮气下使用加热块和GE日光灯275W加 热。温度使用可调变压器调节到70℃。在回流16小时之后，反应通 过小心加入冰水猝灭。在真空中蒸发，接着使所得深色油重结晶提供 作为红色结晶固体的化合物(40％，410mg)。(对于0.5mmol的原料双 膦酸酯的量，获得84％的产率)。GCMS和¹HNMR证实产物的同一 性。

合成BMB：使4，4′-(1E，1′E)-2，2′-(2-甲氧基-1，4-亚苯基)双(乙烯 -2，1-二基)双(硝基苯)(1.0g，2.49mmol)、锌粉(2.87g，19.8mmol)和 NH₄Cl(1.7g)悬浮在丙酮和水的混合物(1.5L)(4∶1)中且在惰性气氛和 强烈搅拌下回流1.5小时。随后将反应混合物冷却，过滤并在真空中 缩减。通过加入小球状NaOH将pH调节到12-13(pH试纸)且随后用 EtOAc(2×300ml)和CH₂Cl₂(2×300ml)萃取。将合并的有机层在Na₂SO₄上干燥，过滤且蒸发以提供红色粘性油(2.08g)。随后BMB通过MPLC 使用己烷、乙酸乙酯和DIPEA(梯度：20-100％的EtOAc)的混合物在 SiO₂上纯化。收集对应于主峰的部分，合并并蒸发以提供红橙色固体 (650mg，72％)。¹HNMR证实BMB的同一性。

可以制备式I化合物的放射性同位素衍生物并通过放射成像实现 成像。或者，可制备¹³C富集的式I的化合物或¹⁹F-标记的式I的衍 生物。在某些实施方案中，可使用具有R¹＝CH₂CH₂OTs(其中Ts为 甲苯磺酸酯)的式I化合物作为用于¹⁸F(PET)和¹²⁴I(SPECT)放射性标 记的前体；可选择如放射性标记实践中通常已知的甲苯磺酸酯离去基 团的其他选择。另外，对于基于¹⁹F的MRI，可使用式I化合物，其 中R¹＝CF₃或C₁-C₄全氟烷基，且对于基于¹³C的MRI，可使用式I 化合物，其中R¹＝¹³C-甲基或¹³C-富集的C₁-C₄烷基。这些化合物可 根据本文所述的通用方法制备或可经由式I前体(其中R¹＝H)经亲核 烷基化获得。

或者，式I化合物的¹³C标记的衍生物可通过用¹³C-富集的碘化 甲烷或类似的C₁-C₄烷基化剂使式I化合物的氨基官能团烷基化来制 备。式I化合物的¹⁹F衍生物可通过用C₁-C₄氟或全氟烷基卤化物、 甲磺酸酯或甲苯磺酸酯使式I化合物的氨基官能团烷基化，通过与氟 乙酰基卤(诸如五氟苯基苯甲酰氯)反应以产生相应的酰胺或通过还原 胺化(其中羰基组分带有¹³C或¹⁹F部分)来制备。在其他实施方案中， 可使式I的胺部分烷基化以产生2-羟乙基衍生物，所述2-羟乙基衍生 物可经由其甲苯磺酸酯或甲磺酸酯作为前体用于¹⁸F(PET)和¹²⁴I (SPECT)放射性标记。

结果和发现

表III：所选化合物的荧光激发和发射峰

在表III中示出各种化合物的荧光激发和发射峰及相关结合。

揭示特征性神经形态的神经组织切片的苏木素和伊红染色的检 查结果可被确定。各神经或神经束表现为大圆形或大圆形组，在其内 可鉴别出较小的环形有髓轴突。神经的系列切片用不同的髓鞘质蛋白 抗体染色，且可将染色图案和形态与BMB的那些相比较。

表IV总结了免疫组织化学和BMB染色。单个+指示正染色信号， 但在抗体和BMB染色之间有不同图案。+++指示正信号和类似形态。 -指示没有染色信号。如表IV中所示，在所测试的所有不同神经中， 髓鞘碱性蛋白(MBP)与BMB的染色图案和形态最密切相关。

表IV：与BMB染色相比的神经免疫组织化学的汇总

  神经   MPZ   MBP   CNPase   S100   PMP22  MAG   BMB   脑纹状体   -   +++   +   +   +  +   +++   坐骨神经   +++   +++   +++   +++   +  +   +++   股骨神经   +   +++   -   +   +  +   +++   三叉神经   +++   +++   +   +   +  +   +++   视神经   -   +++   +++   +   +++   臂丛神经   +++   +++   -   +   +++   阴茎神经   -   +++   -   +++

图1A表示用MBP抗体对三叉神经切片的染色，而图1B表示用 BMB的三叉神经染色。用BMB的结果与用MBP抗体相同。环形结 构为有髓神经纤维。图2表示当坐骨神经和三叉神经组织切片用式Ia、 Ib、II和III的试剂的实例染色时获得的代表性图像。没有试剂的含 神经的对照载玻片(未示出)在相同成像条件下为负。如所示，与式II 和III试剂相比较，用式Ia和Ib试剂的染色增加了髓鞘碱性蛋白的可 视化。

当将所述试剂全身地注射到临床前动物模型时，体内成像揭示， 当全身施用到临床前动物模型时，所述试剂中的某些的位置局限在包 括臂丛、面神经、三叉神经、膈神经、迷走神经和视神经的多种组织 中的神经。相邻的肌肉组织具有极低本底结合。未给予荧光团的负对 照动物的神经没有荧光信号。图3表示小鼠手术模型中的三叉神经和 视神经通过式Ia(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝CN)的荧光体内成像。 试剂的体内性能是数种因素的组合，所述因素包括但不限于试剂髓鞘 质结合性质、血液神经屏障渗透、新陈代谢、血浆结合、半衰期、溶 解性和清除率。在离体测定中没有使神经组织切片染色的试剂通常不 在体内进行测试。式Ia的化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝CO₂CH₃) 和(R¹＝CH₃，R²＝NCH₃)₂且R³＝CN)在体内没有使神经染色。式Ib(R¹＝CH₃，R²＝CN且R³＝NH₂)在体内使神经染色。BMB在体内使神经 染色。式II(R¹＝CH₃，R²＝N(CH₃)₂且R³＝N(CH₃)₂)、(R¹＝CH₃，R²＝OCH₃且R³＝OCH₃)、(R¹＝CH₃，R²＝N(CH₂)₂CH₃且R³＝ N(CH₂)₂CH₃)在体内没有使神经染色。式II(R¹＝CH₃，R²＝SCH₃且 R³＝SCH₃)在注射时沉淀。式II(R¹＝CH₃，R²＝N(CH₃)₂且R³＝CH₂OH) 在体内表现出弱神经信号。

在一些情况下，在体内荧光成像后切除神经。将神经切成片用于 免疫组织化学分析。图4表示在小鼠的三叉神经上MBP信号的位置 对于荧光团BMB与式Ia(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝CN)的位置之间 的相关性。将BMB或式Ia化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝CN) 施用到活小鼠，在足够的清除和生物分布时间之后，将神经切除，切 片，随后用MBP抗体染色。图4表示在全身施用到动物的荧光团与 离体施用在神经切片上的MBP抗体之间的强烈共定位 (co-localization)。对于式Ia(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝CN)，在荧光 团染色与MBP抗体染色之间的相关系数为0.953，这强烈支持该试剂 靶向髓鞘碱性蛋白的说法。

将天然髓鞘碱性蛋白从大鼠脑中纯化且用于生物化学测定中。天 然MBP改变BMB和式Ia化合物(其中R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝CN) 的荧光性质，表明荧光团与MBP之间的密切相互作用。图5表示BMB 和式Ia化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝CN)二者的激发和发射性 质在与天然MBP结合时增强。与BMB相比，在式Ia化合物(R¹＝ CH₃，R²＝NH₂且R³＝CN)中的增强作用显著得多。通过苯环和烯属 取代基的π双键轨道的共轭可提供电子从给电子基团R²贯穿式I流到 给电子基团R³的路径。该电子流可对荧光信号的更显著增强作出贡 献。

为了排除荧光团与和天然MBP相关的脂质相互作用的可能性， 根据Bligh-Dyer方法使用氯仿∶甲醇萃取从天然MBP中萃取脂质 (Biochimie，1977，59，487-96)。随后将萃取的脂质用于用Spectramax M5微板读数器的生物化学测定中以确定是否将观察到在式Ia化合物 (R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝CN)的荧光性质方面的类似增强。图6表 示式Ia化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝CN)的荧光发射仅在天然 MBP存在下而不是在萃取的脂质或BSA(牛血清蛋白)存在下增强。结 果表明该试剂与髓鞘碱性蛋白组分特异性结合而不与脂质组分特异 性结合。

合成式I化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CH₃)

式I化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CH₃)根据流程2中 给出的转化制备。在美国专利申请第12/478300号中已经描述了醛3 和膦酸酯5的制备。

流程2.合成式I化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CH₃)

4-甲基磺酰基苄基膦酸二乙酯2b：

将4-甲磺酰基苄基溴2a(1g，4mmol)在亚磷酸三乙酯(2.8ml， 16mmol)中的溶液加热到100℃历时2小时。GC-MS表明完全转化。 使混合物在真空下脱挥发成分以给出作为浅黄色油的所需产物 (1.22g，99％)。GC-MS(EI+)：306(M+)，278，263，250，227，199，183，170， 124，109，107(100％)，104，97，90。

(E)-2-甲氧基-4-(4-(甲磺酰基)苯乙烯基)苯甲醛4：

在N₂下向含有膦酸酯2(579mg，1.89mmol)的干燥小瓶中加入干 燥THF(4ml)，接着加入t-BuOK(250mg，2.268mmol)在3ml干燥THF 中的溶液。在室温下搅拌5分钟之后，逐滴加入醛3在3ml干燥THF 中的溶液且将混合物在60℃的浴温下搅拌2小时。将反应体积在N₂流下缩减，加入乙酸乙酯和盐水且水相的pH用稀(0.1N)HCl变为3。 振荡混合物，分离各相且用乙酸乙酯(2×)萃取水相。在Na₂SO₄上干燥 合并的有机相。过滤出干燥剂，加入硅胶60且将化合物吸附在硅胶 上且通过MPLC使用二氯甲烷-乙酸乙酯梯度5-30％v/v纯化。黄色 固体，504mg(74％)。LC-MS(ESI+)：317(M+H+)，358(M+CH₃CN+ H+).NMR(CD₂Cl₂)：10.46(s，1H)，7.97(2H，dd，J＝8.2，0.8Hz)，7.85(1H， J＝8.6Hz)，7.78(2H，dd，J＝8.2，0.8Hz)，7.35(2H，d J＝0.8Hz)，7.28(1H，d， J＝12.6Hz)，7.21(1H，d J＝0.8Hz)，4.04(3H，s)，3.09(3H，s)。

4-(2-甲氧基-4-(4-(甲磺酰基)苯乙烯基)苯乙烯基)苯基氨基甲酸 叔丁酯6：

由于醛4在THF中的差溶解性，使用如下改进的烯化方法：在 N₂下向含有在干燥THF(1ml)中的膦酸酯5(105mg，0.3075mmol)的 干燥小瓶中加入t-BuOK(40.3mg，0.36mmol)在0.25ml THF中的溶液， 接着向t-BuOK小瓶中加入0.25ml THF漂洗液。将蓝色混合物在N₂下在室温下搅拌5分钟且随后在N₂下经套管加到醛4在干燥THF (1ml)中的溶液-悬浮液中。在添加完成之后，将红砖色溶液在62℃浴 温下搅拌1小时。此时的LC-MS表明非常干净且完全转化为所需产 物。所述产物在除THF外的大多数常用溶剂中具有差溶解性。将反 应混合物旋转蒸干且将任何过量的碱用一小片干冰中和且使固体在 CO₂覆盖层下过夜。随后将其溶解于THF中，吸附在硅胶上且通过 MPLC使用己烷-THF梯度40-80％纯化。化合物用60％v/v THF洗脱 为浅橙色固体(124mg(83％))。MS(ESI+)：505(M+)，528(M+Na+). H-NMR(丙酮-D6)：8.47(1H，s)，7.93(2H，d，J＝8.5Hz)，7.85(2H，d， J＝8.5Hz)，7.68(1H，d，J＝8Hz)，7.57(2H，d，J＝8.5Hz)，7.51(2H，d， J＝8.1Hz)，7.47(1H，s)，7.42(2H，dd，J＝12，3.2Hz)，7.34(1H，s)，7.28-7.23 (2H，m)，3.98(3H，s)，3.12(3H，s)，1.49(9H，s).C-NMR(丙酮-D6)：158.21， 153.81，143.82，140.39，138.16，133.27，130.02，128.83，128.01，127.59， 127.32，122.03，121.01，119.35，80.26，56.20，44.56，28.69。

4-(2-甲氧基-4-(4-(甲磺酰基)苯乙烯基)苯乙烯基)苯胺(式I：R¹＝ CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CH₃)：

向Boc-3111(6，16.4mg，32.4μmol)在含有40ppm戊烯的二氯甲 烷(0.8ml)中的溶液中加入TFA(0.2ml)且将混合物在室温下搅拌30分 钟。LC-MS分析表明非常干净且完全的去保护。溶剂用N₂流洗提， 将化合物溶解于0.2ml THF中且吸附在二氧化硅SPE滤心上。在用己 烷初始洗脱之后，加入50μl三乙胺且用THF洗脱产生10.5mg作为暗 红色固体的所需染料(81％)。MS(ESI+)：406(M+H+)，447(M+CH₃CN +H+)。

制备数种其他中间体，其中的两种(膦酸酯8和醛9(醛9与醛3 异构))根据流程3中概述的合成转化制备。

流程3.制备中间体膦酸酯8和醛9。

4-((二乙氧基磷酰基)甲基)苯基氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙 酯8：

向4-氨基苄基膦酸二乙酯(922mg，3.8mmol)在二氯甲烷(12.6ml) 中的溶液中加入三乙胺(2.66ml，19mmol)。将混合物搅拌5分钟，随 后一次性加入丁二酰亚氨基-TEOC(985mg，3.876mmol)且将混合物在 室温下搅拌40小时。将溶液用盐水洗涤(3×)，在Na₂SO₄上干燥，吸 附在硅胶上且通过MPLC使用己烷-乙酸乙酯50-100％梯度纯化。无 色油在低温下凝固为蜡状物。产量：822mg(56％)。注意：拖尾部分 另外产生522mg纯度小于99％的产物。MS(ESI+)：388(M+H+)，410 (M+Na+).NMR(CD₂Cl₂)：7.39(2H，d，J＝8.3Hz)，7.23(2H，dd，J＝17.4， 2.2Hz)，4.24-4.28(2H，m)，4.02-4.06(2H，m)，3.12(2H，d，J＝23.2Hz)， 1.28(6H，J＝7.2Hz)，1.06(2H，m)，0.1(9H，s).C-NMR(CD₂Cl₂)：153.76， 137.51(d，J＝3.7Hz)，130.16(d，J＝6.6Hz)，126.12(d，J＝8.8Hz)，118.61， 63.18，62.03(d，J＝6.6Hz)，33.47，32.10，17.68，16.19(d，J＝5.8Hz)，-1.86。

4-溴-3-甲氧基苯甲醛：

在干冰-丙酮浴中将2-溴-5-碘茴香醚(5g，16mmol)和1，10-菲咯啉 晶体(指示剂)在干燥Et₂O(45ml)中的溶液冷却到-78℃。逐滴加入 n-BuLi(2.5M，在己烷中)的溶液，直到达到终点(7.8ml)。将混合物在 该温度下搅拌15分钟，在此期间形成稠浆。经注射器向悬浮液中加 入干燥N-甲酰基哌啶(3.46ml，31.2mmol)且使混合物经30分钟缓慢 达到室温。此时GC-MS表明没有芳基碘。将反应混合物用1N HCl 洗涤(2X)，用盐水洗涤(1次)，将水相用乙醚萃取，将合并的有机相 在Na₂SO₄上干燥，且在旋转蒸发仪上除去溶剂，产生浅黄色油，其 直接用于下一步。注意：在用少量冷甲醇洗涤后，等分样品产生白色 结晶产物。MS(EI+)：216(M+，100％)，214(M+，100％)，215，213，201， 199，187，185，172，170，157，155，145，143，119，105，92，77，63。

4-(二甲氧基甲基)-2-甲氧基苯甲醛9：

将以上粗醛(3.4g，15.8mmol)溶解于甲醇(62ml)和原甲酸三甲酯 (17ml，158mmol)中。加入对甲苯磺酸单水合物(300mg，0.158mmol) 且使混合物回流3小时。在冷却到室温后，随后加入一刮勺固体 NaHCO₃，将混合物搅拌10分钟，使其吸附在硅胶上且通过MPLC 用己烷-乙酸乙酯(20-60％EtOAc)洗脱来纯化。产量：3.81g(92％)浅黄 色油，将其用于下一步。MS(EI+)：262(M+)，260(M+)，231(100％)， 229(100％)，216，215，214，213，122，75。

在-78℃下(丙酮-干冰浴)向以上芳基溴-乙缩醛(3.812g，14.6mmol) 和1，10-菲咯啉晶体(指示剂)在干燥乙醚(41ml)中的溶液中缓慢加入 n-BuLi在己烷(2.5M)中的溶液直到等量(6.3ml)。在5分钟后，将干冰 -丙酮浴替换为乙腈-干冰浴且将混合物在-40℃的内部温度下搅拌45 分钟。此时，经注射器加入N-甲酰基哌啶(3.16ml，28.47mmol)且使 混合物经1小时升温至室温。随后小心加入水，将有机层用水洗涤 (3X)，用盐水洗涤(1次)，将水层用乙醚萃取，将合并的有机相干燥 (Na₂SO₄)且粗产物通过MPLC用己烷/乙酸乙酯(5-40％，随后60％v/v EtOAc)洗脱来纯化。产量：2.604g(85％)，无色油。MS(EI+)：210(M+)， 179(100％)，163，151，135，119，108，91，75。

式I化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CF₃)根据流程4中 概述的转化制备。尽管可使用Boc保护的氨基醛，但实际所用的为 TEOC保护的氨基醛10。

流程4.制备式I化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CF₃)

需要的4-三氟甲基磺酰基苄基膦酸二乙酯根据以下顺序制备：

向5.11g苄基溴中加入12ml亚磷酸三乙酯。将所得溶液在80℃ 下加热4小时。将反应混合物在氮气流下浓缩且随后在大硅胶柱(约 250ml二氧化硅)上用80/20己烷/CH₂Cl₂(CH₂Cl₂的比例逐渐增加)洗脱 且最后加入MTBE以洗脱出产物来纯化。产率为定量的。¹H NMR (CDCl₃)：7.61ppm(2H，d，J＝8.0Hz)，7.37ppm(2H，dd，J＝8.3，2.4Hz)， 4.04ppm(4H，dq，J＝1.5，7.1Hz)，3.18ppm(2H，d，J＝22Hz)，1.30ppm (6H，t，J＝7.1Hz).¹³C NMR(CDCl3)：136.5ppm(d，J＝2.9Hz)，135.2ppm (d，J＝9.5Hz)，130.9ppm(d，J＝6.6Hz)，129.5ppm(dq，J＝2.9，307Hz)， 122.8ppm(m)，62.3ppm(d，J＝6.6Hz)，33.7ppm(d，J＝138Hz)，16.3ppm (d，J＝6.6Hz)。

向在5ml CHCl₃中的0.50g硫化物中加入0.266g MCPBA；将反 应混合物在室温下搅拌60小时。经HPLC分析的等分样品指示2个 主峰。加入另外0.060g MCPBA且将反应物搅拌24小时。将反应混 合物在氮气下浓缩，用15ml MTBE处理且用约6ml和另外约4ml的 0.8M NaHCO+萃取。将有机层用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。将其在 ISCO制备型系统上使用硅胶柱和以100％CH₂Cl₂开始并以100％ MTBE结束的梯度纯化。产率为定量的。¹H NMR(CDCl₃)：7.98ppm (2H，d，J＝8.2Hz)，7.61ppm(2H，dd，J＝2.3，8.5Hz)，4.06ppm(4H，dq， J＝8.1，7.1Hz)，3.28ppm(2H，d，J＝22.5Hz)，1.25ppm(6H，t，J＝7.1Hz). ¹³C NMR(CDCl₃)：142.2ppm(d，J＝9.3Hz)，131.3ppm(d，J＝6.1Hz)， 130.9ppm(d，J＝2.2Hz)，129.6ppm(m)，119.7ppm(q，J＝325.8Hz)， 62.5ppm(d，J＝7.0Hz)，34.3ppm(d，137.1Hz)，16.3ppm(d，J＝5.9Hz)。

(E)-4-(4-甲酰基-2-甲氧基苯乙烯基)苯基氨基甲酸2-(三甲基甲硅 烷基)乙酯10：

向含有膦酸酯8(537.5mg，1.346mmol)的干燥小瓶中加入干燥 THF(3ml)，接着加入t-BuOK(180mg，1.607mmol)在THF(2ml)中的 溶液且将混合物在室温下搅拌5分钟。随后逐滴加入醛9(278mg， 1.32mmol)在THF(2ml)中的溶液且将混合物在N₂下在64℃的浴温下 搅拌2小时。将混合物用冰急冷，且用NaHSO₄将pH调节到5.5，随 后用NaHCO₃调节到7，加入饱和盐水且将混合物用乙酸乙酯萃取 (4X)。在旋转蒸发仪上除去溶剂且将所得油溶解于THF(925ml)和水 (5ml)中。加入催化量的三氟甲磺酸吡啶盐(3mg)且将混合物在60℃ 下搅拌75分钟。在加入固体NaHCO₃(50mg)并搅拌5分钟后，将溶 液在旋转蒸发仪上蒸干(最后压力：10托)，使黄色固体吸附在硅胶上 且通过MPLC(己烷-THF)纯化。MS(ESI+)：397(100％，M+)，398(28％)， 299(6％).H-NMR(CD₂Cl₂)：9.98(1H，s)，7.79(1H，d，J＝7.8Hz)，7.56(2H，d， J＝8.6Hz)，7.50(2H，dd，J＝9.2，0.9Hz)，7.44-7.47(3H，m)，7.28(1H，d， J＝16.6Hz)，6.81(1H，br s)，4.27-4.32(2H，m)，4.00(3H，s)，1.08-1.12(2H， m)，0.11(9H，s)。

4-(2-甲氧基-4-(4-(三氟甲基过氧硫基)苯乙烯基)苯乙烯基)苯基 氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯：

向4-三氟甲基磺酰基苄基膦酸二乙酯(91.3mg，0.253mmol)在干 燥THF(0.25ml)中的溶液中加入t-BuOK(31mg，0.277mmol)在THF (0.25ml，接着用0.25ml漂洗)中的溶液，且将溶液在室温下搅拌5分 钟。随后加入醛10(98.5mg，0.248mmol)在THF(1ml，接着2×0.25ml 漂洗)中的溶液且将溶液在N₂下在60℃下搅拌90分钟。将混合物用 THF稀释且用粉末化的干冰小心中和。随后使粗混合物吸附在硅胶上 且通过MPLC在堆叠的12g Gold Label柱上使用己烷-THF梯度 30-40％THF纯化。产量：106mg(69.5％)。MS(ESI+)：604(M+H+)。

4-(2-甲氧基-4-(4-(三氟甲基过氧硫基)苯乙烯基)苯乙烯基)苯胺 式I(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CH₃)：

向以上TEOC-11(10.7mg，17.75μmol)在含有40ppm戊烯的二氯 甲烷(0.8ml)中的冷(℃)溶液中逐滴加入TFA(0.2ml)且使混合物经约 30分钟缓慢升温至室温且搅拌总共90分钟。LC-MS指示完全且非常 干净地转化为所需产物。将挥发物用氮气流洗提出且将黑色残余物再 溶解于二氯甲烷中，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤，干燥且将溶剂用 N₂流再次洗提以给出作为暗橙色粉末的纯净(99％整体)产物(7.5mg， 92％产率)。MS(ESI+)：460(M+H+).H-NMR(CD₂Cl₂)：8.03(2H，d， J＝8.5Hz)，7.83(2H，d，J＝8.5Hz)，7.64(1H，d，J＝8.1Hz)，7.38-7.42(3H，m)， 7.32(1H，d，J＝16.4Hz)，7.21-7.25(1H，dd J＝8.1Hz，1.5Hz，侧面有1H (flanked by)，d，J＝16.4Hz)，7.14(1H，m侧面有1H，d，J＝16.4Hz)，6.71(2H， d，J＝8.3Hz)，5.36(1H，m，J＝1Hz)，3.99(3H，s)。

可以制备式I化合物的放射性同位素衍生物并通过放射成像实现 成像。或者，可制备¹³C富集的式I的化合物或¹⁹F-标记的式I的衍 生物。在某些实施方案中，可使用R¹＝CH₂CH₂OTs(其中Ts为甲苯 磺酸酯)的式I化合物作为用于¹⁸F(PET)放射性标记的前体；可选择 如放射性标记实践中通常已知的甲苯磺酸酯离去基团的其他选择。另 外，对于基于¹⁹F的MRI，可使用式I化合物，其中R¹或R³＝SO₂CF₃或C₁-C₄全氟烷基，且对于基于¹³C的MRI，可使用式I化合物，其 中R¹或R³＝¹³C-甲基或¹³C-富集的C₁-C₄烷基。

或者，式I化合物的¹³C标记的衍生物可通过用¹³C富集的碘化 甲烷或类似的C₁-C₄烷基化剂使式I化合物的氨基官能团烷基化来制 备。式I化合物的¹⁹F衍生物可通过用C₁-C₄氟或全氟烷基卤化物、 甲磺酸酯或甲苯磺酸酯使式I化合物的氨基官能团烷基化，通过与氟 乙酰基卤化物(诸如五氟苯基苯甲酰氯)反应以产生相应的酰胺或通过 还原胺化(其中羰基组分带有C或¹⁹F部分)来制备。在其他实施方案 中，可使式I的胺部分烷基化以产生2-羟乙基衍生物，所述2-羟乙基 衍生物可经由其甲苯磺酸酯或甲磺酸酯作为前体用于¹⁸F(PET)放射 性标记。

结果和观测

表V：所选化合物的荧光激发和发射峰

在表V中示出各种化合物的荧光激发和发射峰及相关结合。+++ 表示使用离体组织化学测定对神经的结合。

揭示特征性神经形态的神经组织切片的苏木素和伊红染色的检 查结果可被确定。各神经或神经束表现为大圆形或大圆形组，在其内 可鉴别出较小的环形有髓轴突。神经切片用荧光团染色。图7表示三 叉神经、坐骨神经和股骨神经用荧光团的染色。如所示，可见有髓环 形结构。未用试剂的含神经的对照载玻片(未示出)在相同成像条件下 为负。

当将所述试剂全身地注射到临床前动物模型时，体内成像揭示， 当全身施用到临床前动物模型时，所述试剂中的某些的位置局限在包 括臂丛、面神经、三叉神经、膈神经、迷走神经和视神经的多种组织 中的神经。相邻的肌肉组织具有极低本底结合。未给予荧光团的负对 照动物的神经没有荧光信号。图8表示小鼠手术模型中的臂丛神经通 过式I化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CH₃)的荧光体内成像。 试剂的体内性能是数种因素的组合，所述因素包括但不限于试剂髓鞘 质结合性质、血液神经屏障渗透、新陈代谢、血浆结合、半衰期、溶 解性和清除率。在离体测定中没有使神经组织切片染色的试剂通常不 在体内进行测试。

将天然髓鞘碱性蛋白从大鼠脑中纯化且用于生物化学测定中。天 然MBP改变式I化合物(其中R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CH₃或SO₂CF₃)的荧光性质，表明荧光团与MBP之间的密切相互作用。 图9表示式I化合物(R¹＝CH₃，R²＝NH₂且R³＝SO₂CH₃或SO₂CF₃) 在与天然MBP结合时荧光发射强度增强。与变性MBP结合没有引起 荧光强度显著增强。通过苯环和烯属取代基的π双键轨道的共轭可提 供电子从给电子基团R²贯穿式I流到给电子基团R³的路径。该电子 流可对荧光信号的更显著增强作出贡献。

在不脱离本发明的精神和其本质特征的情况下，本发明可包含其 他特定形式。因此，在各方面，可将上述实施方案视为说明、而不是 限制本文所述的本发明。本发明的范围因此由附加权利要求书、而不 是上述说明书指出，因此希望在权利要求书的等价物的含义和范围内 的所有改变都包含在其中。