涂有呈网状或岛状的低结晶羟磷灰石的植入体以及其涂覆方法

摘要

本发明涉及用低结晶羟磷灰石涂覆广泛用作移植材料的钛植入体表面的方法，以及利用所述方法涂覆呈网状或岛状形态的低结晶羟磷灰石的植入体。根据本发明的涂覆方法包含下列步骤：1)预处理钛或钛合金植入体的表面；2)将磷酸根离子溶液和钙离子溶液混合以制备磷酸钙离子溶液；以及3)将所述钛或钛合金植入体浸入并储存于所述磷酸钙离子溶液中。

说明书

技术领域

本发明涉及用具有生物可吸收性的低结晶羟磷灰石涂覆广泛用作移植材 料的钛植入体表面的方法，以及利用所述方法涂覆的植入体。

背景技术

近年来，羟磷灰石已经广泛用作能够代替例如骨骼或牙齿等硬组织的人 造生物材料。羟磷灰石是一种在化学上和晶体学上与构成人体骨骼和牙齿的 矿物组分相同的材料。当移植到人体中时，羟磷灰石呈现出与周围细胞的高 度生物相容性，并且在接合区处迅速与骨骼直接形成化学键。由钙离子、磷 酸根离子和羟基离子构成的纯羟磷灰石晶体是一种化学计量晶体，具有杆状 结构，并且具有高结晶度。另一方面，从骨骼或钙化软骨分离的生物晶体是 具有低结晶度的非化学计量的羟磷灰石[参见埃利奥特J.C.(Elliott J.C.)，磷 灰石和其它正磷酸钙的结构和化学性质(Structure and Chemistry of the  Apatites and Other Calcium Orthophosphates)，无机化学研究第18期(Studies  in Inorganic Chemistry 18)，阿姆斯特丹(Amsterdam)：爱思唯尔出版社 (Elsevier)，第111-190页(1994)]。

钛因物理性质类似于人类骨骼以及具有优良的机械强度而广泛用作植入 材料。此外，钛还因为在体内不会引起任何发炎性反应或其它免疫反应而广 泛用作生物金属。为了使应用于工业中的钛具有生物活性，钛将经历多种表 面改性，例如喷砂、酸蚀刻等(参见多篇专利文献，包含韩国专利申请案第 98-23075号)。然而，与例如羟磷灰石等陶瓷材料相比较，钛不利地呈现弱 生物相容性，并且当其在人体内长期驻留时会经历金属离子的溶解，最终导 致在体内形成无机物质。

出于这些原因，近来已经开发出通过用羟磷灰石薄膜涂覆钛来获得具有 优良机械强度和生物相容性的适用于代替生物硬组织的生物材料的多种方 法。涂覆陶瓷从而赋予钛表面生物活性的常规代表性方法可包含等离子体喷 雾法、溅镀法、离子植入法、离子束沉积法及类似方法。为了形成羟磷灰石 的结晶学性质类似于生物晶体的结晶膜，已经采取了使用磷酸钙溶液或模拟 体液的各种方法。

上述方法中最常用的等离子体喷雾法具有几个缺点，例如因瞬时暴露于 10,000℃或更高的高温而导致涂层不均匀，以及难以获得厚度小于约10微米 的涂层。此外，这种方法还具有生物反应性极低的问题，因为涂覆在钛表面 上的羟磷灰石会因结晶度极高而在体内发生分解或难以被破骨细胞去除。另 外，已知这种方法也涉及同时形成具有不同相的磷酸钙或氢氧化钙作为副产 物[参见H.-G.帕夫(H.-G.Pfaff)等人，“生物陶瓷”中HA涂层的性质(Properties  of HA-Coatings in′Bioceramics′)，第6卷.，P.都彻尼(P.Ducheyne)和D.克里 斯安森(D.Christiansen)编辑，第419-424页，布特沃斯-海尼曼有限公司 (Butterworth-Heinemann Ltd.)(1993)]。一般说来，人体骨骼会经历称为骨重 建(Bone Remodeling)的一系列过程，在这些过程中，老骨骼从骨架去除， 并添加新骨骼。高结晶度羟磷灰石涂膜不参与骨骼的重建过程。因此，羟磷 灰石仍作为涂膜长期保留在人体内。甚至在产生功能性骨骼后，这种涂膜仍 存在并分解成具有不同相的副产物，致使涂膜从表面剥离，最终导致植入体 的分离。为此，需要开发低结晶羟磷灰石，其能够通过在体内被破骨细胞吸 收来参与骨骼的重建过程，由此来克服具有高结晶度的常规羟磷灰石涂层的 问题。

此外，溅镀法或粒子植入法除需要高价设备来达到这一目的外，还具有 各种问题，例如形状复杂、在不规则部件上形成的涂层均匀性较差，以及植 入体在人体中会因剥离现象而分离。

另一方面，存在一种使用磷酸钙溶液或模拟体液的方法，这是一种湿式 涂覆方法。各种类型磷酸钙的制备或涂覆都是从磷酸钙离子溶液为原料。这 些磷酸钙化合物可通过在多种条件下将钙离子和磷酸根离子混合于水溶液中 来制备。就这一点来说，已知化合物的类型和形式主要受离子浓度、Ca/P比 率和pH条件影响[参见津下彩子(Ayako Oyane)，小昭和夫(Kazuo Onuma)， 矢岛正雄(Tadashi Kokubo)和伊藤敦南(Atsuo Ito)物理化学杂志B(J.Phys. Chem.B)1999，103，8230-8235，埃利奥特J.C.(Elliott J.C.)，磷灰石和其 它正磷酸钙的结构和化学性质(Structure and Chemistry of the Apatites and  Other Calcium Orthophosphates)，无机化学研究(Studies in Inorganic  Chemistry)第18期，阿姆斯特丹(Amsterdam)：爱思唯尔出版社(Elsevier)， 第111-190页(1994)]。上文例示的涂覆方法涉及复杂的步骤或需要长的涂覆 时间。一般说来，磷酸钙的过饱和溶液会因自发沉淀而很难保持恒定的浓度 [参见H.B.文(H.B.Wen)等人，生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater. Res.)41，227-236(1998)]。此外，在保持约37℃的限制性条件下进行的方法 会视表面条件而耗费较长时间，约一个月或更长时间。为了解决这些问题， 已经开发出通过降低工艺温度并应用磷酸根离子缓冲系统抑制磷酸钙晶体在 过饱和溶液中沉淀，由此用磷酸钙涂覆植入体的方法。然而，这些方法还需 要使用酸来制造钙离子溶液和磷酸根离子溶液，并且需要通过在低温下与碱 溶液混合来调整pH值(氢离子浓度)以抑制磷酸钙沉淀。此外，这些方法 也不能克服复杂且较长的工艺时间的缺陷(金允曼(Kim Hyun-Man)等人的 韩国专利申请案第1999-38528号和金希永(Kim Se-Won)等人的韩国专利申 请案第2000-51923号，二者都受让于奥斯泰克有限公司(Oscotec Inc.))， 因为其需要例如纯化(通过多孔过滤或离心)来去除在混合钙离子溶液与磷 酸根离子溶液之初所产生的非晶形磷酸钙。

根据温度和pH值，使用湿法得到的磷酸钙化合物具有不同的平衡相。 具体说来，在40℃或更低温度下，磷酸钙在pH 7或更高pH值下具有平衡相 非晶形(Ca₃(PO₄)··nH₂O；n＝3到4.5)或非化学计量的羟磷灰石 (Ca_10-x(HPO₄)_x(PO₄)_6-x··nH₂O；x＝0到1，n＝0到2)；在pH 6到pH 7下具 有平衡相磷酸八钙(octacalcium phosphate，OCP；Ca₈H₂(PO₄)₃··5H₂O)； 且在pH 6或更低pH值下具有平衡相磷酸二钙(dicalcium phosphate，DCP； CaHPO₄)、二水合磷酸二钙(dicalcium phosphate dihydrous，DCPD； CaHPO₄··2H₂O)等。根据常规湿法得到的磷酸钙涂层是基于磷酸钙溶解度 的改变，利用了磷酸钙溶解度随反应温度增加而降低的事实。因此，初始工 艺应在2℃到5℃的较低温度下进行，并且很难在不升高温度的情况下获得磷 酸钙涂膜和磷酸钙胶体溶液。此外，在通过升高反应温度获得磷酸钙胶体溶 液和涂膜的过程期间，溶液的pH值一般停留在6.0到6.5的范围内。虽然尚 未完全了解根据常规湿法得到的磷酸钙涂膜的精确平衡相，但根据温度与磷 酸钙溶液pH值之间的相关性，其似乎为OCP。

如上文所论述，常规湿法利用了磷酸钙溶解度对温度改变反应而出现的 差异，并且具有需要控制温度和/或pH值、升高反应温度以及形成磷酸钙涂 膜的复杂程序的限制。因此，本发明设想解决常规湿法所呈现的程序复杂性 的问题。因而，本发明提供一种羟磷灰石涂覆方法，这种方法借助相对简单 的低成本工艺，甚至无需控制温度和pH值或温度升高工艺，就能够得到优 良的生产力。

发明内容

技术问题

本发明的主要目的是克服上文所述的问题。本发明已经发现一种涂有低 结晶羟磷灰石的植入体，其可以长时间使用，而不会从新的骨骼分离，以致 植入体可在体内被破骨细胞吸收，由此参与骨骼重建过程。因此，本发明克 服了具有高结晶度的常规羟磷灰石涂层的缺陷。

此外，与常规湿法相比较，根据本发明的低结晶羟磷灰石涂覆方法相对 简单。这种涂覆方法还因不需要严格控制例如温度和/或pH值等反应条件以 及升高反应温度即赋予优良的生物活性而具有经济效益。

技术解决方案

本发明提供一种用于涂覆植入体的方法，其中所述方法包含：

1)预处理钛或钛合金植入体的表面，

2)将磷酸根离子溶液和钙离子溶液各自添加到经过预处理的钛或钛合金 植入体中，以及

3)将钛或钛合金植入体浸入并储存于磷酸钙溶液中，保持1小时或更长 时间，

其中由此得到的低结晶羟磷灰石薄膜呈网状或岛状形态，并且具有生物 吸收性。

有利作用

根据本发明的植入体涂覆方法的益处在于：通过植入体可在体内被破骨 细胞吸收，由此参与骨骼重建过程来长时间使用，同时不会从新的骨骼分离。

此外，根据本发明的植入体涂覆方法能够通过赋予钛植入体表面生物活 性，使植入体骨骼组织与牙齿组织之间形成较强的界面结合，并促进骨传导 性或骨生成，来增加植入体的成功率。而且，由于形成涂层的低结晶羟磷灰 石具有生物可吸收性，致使由表面涂层剥离引起的植入体分离得以避免。

根据本发明的植入体涂覆方法能够通过极为简单的低成本工艺以及必要 时控制涂层的厚度和形态(例如薄涂层、厚涂层以及钛和涂层的共暴露表面) 来制造优良的牙科用植入体。因此，根据所需用途，本发明可适用于多种生 物材料领域，例如整形外科领域以及牙科领域。

附图说明

从下文结合附图阐述的具体实施方式，将更清楚地了解本发明的目的、 特征和其它益处。

图1是未涂覆的钛植入体表面的扫描电子显微照片(scanning electron  micrograph)。

图2是说明钛植入体表面上呈网状形态的低结晶羟磷灰石厚涂层的扫描 电子显微照片。

图3是说明钛植入体表面上呈网状和岛状形态的低结晶羟磷灰石薄涂层 的扫描电子显微照片。

图4是说明钛植入体表面上呈岛状形态的低结晶羟磷灰石涂层的扫描电 子显微照片。

图5是说明钛植入体表面上呈网状和岛状形态的低结晶羟磷灰石薄涂膜 的透射电子显微照片。

图6是比较在存在与不存在预处理情况下低结晶羟磷灰石的可涂覆性的 扫描电子显微照片。

图7是本发明的示意性工艺流程图。

图8是通过高分辨率透射电子显微镜术(high-resolution transmission  electron microscopy)观察的西格玛阿尔德里奇公司(Sigma Aldrich)的羟磷 灰石与本发明的低结晶羟磷灰石涂覆表面之间晶格结构的比较照片。

图9显示可从图6的晶格结构比较照片获得的从中心到个别原子的距离 以及个别原子间角度的测量结果。

图10显示在高分辨率透射电子显微镜下通过元素分析仪(elemental  analyzer)测量涂覆在钛植入体上的低结晶羟磷灰石得到的结果。

图11是比较14天中在RBM处理的钛基质与涂有低结晶羟磷灰石的植 入体基质之间间充质干细胞分化成成骨细胞的程度的图。

图12是分别比较14天和28天中在RBM处理的钛基质与涂有低结晶羟 磷灰石的植入体基质之间间充质干细胞的钙化程度的图。

图13是说明移植低结晶羟磷灰石后2周和6周涂膜的生物可吸收性的扫 描电子显微照片。

具体实施方式

本发明涉及在机械性质优良的适用于植入体的钛表面上涂覆具有优良骨 骼生长和骨传导性的羟磷灰石的植入体和方法。为此，本发明提供在15℃到 30℃室温下，在低浓度磷酸钙水溶液中诱导钛植入体表面上网状或岛状低结 晶羟磷灰石生长的技术。

根据本发明的涂覆方法也适用于使用钛合金而非纯钛作为原料的植入 体，或使用钛作为原料随后借助多种方法进行表面处理的植入体。虽然工艺 时间可能与本发明实施例略有不同，但根据表面处理的类型，用羟磷灰石涂 覆植入体表面技术所属领域的技术人员也可容易地控制反应时间。

具体说来，本发明的植入体涂覆方法包含：

预处理钛或钛合金植入体的表面，

将磷酸根离子溶液和钙离子溶液各自添加到经过预处理的钛或钛合金植 入体中，以及

将钛或钛合金植入体浸入并储存于磷酸钙溶液中，保持1小时或更长时 间。

预处理步骤可以通过此项技术中多种常用方法进行，例如可再吸收性喷 砂介质(Resorbable Blasting Media，RBM)方法，其中使用可再吸收性喷砂 介质进行表面处理；大颗粒喷砂加酸蚀(Sand-blasted Large grit，and Acid  etched，SLA)表面处理法，其中在进行铝喷砂后进行酸蚀刻；在300℃或更 高温度下进行热处理；阳极处理；以及在酸或碱处理后进行表面热处理。当 使用借助上述任何方法处理表面的钛或钛合金材料时，可以省略预处理步骤。 此外，预处理步骤优选包含在蒸馏水、钙离子溶液、磷酸根离子溶液或磷酸 钙溶液中对钛或钛合金植入体进行超声波处理，保持1分钟或更长时间。超 声波处理也可以在进行了上述RBM、SLA或热处理等之后进行。

在预处理步骤中，对于由上述钛或钛合金作为原料构成的植入体，可任 选使用硝酸溶液去除植入体表面上残留的任何烃。硝酸溶液的浓度以体积比 计优选为4％到60％。根据表面的亲水性和形态，可以省略硝酸清洁过程。在 用硝酸清洁后，可以用蒸馏水洗涤表面，以便去除表面上残留的硝酸。对于 未经历硝酸清洁过程的表面，也可以省略蒸馏水洗涤。

本说明书中提出的低浓度(约1.0毫摩尔/升到约10毫摩尔/升)钙离子 溶液可通过将硝酸钙(例如Ca(NO₃)₂或Ca(NO₃)₂··4H₂O等)或氯化钙(例 如CaCl₂或CaCl₂··2H₂O等)溶解于蒸馏水中的简单方法来制备。本申请案 的低浓度(约1.0毫摩尔/升到约10毫摩尔/升)磷酸根离子溶液可以通过将 磷酸铵(例如(NH₄)₂HPO₄等)或磷酸钠(例如Na₂HPO₄或Na₂HPO₄··2H₂O 或Na₂HPO₄··7H₂O等)或磷酸钾(例如K₂HPO₄或K₂HPO₄··3H₂O等)溶 解于蒸馏水中的简单方法来制备。

将磷酸根离子溶液和钙离子溶液分别添加到植入体基质中。或者，在将 其施用于植入体基质之前，混合这两种溶液以制备磷酸钙溶液，随后将磷酸 钙溶液施用于植入体基质。优选将两种溶液各自添加到植入体基质。

磷酸钙溶液的浓度在1.0毫摩尔/升到10毫摩尔/升的范围内。此外，虽 然植入体在低浓度磷酸钙溶液中的浸入时间为1小时或更长，但可以根据预 定的表面状态和形态以及涂层厚度改变浸入时间。另外，浸入温度在约10℃ 到约35℃且优选在15℃到约30℃的范围内。浸入温度可保持恒定或升高。 根据预定用途和目的，本领域技术人员可容易地选择浸入时间和浸入温度。

将所制备的低浓度钙离子溶液和磷酸根离子溶液分别添加到钛植入体 中，随后浸泡1小时或更长时间，并取出钛植入体，用蒸馏水短时间洗涤， 由此可以在钛或钛合金植入体表面上涂覆呈网状或岛状形态的低结晶羟磷灰 石。

根据本发明的涂覆方法的优势在于，不需要控制磷酸钙溶液的pH值。 不需要搅拌混合磷酸根离子溶液与钙离子溶液。

本发明中提出的涂覆低结晶羟磷灰石的方法是基于充分利用以下现象： 磷酸钙溶液的溶解度在室温下降低，并且钙离子与磷酸根离子溶液混合的化 学机制将引起磷酸根离子溶液中磷酸氢根(HPO₄^2-)解离常数的改变，并因 此会在钛植入体浸入磷酸钙溶液中期间连续产生非晶形或结晶磷酸钙。以下 是磷酸根离子溶液的反应方案。

Na₂H(PO₄)₂→2Na⁺+H(PO₄)₂^-

磷酸根离子溶液中磷酸氢根离子的解离常数极低。因此，溶液中磷酸氢 根离子解离形式的存在量极少。与利用磷酸钙的缓冲液或温度依赖性溶解度 的常规方法不同，本发明利用了在钙离子溶液与磷酸根离子溶液的混合过程 期间发生的磷酸氢根离子解离常数的改变。钙离子溶液添加到磷酸根离子溶 液中会加速磷酸氢根离子的解离。虽然磷酸氢根离子的解离是连续发生的， 并且在某种程度上可能视离子溶液的浓度或反应温度而变化，但磷酸氢根离 子在进行反应后约1小时迅速发生解离，接着随时间推移，磷酸氢根离子的 解离持续而缓慢地发生。因此，有可能在磷酸氢根离子迅速解离的位置获得 呈网状形态的涂膜。当使所述工艺进行较长时间段(3小时或更长时间)时， 有可能因磷酸氢根离子持续解离而获得低结晶羟磷灰石厚涂膜。低结晶羟磷 灰石薄膜的厚度为约10纳米或更小。当增加浸入时间时，可以获得较厚的膜。

本发明中的预处理是赋予植入体表面活性，从而保证在磷酸钙溶液中使 钛植入体表面获得均匀且高度粘附的磷酸钙晶体涂层的工艺。一般说来，室 温下，磷酸钙晶体在磷酸钙溶液中的生产率极高。因此，如果未赋予钛植入 体表面足够的活性，就不能在植入体上形成涂层和/或使植入体涂层的粘附强 度大为降低。总的说来，需要对钛植入体表面进行预处理，以增加植入体表 面上结晶磷酸钙的产生和生长。此外，预处理还使植入体表面上低结晶羟磷 灰石的涂覆均匀性得到改进，并且明显改进可重复性和可再现性。

本申请案中的预处理方法是如前文所述，优选通过在蒸馏水、钙离子溶 液、磷酸根离子溶液或磷酸钙溶液中对钛或钛合金植入体进行超声波处理， 保持1分钟或更长时间来进行。

由根据本发明的涂覆方法制备的低结晶羟磷灰石具有特征性非化学计 量，而且能够被生物吸收。

此外，本发明涂有低结晶羟磷灰石的植入体具有共暴露网状或岛状涂层 和植入体钛表面的双表面，由此骨生成能力因钛与细胞的粘附作用与羟磷灰 石的骨传导作用之间的协同作用而得到改进。

如本文所述，在磷酸钙溶液中呈网状或岛状形态的低结晶羟磷灰石涂层 可根据羟磷灰石的浓度、温度和工艺时间而确定所需的厚度。涂层状态可以 在扫描电子显微镜下确定。由于工艺简单，故可以对应于各种植入体领域以 及牙齿中所需的应用，适当地控制低结晶羟磷灰石的涂覆程度。

现将参考以下实例较为详细地描述本发明。提供的这些实例只用于说明 本发明，而不应解释为限制本发明的范围和精神。

实例1

钛植入体的预处理

将SLA(包括铝喷砂随后酸蚀刻的表面处理方法)处理过的植入体浸入 12％硝酸(HNO₃)溶液中，保持5分钟，随后进行超声波处理，并使用蒸馏 水(H₂O)去除植入体表面上残留的酸。12％硝酸溶液是通过将60％硝酸溶液 与蒸馏水(H₂O)按1∶4比率混合而制成。将通过在硝酸溶液中洗涤去除了表 面杂质的植入体浸入蒸馏水中，随后超声波处理15分钟。

实例2

制备低浓度钙离子溶液和磷酸根离子溶液

磷酸钙溶液的制备是由制备高浓度200毫摩尔/升钙(Ca)离子溶液和磷 酸根(PO₄)离子溶液的步骤开始。通过将氯化钙(CaCl₂)溶解于蒸馏水(H₂O) 中来制备高浓度钙离子溶液，且通过将磷酸氢钠(Na₂HPO₄)溶解于蒸馏水 (H₂O)中来制备高浓度磷酸根离子溶液。通过添加蒸馏水将高浓度200毫摩 尔/升钙离子溶液和磷酸根离子溶液分别稀释到5毫摩尔/升。在与进行涂覆工 艺相同的温度下储存5毫摩尔/升钙离子溶液和5毫摩尔/升磷酸根离子溶液。 优选在进行涂覆工艺的恒温箱中储存钙离子溶液和磷酸根离子溶液。

实例3

低结晶羟磷灰石涂层

按以下方式制备低结晶羟磷灰石涂层：将在蒸馏水中经过最终预处理的 植入体放入反应容器中，向其中分别依序添加等体积的5毫摩尔/升低浓度磷 酸根离子溶液和5毫摩尔/升钙离子溶液，并混合，由此制备出2.5毫摩尔/升 的磷酸钙溶液。在20℃恒温箱中，储存含有钛植入体和2.5毫摩尔/升磷酸钙 溶液的反应容器60分钟。之后，从反应容器中取出钛植入体，用蒸馏水短时 间洗涤，并干燥，由此形成网状涂层表面。

图3的扫描电子显微照片显示了网状涂层表面以及低结晶羟磷灰石和钛 的双表面。由图5的透射电子显微照片可以确定，呈网状形态的低结晶羟磷 灰石涂层的厚度为10纳米或更低。

为调整涂层厚度，可以在恒温箱中储存植入体180分钟或更长时间，以 形成低结晶羟磷灰石厚涂层。当首先制备磷酸钙溶液，并在1到3分钟后， 将经过预处理的植入体在反应容器中放置并储存60分钟时，也可以获得在外 部同时存在钛和低结晶羟磷灰石的岛状涂层表面。

表1

比较实例1

根据预处理的钛植入体的可涂覆性

对于实例1中在蒸馏水中经过超声波预处理的实验组和未预处理的对照 组，根据实例2和实例3的程序处理钛植入体。

表2

  实验组   对照组   植入体   产品   产品   预处理   是   否   浓度   2.5毫摩尔/升(mM)   2.5毫摩尔/升(mM)   温度   20℃   20℃

  时间   60分钟   60分钟   结果   网状形态   涂覆失败

图6是实验组和对照组的扫描电子显微照片，可以确定，对照组未形成 涂层，而实验组形成呈网状形态的薄涂膜。因此，预处理是影响钛植入体的 可涂覆性的一个因素，并且还能够改进涂膜的均匀性。

实验实例1

间充质干细胞碱性磷酸酶活性的分析

为测量在细胞培养皿中培养的间充质干细胞分化成成骨细胞的程度，针 对涂有上述实例中制备的低结晶羟磷灰石的植入体分析细胞的碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)活性。

将人骨髓源性间充质干细胞接种于经RBM(使用可再吸收性喷砂介质的 表面处理方法)处理并涂有低结晶羟磷灰石的钛盘中。经RBM处理的钛盘 用作对照组。为诱导间充质干细胞分化成成骨细胞，用补充有0.1微摩尔浓 度地塞米松(dexamethasone)、10毫摩尔/升β-甘油磷酸酯和50微克/毫升抗 坏血酸的培养基处理细胞，随后培养14天，并分析碱性磷酸酶活性且相互比 较。用PBS洗涤培养的细胞，用溶解缓冲液溶解，并使用ALP活性分析试剂 盒进行分析。

如图11的图中所示，可以确定在用上述实例中制备的具有混合型网状形 态和岛状形态的低结晶羟磷灰石涂覆的钛盘中，间充质干细胞的碱性磷酸酶 活性增加。从这些结果可以看出，与用作对照组的仅通过RBM(使用可再吸 收性喷砂介质的表面处理方法)处理的植入体相比较，涂有低结晶羟磷灰石 的植入体将更大地促进间充质干细胞分化成成骨细胞。

实验实例2

间充质干细胞中钙化结节形成的分析

为测量在细胞培养皿上培养的间充质干细胞钙化结节形成的程度，对涂 有实例中制备的低结晶羟磷灰石的植入体进行以下实验。

将人骨髓源性间充质干细胞接种于经RBM(使用可再吸收性喷砂介质的 表面处理方法)处理并按与实验实例1中程序类似的方式涂覆低结晶羟磷灰 石的钛盘中。经RBM处理的钛盘用作对照组。为诱导间充质干细胞分化成 成骨细胞，用分化诱导性培养基处理细胞，并培养2或4周。用PBS洗涤培 养的细胞，用4％多聚甲醛固定15分钟，随后用蒸馏水洗涤。将预先制备的 茜素红(Alizarin Red)溶液(pH 4.2)添加到细胞中，以进行染色工艺20分 钟。随后用蒸馏水洗涤细胞，以去除未染色的溶液。为定量评价染色的钙化 结节，将10％(重量/体积)氯化十六烷基吡啶添加到磷酸钠溶液(pH 7)中， 以洗脱染色的染料，随后测量吸光度。

如图12的图中所示，可以看出在用上述实例中制备的具有混合型网状形 态和岛状形态的低结晶羟磷灰石涂覆的钛盘表面上，间充质干细胞钙化增加。 从这些结果可以看出，与用作对照组的经RBM(使用可再吸收性喷砂介质的 表面处理方法)处理的植入体相比较，涂有低结晶羟磷灰石的植入体将更大 地促进在植入体表面上形成钙化结节。

实验实例3

在动物中生物可吸收性的评价

将涂有实例中制备的低结晶羟磷灰石的植入体移植到兔髂骨中，并研究 在骨重建之前和之后涂膜的残留率。

使用经RBM(使用可再吸收性喷砂介质的表面处理方法)处理的钛植入 体和其样品作为基底材料，将按与实验实例1中的程序类似的方式涂覆低结 晶羟磷灰石的钛植入体移植到新西兰(New Zealand)白兔的髂骨中。植入体 的直径为3.5毫米且长度为8.5毫米。为了移植植入体，对兔髂骨钻孔达到 3.6毫米直径，并将植入体手动推入髂骨中。2周和6周后，处死兔，并从兔 中取出植入体，且在扫描电子显微镜下进行检查。

图13中出于比较目的而提供的扫描电子显微照片显示，非化学计量的低 结晶羟磷灰石涂膜具有生物可吸收性。在植入体移植到兔髂骨之后第2周进 行的实验中，确定仍存在涂膜。在第6周进行的实验中，确定骨重建已经完 成，且因此涂膜因破骨细胞而消失。因此，可以看出本发明的非化学计量低 结晶羟磷灰石涂膜具有生物可吸收性，以致羟磷灰石涂膜通过参与骨骼重建 过程而被去除。

从上述实验实例可以看出，用具有混合型网状形态和岛状形态的低结晶 羟磷灰石涂覆的植入体将促进细胞分化以及钙化结节的形成。总的说来，可 以确定，本发明的涂有低结晶羟磷灰石的涂膜呈现优良的生物相容性。此外， 还可以看出，本发明的植入体可用作优良的生物材料，其通过参与骨骼重建 过程而具有生物可吸收性，并且可改善涂膜的剥离现象以及由此引起的植入 体分离问题。