一种利用SILAC整体标记果蝇蛋白质组的方法及专用培养基

摘要

本发明公开了一种利用SILAC标记果蝇蛋白质组的方法及专用培养基。本发明提供的SILAC标记果蝇专用培养基，按照如下方法制备：将SILAC标记的酵母菌体涂布在果蝇培养基上，得到SILAC标记果蝇专用培养基。本发明的实验证明，本发明开发的一种用于果蝇SILAC标记的培养基，可以专门用于SILAC标记果蝇蛋白质组，可以实现快速、高效地标记，为定量内标的制备和高精度地定量蛋白质组研究创造了条件。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用SILAC整体标记果蝇蛋白质组的方法及专用培养基。 

背景技术

果蝇（Drosophila melanogaster）是个体微小的昆虫。自从摩尔根开始利用它研究遗传学以来，果蝇逐渐成为遗传学、生理学、发育和进化生物学研究的模式生物。由于果蝇具有生长快、易饲养和繁殖、易维持大群体、价廉、表型丰富且绝大多数信号途径与高等生物一致等诸多优点，使得果蝇成为了现代生物学研究中的金虫。 

蛋白质是生物功能的直接执行者。蛋白质组学是系统鉴定和定量细胞内蛋白质，并研究其生物学功能的新兴学科。随着果蝇基因组测序的完成和蛋白质组学研究技术的快速发展，科学家已经可以实现果蝇蛋白质组鉴定的目标。蛋白质组的定量比较是研究基因突变或生物学处理及其效应关系的有效手段，也是当前蛋白质组学研究的重点领域。至今已有果蝇定量蛋白质组学的报道。如Brunner等利用ICAT技术定量比较了果蝇的蛋白质组。Xun等定量比较了帕金森病的果蝇模型。Krijgsveld等利用¹⁵N标记的酵母饲喂果蝇，得到了¹⁵N标记的果蝇，开始了果蝇体内标记和定量蛋白质组学的研究。但由于¹⁵N标记的蛋白质组同位素分布宽，轻重标之间容易重叠导致定量精度低，且轻重标难于区分，易产生假阳性等技术难题，使得定量蛋白质组学逐渐转向基于细胞培养过程中的重稳定性同位素标记氨基酸的整体蛋白质组标记技术（stable isotope labeling by amino acid in cell culture，SILAC）这一定量蛋白质组学研究的金标准。 

Mann研究小组利用SILAC技术对果蝇的SL2细胞系进行了研究，鉴定和定量了6000多个蛋白质，并比较了mRNA和蛋白质丰度的关联关系。尽管SILAC刚开始只是用于培养的细胞，如酵母、哺乳动物细胞等，最近SILAC标记整体小鼠的成功开创了整体动物重稳定性同位素标记的先河。Sury等利用SILAC技术标记了整体果蝇，但因技术限制，其标记效率只能达到96%左右，影响了定量的精度和检测的灵敏度。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种SILAC标记果蝇专用培养基。 

本发明提供SILAC标记果蝇专用培养基，按照如下方法制备：将SILAC标记的酵母菌体涂布在果蝇培养基上，得到SILAC标记果蝇专用培养基。 

上述果蝇培养基由低熔点琼脂糖、葡萄糖、对羟基苯甲酸甲酯、乙酸乙酯和水组成；所述低熔点琼脂糖、所述葡萄糖、所述对羟基苯甲酸甲酯、所述乙酸乙酯的质量 比为0.8：10：0.002：0.8。 

上述果蝇培养基组分具体浓度如下：所述低熔点琼脂糖在所述果蝇培养基中的浓度为0.8%（质量百分含量）；所述葡萄糖在所述果蝇培养基中的浓度为10%（质量百分含量）；所述对羟基苯甲酸甲酯在所述果蝇培养基中的浓度为0.002%（质量百分含量）；所述乙酸乙酯所述琼脂在所述果蝇培养基中的浓度为0.8%（质量百分含量）。 

其中果蝇培养基组分中对羟基苯甲酸甲酯以对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液的形式加入果蝇培养基中，对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液按照如下方法制备：将对羟基苯甲酸甲酯溶于95%乙醇水溶液中得到的混合液，且对羟基苯甲酸甲酯在混合液中的浓度为10%（质量百分含量）。 

上述专用培养基中，所述SILAC标记的酵母菌体按照如下方法制备：将赖氨酸营养缺陷型酵母菌株在含有重稳定性同位素标记赖氨酸的SILAC标记酵母专用培养基中培养，收集菌体，得到SILAC标记的酵母菌体。 

本发明的实施例中的赖氨酸营养缺陷型酵母菌株为敲除菌株BY4741△YBR115C，购自Saccharomyces Genome Deletion Project。 

上述含有重稳定性同位素标记赖氨酸的SILAC标记酵母专用培养基按照如下方法制备：由酵母氮源基础、葡萄糖、重稳定性同位素标记的赖氨酸、腺苷、尿嘧啶、色氨酸、组氨酸、精氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和水组成；所述酵母氮源基础在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度为7g/L；所述葡萄糖在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度为20g/L；所述重稳定性同位素标记的赖氨酸L-lysine-¹³C₆在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度为164.3μM；所述腺苷、所述尿嘧啶、所述色氨酸、所述组氨酸、所述精氨酸、所述蛋氨酸在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度均为20mg/L；所述酪氨酸、所述亮氨酸、所述异亮氨酸在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度均为30mg/L；所述苯丙氨酸在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度为50mg/L；所述谷氨酸和所述天冬氨酸在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度均为100mg/L；所述缬氨酸在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度为150mg/L；所述苏氨酸在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度为200mg/L；所述丝氨酸在所述SILAC标记酵母专用培养基中的浓度为400mg/L。上述SILAC标记酵母专用培养基中的重稳定性同位素标记的赖氨酸为L-lysine-¹³C₆；也可以为其它质量数不同的重稳定性同位素标记赖氨酸，如L-lysine-¹³C₆¹⁵N₂等。 

上述SILAC标记的酵母菌体制备方法中，所述培养的方式为30℃培养9代，共培养18h。 

上述专用培养基在SILAC标记果蝇蛋白质组中的应用也是本发明保护的范围。 

本发明的另一个目的是提供一种SILAC果蝇培养基标记果蝇蛋白质组的方法。 

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的SILAC标记果蝇专用培养基培养果蝇的卵至发育成成虫，得到SILAC整体标记果蝇蛋白质组的果蝇，实现SILAC整体标记果蝇蛋白质组。 

上述方法中，所述果蝇的卵为将成对的雌雄果蝇在上述的专用培养基上培养、产卵得到。 

本发明的实验证明，本发明开发的一种用于果蝇SILAC标记的培养基，可以专门用于SILAC标记果蝇蛋白质组，并可以实现快速、高效地标记，为定量内标的制备和高精度地定量蛋白质组研究创造了条件。 

附图说明

图1为重稳定性同位素标记氨基酸完全标记的酵母菌 

图2为含有SILAC标记培养基的果蝇培养装置 

图3为SILAC标记培养基养殖的果蝇与普通果蝇的比较 

图4为SILAC标记培养基养殖果蝇标记效率测试 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

本发明可以通过以下实例更容易地理解，但本发明并不仅限于这些实例。 

实施例1、SILAC标记酵母菌体的制备 

一、SILAC标记酵母专用培养基的制备 

每1L的SILAC标记酵母专用培养基（含有重稳定性同位素标记的氨基酸的SC培养基）的组分如下：7g Difco酵母氮源基础（美国BD公司，货号：239210）、20g葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司，货号：10010592）、164.3μmol的重稳定性同位素标记的赖氨酸L-lysine-¹³C₆（美国CIL公司，货号：CNLM-291-0.25）、20mg的腺苷（美国Amresco公司，货号：0325-50G0325-50G）、20mg尿嘧啶（美国Amresco公司，货号：0847-250G0847-250G）、20mg色氨酸（美国Amresco公司，货号：E800-25G）、20mg组氨酸（美国Amresco公司，货号：E806-100G）、20mg精氨酸（美国Amresco公司，货号：0877-100G）、20mg蛋氨酸（美国Amresco公司，货号：E801-100G）、30mg酪氨酸（美国Amresco公司，货号：E821-25G）、30mg亮氨酸（美国Amresco公司，货号：E811-100G）、30mg异亮氨酸（美国Amresco公司，货号：E803-25G）、50mg苯丙氨酸（美国Amresco公司，货号：0991-100G）、100mg谷氨酸（美国Amresco公司，货号：0421-1KG）、100mg天冬氨酸（美国Amresco公司，货号：0192-500G）、150mg缬氨酸（美国Amresco公司，货号：1B1102-25G）、200mg苏氨酸（美国Amresco 公司，货号：E808-25G）、400mg丝氨酸（美国Amresco公司，货号：1B1103-25G），用水补齐体积。 

二、SILAC标记酵母菌体的获得及验证 

1、SILAC标记酵母 

从YPD固体培养平板上挑取裂殖酵母赖氨酸营养缺陷型菌株（敲除菌株BY4741△YBR115C，购自Saccharomyces Genome Deletion Project）新鲜的菌落，转接到YPD液体培养基（每升中含有10g细菌酵母提取物、20g细菌蛋白胨、20g葡萄糖）中，生长过夜，得到种子培养液；在无菌的条件下离心种子培养液收集酵母细胞，以无菌水洗两次，并以无菌水重悬后取一定量接种到上述SILAC标记酵母专用培养基，使得起始菌体的终浓度为0.0023OD(A₆₀₀)，30℃培养9代共18小时后，达到菌体的终浓度为1.2OD(A₆₀₀)，再经10000g离心5分钟收集菌体，得到SILAC标记酵母菌体，-80℃冻存备用。 

2、SILAC标记酵母菌体的验证 

1）总蛋白的提取 

以10mM pH8.0的Tris、0.1M的NaH₂PO₄、8M尿素、0.02%SDS和10mMβ-巯基乙醇作为蛋白提取液，以玻璃珠（Biospec Products Inc.,Bartlesville）震荡破壁法裂解SILAC标记酵母菌体。菌体-玻璃珠混合液在旋涡混合器上最高速震荡1分钟，在冰上冷却1分钟，共14次得到裂解产物，再将裂解产物在17000g的条件下离心5分钟，得到总蛋白。用常用的Bradford法定量后用于蛋白酶消化，结果为总蛋白的浓度约为10μg/μl。 

2）消化 

取5μg总蛋白经终浓度为5mM的DTT处理30分钟，并以终浓度为20mM的碘乙酰胺避光25℃下处理30分钟，再加入尿素至终浓度为8M变性30分钟，以50MmNH₄HCO₃稀释尿素至4M浓度，以10ng/μl的赖氨酸蛋白酶C（Lys-C，日本Wako公司，货号：125-05061)37℃消化14小时，得到肽段。 

3）色谱-质谱联用分析 

将上述所得的肽段以C18柱脱盐(3M,St.Paul,MN)，以10μl的5%乙腈和1%甲酸的色谱-质谱联用上样缓冲液进行溶解，取2μl进行色谱-质谱联用分析，具体参照Xu,P.;Duong,D.;Peng,J.,Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.J Proteome Res 2009,8(8),3944-50中记载的方法。以SILAC标记前酵母菌体按照上述方法制备蛋白、检测为对照。 

随机选取ATP结合蛋白SSA2肽段NQAAMNPANTVFDAK，结果如图1所示，可以看出，SILAC标记酵母菌体为完全标记酵母菌体，在9代后完全标记，且检测不 到含有天然的轻同位素的赖氨酸的肽段。 

三、对照轻标记酵母菌体和对照酵母菌体的获得 

对照轻标记培养基与SILAC标记酵母专用培养基组分基本相同，不同的是将重稳定性同位素标记的赖氨酸L-lysine-¹³C₆替换为普通的轻同位素标记赖氨酸（美国Amresco公司，货号：0437-100G） 

YPD培养基：1%细菌酵母提取物Bacto-yeast extract（美国Amresco公司，货号：J850-1KG），2%细菌蛋白胨bacto-peptone（美国Amresco公司，货号：J636-500G），2%葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司，货号：10010592），2%细菌培养基用琼脂粉（美国Amresco公司，货号：J637-500G）。 

采用上述二的1的方法，将酵母BY4741△YBR115C分别在对照轻标记培养基和YPD培养基中培养，得到对照轻标记酵母菌体和对照YPD酵母菌体。 

实施例2、SILAC标记果蝇专用培养基的制备 

1、SILAC标记果蝇专用培养基制备 

每1L的果蝇培养基的组分如下：质量百分含量为0.8%的Bio-Rad低熔点琼脂糖（Bio-Rad Hercules,CA）、质量百分含量为10%的葡萄糖、质量百分含量为0.002%对羟基苯甲酸甲酯、终浓度为0.8%乙酸乙酯和水混合，用水定容到1升。 

SILAC标记果蝇专用培养基按照如下方法制备：在上述果蝇培养基上涂布由实施例1的二的1得到的SILAC标记酵母菌体（重稳定性同位素标记的酵母菌体），得到标记果蝇的SILAC标记培养基。 

2、对照果蝇SILAC轻标记培养基 

对照果蝇SILAC轻标记培养基：与SILAC标记果蝇专用培养基的制备方法基本相同，不同的是涂布由实施例1的三得到的对照轻标记酵母菌体； 

对照YPD果蝇培养基：与SILAC标记果蝇专用培养基的制备方法基本相同，不同的是涂布由实施例1的三得到的对照YPD酵母菌体。 

实施例3、SILAC标记果蝇专用培养基在完全标记果蝇蛋白质组中的应用 

一、SILAC标记 

1、材料 

选用野生型果蝇w118株（以下简称果蝇W118D；melanogaster w1118，购自美国印地安娜大学的果蝇保藏中心（Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University）进行试验，在标准的果蝇培养基、25℃和70%湿度条件下培养。 

2、标记 

SILAC标记：将100只雌性果蝇w118和100只雄性果蝇w118混养在上述SILAC标记果蝇专用培养基上产卵；再将卵随后移种到插入折叠3次的3M滤纸的并含有上 述SILAC标记果蝇专用培养基的果蝇培养管中（图2），每管约100个卵，在70%湿度条件下25℃培养箱中培养，孵化成幼虫，经由蛹的阶段，发育成成熟的果蝇，得到SILAC标记果蝇。 

对照SILAC轻标记果蝇：采用同样的方法将成对果蝇在对照果蝇SILAC轻标记培养基进行产卵、培养得到对照SILAC轻标记果蝇； 

对照YPD果蝇：采用同样的方法将成对果蝇在对照YPD果蝇培养基进行产卵、培养得到对照标记果蝇。 

二、检测 

1、外形观察 

SILAC标记果蝇（重标SD培养基）、对照SILAC轻标记果蝇（轻标SD培养基）和对照标记果蝇（YPD培养基）观察，结果如图3所示，A为用SILAC标记果蝇流程图；B为分别用YPD培养基、轻标SD培养基、重标SD培养基培养的酵母饲养的果蝇的蛹的形态比较；C为分别用YPD培养基、轻标SD培养基、重标SD培养基培养的酵母饲养的果蝇的成虫眼睛，身体及翅膀的形态比较，可以看出，用上述培养基和方法培养的标记后果蝇，形状和普通培养基培养的果蝇完全一致。 

2、质谱检测 

1）总蛋白的提取：将上述一得到的SILAC标记果蝇按照实施例1的第二部分2的1）的方法提取； 

2）消化：与实施例1的第二部分2的2）相同； 

3）色谱-质谱联用分析：与实施例1的第二部分2的3）相同； 

随机选取蛋白二硫键异构酶的酶解肽段(DNEIAIIGFFK)，结果如图4A所示，SILAC标记果蝇为完全标记果蝇，在1代后就能完全标记，检测不到含有天然的轻同位素的赖氨酸的肽段。这种重稳定性同位素完全标记的果蝇适于高精度定量蛋白质组学研究。 

3、SILAC完全标记果蝇标记效率的测定 

上述SILAC标记果蝇的制备过程中分别在零天（卵）和幼虫1期（L1）、2期（L2）、3期（L3）和成虫阶段取样，按照上述2提取总蛋白、消化和色谱-质谱联用分析，计算标记效率（为重标氨基酸替换轻标氨基酸的比例）。对每个样品的定量结果进行轻、重标定量值的对数的分布分析。实验重复三次，结果取平均值。 

结果如图4B和表1所示，显示在L1、L2、L3的标记效率分别为：80%、95%、和96%，在成虫样品中基本检测不到轻标的肽段，系统检测发现其标记效率在98%以上。表明经过一代养殖，可以实现果蝇的完全标记。这种重稳定性同位素完全标记的果蝇适于高精度定量蛋白质组学研究。 

表1果蝇蛋白质组的标记率 

^#标记效率=标记后的重标信号/总信号。