定量蛋白质组学技术近年来发展迅速。其中细胞培养氨基酸稳定同位素标记(Stableisotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)技术以其高通量和高准确性等优点，在定量蛋白质组学研究中应用广泛。本研究改进和优化了脉冲式SILAC技术结合线性离子阱傅立叶变换离子回旋共振质谱(hybrid linear ion trap fourier-transform ioncyclotron resonance mass spectrometer,LTQ-FT)的定量方法，并应用于筛选miR-128在神经胶质瘤中靶基因的研究。另外，针对LTQ-FT质谱不同采集方法的特点，优化和建立了针对不同复杂程度样本的质谱采集方法。 神经胶质瘤具有高度的侵袭性和浸润性，目前仍是世界上最难治愈的恶性肿瘤之一。尽管近年来在手术和放疗等技术上取得了很大的进步，但对胶质瘤的治疗仍是目前困扰医学界的一大难题。因此研究神经胶质瘤的发病机制，寻找合适的药物治疗靶点对提高治疗效果和延长生存期具有重要的意义。近年来，microRNA的发现为研究胶质瘤形成和发展的分子机制以及寻找新的治疗方法开辟了一条新的途径。前期研究表明，miR-128在神经胶质瘤细胞中表达下降，且有抑制其增殖的作用。随后的研究发现miR-128可通过靶基因E2F3a、BMI-1等抑制其增殖，但过表达E2F3a并不能完全弥补有miR-128引起的增殖抑制，也说明了miR-128除了E2F3a、BMI-1外还存在着其它靶基因。目前寻找某个特定miRNA靶基因的方法主要有生物信息学软件预测和生物学实验的验证。前者的假阳性率较大，后者由于受实验条件等限制，能检测的mRNA或蛋白数较少。另外，由于不同蛋白质半寿期的差异，很难同时观察多种蛋白质合成的动态变化。而miR-128根据miRand、PicTar、TargetScan等生物信息学软件的预测就有近两干个靶基因，因此使用传统的生物学实验进行逐一验证几乎是不现实的。2008年，Rajewsky等将定量蛋白质组学技术一脉冲式稳定同位素标记氨基酸培养法(pulsed stable isotope labelling with aminoacids in cell culture，pSILAC)运用到miRNA的研究中，并筛选到了上百个靶基因。但实验中采用中标氨基酸培养miRNA转染的细胞，而新生成的蛋白由于受到本底蛋白同位素峰簇的重叠而导致定量结果升高，可能会产生假阴性结果。本研究改进和优化了pSILAC技术，避免本底蛋白的干扰，以准确观察miR-128对神经胶质瘤细胞蛋白合成的整体影响，从而寻找潜在的靶基因，为全面解析miR-128对细胞的抑制机制提供线索，帮助寻找合适的治疗靶点来开发新的药物、提高神经胶质瘤的治疗效果。 本论文由三个部分组成。第一部分概述了定量蛋白质组学的技术进展，着重阐述了SILAC定量技术高通量、高准确度的特点及其最新应用进展，以及pSILAC在筛选miRNA靶基因研究中的优势。另外，介绍了神经胶质瘤的高死亡率和难治性的现状，提出研究神经胶质瘤的发病机制，寻找miR-128作用靶点的重要意义。 论文第二部分分析了pSILAC技术在筛选miRNA靶基因实验设计中的不足，提出改用重标氨基酸培养miRNA转染细胞，重标氨基酸培养对照组细胞的方法，以降低高浓度本底蛋白对定量结果的干扰，并建立了相应的技术平台。然后利用优化后的pSILAC技术，筛选miR-128在神经胶质瘤细胞中潜在的靶基因。两次重复实验最终鉴定到1897个蛋白(protein groups)，其中1459个有定量信息。转染miR-128后表达下降30％的蛋白有133个。经过与生物信息学预测的结果相结合，挑选了十六个蛋白进行荧光素酶实验验证，其中CCNK、TPP2、MCCC2、UBA2、NNMT、ARL8B、SFRS1、PFKL、GLTP和PHGDH与荧光素酶报告基因实验结果一致，提示其可能是miR-128潜在的作用靶基因。该结果证实优化后的pSILAC技术是一种筛选miRNA靶基因的有效手段。另外我们对用质谱定量数据挑选靶基因的标准进行了探讨，发现如果仅仅依靠软件自动识别和计算得出的结果，对某些蛋白可能会导致较大的定量误差。因此最好对要进行生物学验证候选蛋白的原始图谱进行手工检查，以保证定量结果的准确性。最后我们用蛋白质相互作用网络预测软件STRING8.2，对转染miR-128后I-IfM<0.85的差异蛋白质构建蛋白质相互作用网络，发现有相互作用的蛋白质有294个，构成689对相互作用。再用Cytoscape对大于10个节点数的蛋白质进行过滤，总共得到24个蛋白。发现其中最多的是核糖体蛋白，占29.2%；其次是翻译起始因子，占25%；核糖体蛋白是蛋白质合成的场所，而翻译起始因子在蛋白质合成过程中起关键的调控作用，这两类蛋白在miR-128转染后表达下降，可能与miR-128抑制神经胶质瘤细胞的增殖密切相关。 论文第三部分探讨了线性离子阱-傅立叶变换离子回旋共振质谱(LTQ-FT)的数据采集模式对蛋白质组鉴定结果的影响，比较和分析了针对不同复杂程度样本的最佳采集模式。对于Q-乳清蛋白等四种标准蛋白质酶切肽段混合物的简单体系，在傅立叶变换离子回旋共振腔中选3个最强母离子进行选择离子监测扫描后再实施二级碎裂的方法(SIM3)得到的肽段覆盖率分别是直接选10个最强母离子进行二级碎裂(FT10)方法得到的肽段覆盖率的1.5-1.9倍。另外对酵母蛋白酶切肽段混合物的复杂体系鉴定时，只采集双电荷和三电荷母离子进行二级扫描的方法(FT1023)比单电荷、双电荷和三电荷都采集的方法(FT10_123)，得到的图谱鉴定成功率提高64.1%。实验最后还对不同数据采集模式下图谱的特点进行了考察。本研究提示针对不同复杂程度的样本，应采取相应的质谱数据采集方法。
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