一种昆嵛林蛙改造体抗菌肽及其制备方法和应用

摘要

本发明属于生物医学技术领域，具体地说是一种昆嵛林蛙（Rana kunyuensis抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-3及其制备方法和应用。改造体抗菌肽为昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-3，其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1587.97Da，等电点8.96。本发明改造抗菌肽Kunyuenin-3具有极强的抗氧化活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体地说是一种昆嵛林蛙（Rana  kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-3及其制备方法和 应用。

背景技术

自由基指任何包含一个未成对电子的原子或原子团。生物体与外界接 触和自身产生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基、羟 自由基、过氧化氢、脂质过氧自由基、二氧化氮、一氧化氮自由基、单线 态氧和臭氧。在较高浓度下，活性氧自由基对生物细胞的细胞结构、核酸、 脂类和蛋白质造成损伤。造成DNA损伤，进一步引起复制错误、基因组不 稳定、转录意外起始或终止，从而导致生物体变异或疾病发生；引起细胞 膜流动性和通透性改变，导致细胞结构和功能改变；引起蛋白质氧化，导 致蛋白质变性和失活。

目前发现，活性氧自由基与多种人类疾病有关，如癌症、心脑血管疾 病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森 病和衰老等。为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中 生物体形成多种不同的自由基清除系统，包括非基因编码的小分子物质， 如尿酸、维生素C、维生素E、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶Q等；基因编码 的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶、 硫氧还蛋白酶系统和谷胱甘肽酶系统；基因编码的小分子抗氧化肽类，如 从两栖类蛙科动物皮肤中发现的各种小分子抗氧化多肽。各种不同类型的 自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力，如维生素C、超氧 化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。

昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)属于两栖纲无尾目蛙科蛙属，为中国特 有种，仅分布于山东省烟台市昆嵛山。目前关于昆嵛林蛙形态、发育和分 子进化已有报道，但是关于昆嵛林蛙来源抗氧化多肽的研究还没有报道。

发明内容

本发明的目在于一种昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin 改造体抗菌肽Kunyuenin-3及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种昆嵛林蛙改造体抗菌肽，改造体抗菌肽为昆嵛林蛙（Rana  kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-3，其是直链多肽，含有 14个氨基酸残基，分子量1587.97Da，等电点8.96。

所述改造体抗菌肽为：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨 酸－丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－精氨酸－ 赖氨酸－半胱氨酸。

改造体抗菌肽的应用，所述所述的改造体抗菌肽用于制备抗氧化药物 或化妆品添加剂的用途。

本发明的有益效果在于：本发明根据昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的氨 基酸序列，利用分子改造方法设计Kunyuenin的改造体Kunyuenin-3，该改 造体具有极强的抗氧化活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、 制备方法简单等有益特点。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不 局限于此。

实施例1

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因克隆：

1）昆嵛林蛙皮肤总RNA提取：

①取300mg昆嵛林蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转 移到EP管中，加入1m1总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Invitrogen公 司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟， 而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离 心10分钟，收集沉淀用75％（V/V）乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为昆 嵛林蛙皮肤总RNA。

2）昆嵛林蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TM Directional cDNA Library Construction Kit。

（1）cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

①经DEPC处理（DEPC处理是在含0.1％（V/V）DEPC的水浸泡过夜，高 压灭菌，烘干）的离心管中加入1μl昆嵛林蛙皮肤总RNA、1μl 3’端 一链合成引物（3’In-Fusion SMARTer CDS Primer）和2.5μl DEPC处理 的水（DEPC处理的水是含0.1％（V/V）DEPC的水，放置过夜，高压灭菌） 使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心（2000rpm，30s），离心后于72 ℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂（均为CLONTECH公司In-Fusion  SMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配 备），2.0μl 5×第一链缓冲液、0.25μl 100mM DTT、1.0μl 10mM dNTP Mix、1.0μl SMARTer V Oligonucleotide、0.25μl RNase Inhibitor  和1.0μl SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中 试剂并短暂离心（2000rpm，30s），在42℃保温90min，然后68℃保温 10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μ l所合成的cDNA第一链备用。

（2）采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链（所用试 剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA Library  Construction Kit建库试剂盒中配备）

①将2μl cDNA第一链（mRNA反转录）、80μl去离子水、10μl 10 ×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、 2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix 在95℃预热的PCR管中进行混合。

②在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，1min；18个循环：95℃，15sec， 65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链 －80℃保存。

（3）昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因克隆筛选：

根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列 为5’-CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司 In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit中的 3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR反应在如下 条件下进行：94℃4min，94℃30sec，57℃30sec和72℃1min， 30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒（天根生物）进行目的片段回收。 将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化进 CaCl₂-MgCl₂法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白 斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌 落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。

测定结果：

编码昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No.1 所示：

atgttcaccttgaagaaatccctgttgcttcttttcttccttgggatcatcaacgtatct  60

ctctgtgaggaagagagaaatgccgaggaagaaagaagagatgatcccgaagaaagggcc  120

gttgaggtggaaaaaagatttttaccattttttgcagcatgtgcaattaccagaaaatgt  180

ggaaaatgatttttctaaatacacatcgggtgtcttataaaaaataaagatgaagcctac  240

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa                       279。

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因核苷酸的序列表为：序列长度为279 个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA， 来源：昆嵛林蛙皮肤。

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的化学合成：

Ⅰ、昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的化学合成方法：根据基因推导的成熟 肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全 序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。

Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 （MALDI-TOF）。

Ⅲ、纯化的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin用高效液相色谱HPLC方法鉴定 其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 （MALDI-TOF），等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基 酸序列结构。

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin是昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因编码的 一种环状多肽，含有十四个氨基酸残基，分子量1584.97Da，等电点8.96。 昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin全序列为：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙 氨酸－苯丙氨酸－丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－异亮氨酸－苏氨 酸－精氨酸－赖氨酸－半胱氨酸，其中两个半胱氨酸残基之间形成一对分 子内二硫键，且C末端酰胺化。

制备Kunyuenin-3：

Ⅰ、Kunyuenin-3的制备方法：根据上述Kunyuenin的氨基酸序列，用 自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，利用HPLC反 相柱层析脱盐。

Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 （MALDI-TOF）。

Ⅲ、纯化的Kunyuenin-1用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子 量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），等电聚焦 电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

测定结果为：

Kunyuenin-3是昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的一种改造体。Kunyuenin-3 是一种直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1587.97Da，等电点8.96。 Kunyuen in-3全序列为：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸 －丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－精氨酸－赖 氨酸－半胱氨酸。

实施例2Kunyuenin-3药理实验：

1.Kunyuenin-3抗氧化活性测定：

DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate）（2,2′-二苯代苦味酰 基苯肼）用甲醇溶解配成6×10^-5M的溶液。将48μl DPPH溶液分别与上述2 μl不同浓度的Kunyuenin-3样品混合，分别室温下避光静置30min，并分别 于517nm处测定吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验 做三个平行（表1），紫外分光光度计调零时使用甲醇。

DPPH·清除率(％)=(AB－AA)/AB×100（AB:空白对照组吸光值;AA:样品 组吸光值）。

表1.Kunyuenin-3抗氧化活性

结果如表1所示，Kunyuenin-3具有极强的抗氧化活性，且其活性随着 浓度的升高而逐步增强。在样品浓度为400μg/ml时，其DPPH清除率I％ 达到65.2％。

2.Kunyuenin-3抗菌活性检测

分别挑取保存于斜面上的试验菌株（金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄 色葡萄球菌090223+和星形诺卡菌090312+）均匀涂布于MH固体培养基（购 自青岛海博生物技术有限公司）平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸 片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的Kunyuenin-3 样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若 样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越 大表明样品抗菌活性越强。3.Kunyuenin-3最小抑菌浓度（Minimum  Inhibitory Concentration）测定：

试验菌株分别接种到MH液体培养基中（购自青岛海博生物技术有限公 司），37℃振荡培养到对数生长期，而后将培养至对数生长期的培养液用新 鲜MH液体培养基稀释到2×10⁵cfu/ml。

取1.9mL上述稀释的细菌培养液，加入经0.22m孔径膜过滤的2 mg/ml的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin-3样品溶液0.1mL作为第一管,第一管 混匀后取出1mL加入第2管中，依次倍比稀释（参见表2），自第9管吸出 1mL弃去，第10管系对照管。

表2稀释方法

上述各管混匀后放置37°C缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测 定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表3 所示。

由表3可见，Kunyuenin-3对三株实验菌株不具有抗菌活性。

表3.Kunyuenin-3抗菌活性

  菌株   MIC(μg/ml)

  金黄色葡萄球菌ATCC25923   >100   金黄色葡萄球菌090223+   >100   星形诺卡菌090312+   >100

MIC：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值。

4.Kunyuenin-3溶血活性测定：

将采集的兔血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的 Kunyuenin-3样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清 液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100， 溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％=A_样品-A_阴性对照/A_阳性对照×100％。结 果表明样品浓度为100μg/ml，Kunyuenin-3的溶血百分比为20.8％，说明 Kunyuenin-3具有较低的溶血活性，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体 产生伤害，因此十分利于其在医药和化妆品领域进一步的开发应用。