一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法

摘要

本发明公开了一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其包括以下步骤(1)谷子育种材料细胞质类型的划分；(2)桥梁父本的创制；(3)不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂三交1代的创制；(4)不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄性不育系的创制。通过该方法培育出不同胞质类型不育系，不但丰富了现有不育材料的胞质类型，为培育不同胞质类型的杂交种奠定基础，可解决以前由于胞质类型单一，容易遭受专化性病害侵染的难题，避免由于细胞质专化性病害的侵染给农业生产带来的巨大损害。而且本发明培育的谷子不育系还具有抗咪唑乙烟酸特性，解决了不育系繁种过程中除草困难的难题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种谷子雄性不育系的培育方法，具体涉及一种不同 胞质类型谷子雄性不育系的培育方法，更具体涉及一种不同胞质类型 抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，属于雄性不育利用 研究领域。

背景技术

刘正理等通过系谱追踪发现，目前谷子杂优利用研究中应用的雄 性不育系细胞质类型，春谷雄性不育系几乎全部由“长10A”衍生而 来，细胞质来源于“沁园母鸡嘴”(Crop science，2011，51(4)：1655 -1663)；夏谷雄性不育系几乎全部由“黄米1A”衍生而来，细胞质 来源于“大黄谷”(刘正理等，华北农学报，2006，21(增刊)：103 -109)，谷子不育系细胞质类型过于单一，而细胞质呈母系遗传，因 此不育系胞质类型的单一必然导致杂交种细胞质类型的单一。由于细 胞质存在有专化性侵染病害，一旦遇专化性病害侵染，将会给谷子生 产上带来毁灭性损失。

传统的谷子雄性不育系的培育方法是依据性状互补的原则，以不 育系做母本，选用能弥补不育系缺点的常规品种做父本进行杂交，利 用杂交后代分离的不育材料，进行套袋自交，经过连续多代的选择， 从中选育不育系。这种传统的不育系选育方法具有选育速度快、后代 易稳定的优点，但由于母本均为原有的不育系，而细胞质呈母系遗传， 因此，选育的不育系的细胞质类型仍为原有类型，通过这种方法选育 的不育系并没有创制出新型细胞质类型的不育系。因此，传统的不育 系选育方法不但不能解决不育系细胞质类型过于单一的问题，反而由 于人们对骨干不育系的集中利用，使胞质来源单一的问题日益严重； 同时，由于选用的常规材料多为育成品种的杂交后代，仅具有一些能 克服不育系缺点的普通性状，缺少特殊的有益性状，导致选育的不育 系不但胞质类型单一，而且缺乏谷子生产急需的抗除草剂等特殊有益 性状，遗传基础也非常狭窄，与常规品种亲缘关系越来越近，不易配 制强优势杂交种。到目前为止，在谷子上，未见开展不同胞质类型不 育系培育的报道，更未见培育不同胞质类型抗咪唑乙烟酸不育系的报 道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述谷子雄性不育系细胞质类型单一、不 抗除草剂的技术缺陷，而提供一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂 谷子雄性不育系的培育方法。

本发明的原理是将谷子育种材料细胞质来源进化树与谷子育种 材料的母本衍生进化图结合，在确定对进化树进行纵切的特定遗传相 似系数的基础上，对现有谷子育种材料的细胞质类型进行划分；将现 有不育系的不育基因导入到含有抗咪唑乙烟酸基因的谷子正常可育 株中，创制桥梁亲本，通过桥梁亲本将不育基因和抗咪唑乙烟酸基因 遗传给后代；以桥梁亲本为父本，以不同胞质类型、具有目标性状的 系列常规材料做母本，通过母本代换创制出了将新型胞质与不育基 因、抗咪基因聚合到一起三交1代，然后在喷施除草剂杀除不抗除草 剂后代的基础上，对抗除草剂的不育后代连续套袋自交4-6代，辅之 以连续的人工定向选择，即可培育出不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸除 草剂谷子雄性不育系。

本发明主要的发明点在于对不同细胞质来源的谷子育种材料类 型进行划分、利用桥梁父本将不育基因和抗咪唑乙烟酸除草剂基因遗 传给后代、利用母本代换创制系列不同胞质类型的三交1代，进而培 育不同胞质类型抗除草剂的谷子雄性不育系。

本发明提供了一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性 不育系的培育方法，其特征在于包括以下步骤：I.谷子育种材料细 胞质类型的划分；II.桥梁父本的创制；III.不同胞质类型抗咪唑乙烟 酸除草剂三交1代的创制；IV.不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄 性不育系的创制。

所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的 培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分包括如 下步骤：(1)细胞质来源进化树的构建；(2)母本衍生进化图的构建； (3)特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类；(4)谷子 育种材料细胞质类型的确定。

所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的 培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步 骤(1)所述的细胞质来源进化树的构建包括如下步骤：

①叶片组织的培养与获取：将谷子育种材料的种子种于育苗盘中 获得谷子幼苗，于4叶期分别剪取育种材料的叶片组织；

②全基因组DNA的提取：采用CTAB法提取步骤①中叶片组织 的全基因组DNA；

③PCR扩增：采用20μl反应体系，利用线粒体特异引物对步骤 ②提取的基因组DNA进行37个反应循环PCR扩增；

④多态性检测：利用凝胶电泳法对步骤③中线粒体的PCR扩增 产物进行多态性检测；

⑤细胞质来源进化树的生成：对步骤④中电泳图谱上清晰且可重 复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现的带记为“0”，生成由“1” 和“0”组成的原始矩阵，用NTSYS-pc2.1软件进行数据分析，用SAHN 程序中的UPGMA方法进行聚类分析，生成细胞质来源的进化树。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的 步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建为：利用系谱追踪法将谷子 育种材料按步骤(1)中进化树的排列顺序进行纵向排列，通过逐代 向上追踪育种材料的母本，直到追踪到农家品种为止，依据系谱将同 一母本衍生的育种材料按照衍生关系逐步连接起来，形成母本衍生进 化图。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的 步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类 为：将步骤(2)构建的谷子育种材料的母本衍生进化图与步骤(1) 中构建的谷子育种材料的胞质来源进化树相结合，并进行比较分析， 确定基本能将同一母本衍生系统聚为一个分枝的特定遗传相似系数， 在该遗传相似系数下对步骤(1)中构建的谷子育种材料的胞质来源 进化树进行纵切，将谷子育种材料进行胞质来源的分子聚类，分子聚 类图中每个分枝代表一个胞质类群。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的 步骤(4)所述的谷子育种材料细胞质类型的确定是将步骤(3)中的 分子聚类图与步骤(2)中构建的母本衍生进化图结合，将胞质来源 分子聚类图中的每个分枝与对应的母本衍生系统逐一进行对比，确定 每个类群材料的细胞质类型，完成对谷子育种材料细胞质类型的划 分。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的 步骤(1)所述的细胞质来源进化树的构建中步骤①中所述的谷子育 种材料为：延谷12、长高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、坝 谷214、安9217、保182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、 冀谷22、谷65、冀谷21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫 谷6、大同14、郑9188、大同28、铁8240、锦谷12、锦谷14、朝 438、公谷68、铁487、铁谷6、复532、晋汾1、沧156、济谷13、 长高229A、S80、冀谷29、公谷70、石206065、大同29绿、安2491、 兴谷88、晋15、晋汾3、沧344、Y61、石02399、C138、C208、朝 谷12、K523、L70、铁大粒黄、K359、朝谷13、谷83、衡968、济 9403、冀谷27、济9409、鲁谷10、济谷12、济谷11、谷6、石02521、 石98700、石207382、石207393、石02530、石207286、安4852、 谷3、冀谷25、石207191、长高146A、石207226、石206058、公谷 65、C164、203184早、安2367、石202242、谷57、冀谷24、谷丰2 号、石06-439、谷38、小香米、冀谷19、K1130、坝谷214-2、谷 11、K1011、长农36、冀谷28、长农35、晋谷35、太选5号、太选 2号、晋谷21、谷95、晋谷29、朝谷14、K660、美国大头、谷10、 K546、朝绿-1、晋谷16、石98622和石97672共111份。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的 步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建中111份谷子育种材料中12 份来源于同一母本材料沁源母鸡嘴、13份材料来源于同一母本材料 黄软谷、63份材料来源于同一母本材料日本60日、6份材料来源于 同一母本材料硬穗谷、5份材料来源于同一母本材料黑枝谷，12份材 料未追踪到其母本，便于研究命名为系谱丢失I型和系谱丢失II型。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的 步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类 中特定遗传相似系数为0.74，在该遗传相似系数下对步骤(1)中所 述的细胞质来源进化树的构建中所构建的进化树进行纵切，将其纵切 为7个分枝，每个分枝代表1个胞质来源的分子类群，这样将胞质来 源进化树纵切为7个类群，纵切结果与母本衍生进化图一致性达 98.2％。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的 步骤(4)所述的谷子育种材料细胞质类型的确定中将步骤(3)中所 述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类中构建的分 子聚类图与步骤(2)中所述的母本衍生进化图的构建中所构建的母 本衍生进化图相结合，进行逐一对比，确定各类群材料的胞质类型， 分别为来源于“沁园母鸡嘴”的Q型，来源于“日本60日”的R型， 来源于“黄软谷”的H型，来源于“硬穗谷”的Y型，来源于“黑 枝谷”的S型，还有两种由于系谱丢失，追踪不到母本来源，分别定 名为M I型和M II型。

所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的 培育方法，其特征在于步骤II所述的桥梁父本的创制为：以谷子高度 雄性核不育系做母本，以谷子抗咪唑乙烟酸材料做父本配置杂交组 合，成熟后收获杂种1代种子；种植杂种1代种子于3-5叶期，喷施 咪唑乙烟酸除草剂杀死假杂种，正常成活的植株为含有不育基因和抗 咪唑乙烟酸基因的真杂种，即桥梁父本。

所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的 培育方法，其特征在于步骤II桥梁父本的创制中所述的谷子高度雄性 核不育系材料为长高229A、长高146A、长高117A等其中的一个。

所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的 培育方法，其特征在于步骤II桥梁父本的创制中所述的谷子抗咪唑乙 烟酸材料为M200、M117、M302、M195、M150等其中的一个。

所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的 培育方法，其特征在于步骤III所述的谷子不同胞质类型抗咪唑乙烟酸 除草剂三交1代的创制为：以步骤I中划分的不同胞质类型的谷子育 种材料为母本，以步骤II创制的桥梁父本为父本配制不同胞质三交组 合，获得不同胞质类型抗咪唑乙烟酸三交1代种子。

所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的 培育方法，其特征在于步骤IV所述的不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸雄 性不育系的创制包括如下步骤：

①三交1代假杂种和不抗除草剂单株的去除：种植步骤III中获 得的三交1代种子，于3-5叶期喷施咪唑乙烟酸除草剂，杀除假杂种 和其中不抗咪唑乙烟酸的杂交后代，存活下来的为抗咪唑乙烟酸除草 剂的杂合可育株和纯合可育株，抽穗期全部套袋自交，蜡熟期从中选 择优良单株作为三交2代种子；

②后代的选择：种植步骤①中获得的三交2代种子，于3-5叶期 喷施咪唑乙烟酸除草剂，杀除其中分离的不抗咪唑乙烟酸除草剂的不 育株和可育株，存活下来的为抗咪唑乙烟酸除草剂的不育株和抗咪唑 乙烟酸除草剂的可育株两种类型，抽穗期选择其中的不育株，全部套 袋，蜡熟期按穗行从中选择优良不育单株，作为三交3代种子供下代 继续选择；如此连续经过4-6代的套袋自交和选择，可获得稳定的多 种胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄性不育系。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤II所述的桥梁父本的创制中以谷子不育 系长高229A为母本，以抗咪唑乙烟酸谷子除草剂中间材料M302为 父本配制杂交组合进行Y型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育 系的创制。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤III所述的谷子多种胞质类型抗咪唑乙烟 酸除草剂三交1代的创制为：用Y型胞质谷子育种材料晋谷35为母 本，与上述创制的桥梁父本进行杂交，创制Y型胞质的三交1代。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤II所述的桥梁父本的创制中以谷子不育 系长高146A为母本，以抗咪唑乙烟酸谷子除草剂中间材料M195为 父本配制杂交组合进行S型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育 系的创制。

所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法，其特征在于步骤III所述的谷子多种胞质类型抗咪唑乙烟 酸除草剂三交1代的创制为：用S型胞质谷子育种材料复532为母本， 与上述创制的桥梁父本进行杂交，创制S型胞质的三交1代。

有益效果

利用本发明可培育出不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄性不 育系，丰富了谷子不育系的胞质类型，为培育不同胞质类型的杂交种 奠定基础，可解决由于胞质类型单一，容易遭受专化性病害侵染的难 题，避免由于细胞质专化性病害的侵染给农业生产带来的巨大损害。 同时本发明由于将不育基因和抗咪唑乙烟酸基因聚合在谷子不育材 料中，通过喷施咪唑乙烟酸除草剂，杀除不育系繁种田的杂草，可有 效的解决不育系繁种田人工除草费工费时的难题。

附图说明

图1-1和图1-2是谷子育种材料线粒体的PCR扩增多态性检测图谱；

图中，M为Marker；V1-V111分别代表111份谷子育种材料延谷12、 长高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、坝谷214、安9217、保 182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、冀谷22、谷65、冀谷 21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫谷6、大同14、郑9188、 大同28、铁8240、锦谷12、锦谷14、朝438、公谷68、铁487、铁 谷6、复532、晋汾1、沧156、济谷13、长高229A、S80、冀谷29、 公谷70、石206065、大同29绿、安2491、兴谷88、晋15、晋汾3、 沧344、Y61、石02399、C138、C208、朝谷12、K523、L70、铁大粒 黄、K359、朝谷13、谷83、衡968、济9403、冀谷27、济9409、鲁 谷10、济谷12、济谷11、谷6、石02521、石98700、石207382、 石207393、石02530、石207286、安4852、谷3、冀谷25、石207191、 长高146A、石207226、石206058、公谷65、C164、203184早、安 2367、石202242、谷57、冀谷24、谷丰2号、石06-439、谷38、 小香米、冀谷19、K1130、坝谷214-2、谷11、K1011、长农36、冀 谷28、长农35、晋谷35、太选5号、太选2号、晋谷21、谷95、 晋谷29、朝谷14、K660、美国大头、谷10、K546、朝绿-1、晋谷16、 石98622、石97672的DNA；A为标准条带，“带”的颜色深于或同于 “A”的条带记为“1”，浅于“A”的条带记为“0”。

图2-1、2-2和2-3是111份谷子育种材料的细胞质来源进化树的三个 组成部分，三者按顺序拼接在一起即得进化树全图；

图中，0.55、0.66、0.78、0.89、1.00为遗传相似系数

图3-1、3-2和3-3是111份谷子育种材料的母本衍生进化图的三个组 成部分，三者按顺序拼接在一起即得母本衍生进化图全图；

图中，用实线连接的是母本来源明确的材料；用虚线连接的是母本来 源不明确，但分子聚类将它们与相应的实线部分聚为一个类群的材 料；沁源母鸡嘴、黄软谷、日本60日、硬穗谷、黑枝谷、系谱丢失 I型和系谱丢失II型代表育种材料不同母本的来源。

图4-1、4-2和4-3是111份谷子育种材料的细胞质来源的分子聚类图 的三个组成部分，三者按顺序拼接在一起即得分子聚类图全图；

图中，0.55、0.66、0.78、0.89、1.00为遗传相似系数；L代表对进化 树进行纵切的特定遗传相似系数0.74；B1、B2、B3、B4、B5、B6、 B7表示在特定遗传相似系数0.74下对进化树纵切后形成的7个分子 类群。

图5是谷子育种材料细胞质类型划分图

图中，B1分子类群和沁源母鸡嘴母本衍生系统对应，定位Q型；B2 分子类群和黄软谷母本衍生系统对应，定位H型；B3分子类群和日 本60日母本衍生系统对应，定位R型；B4分子类群和硬穗谷母本衍 生系统对应，定位Y型；B5分子类群对应的母本衍生系统系谱丢失， 定位M I型；B6分子类群和黑枝谷母本衍生系统对应，定位S型； B7分子类群对应的母本衍生系统系谱丢失，定位M II型；a对应图4-1， b对应图4-2，c对应图4-3；d对应图3-1，e对应图3-2，f对应图3-3。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何方式限 制本发明的范围。

具体实施方式

实施例中所用试剂如无特别说明均购自生工生物工程上海有限 公司，所用线粒体特异引物由生工生物工程上海有限公司合成，所用 NTSYS-pc2.1软件由State University of New York，Stony Brook 研制，所用咪唑乙烟酸除草剂购自山东先达化工有限公司生产的苜草 净(原药含有5％咪唑乙烟酸有效成分)。所用111份谷子育种材料 来自我国华北夏谷生态区、西北春谷生态区、东北春谷生态区的河北、 河南、山东、辽宁、吉林、山西、内蒙、陕西8个省区(详见表1)。 所用谷子高度雄性核不育系材料长高229A、长高146A、长高117A来 源于山西省农业科学院谷子研究所，谷子抗咪唑乙烟酸材料M200、 M117、M302、M195、M150为本所资源材料。

表1 111份供试材料的一览表

实施例1：谷子H型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育系的培育

1、谷子育种材料胞质类型的划分

(1)细胞质来源进化树的构建

①叶片组织的培养与获取：将延谷12、长高117A等111份谷子 育种材料(见表1)的种子分别种于育苗盘中获得了谷子幼苗，于4 叶期分别剪取育种材料的叶片组织；

②全基因组DNA的提取：采用CTAB法提取步骤①中叶片组织 中全基因组DNA；

③PCR扩增：采用20μl反应体系，利用生工生物工程上海有限 公司合成的表2中的23对线粒体特异引物通过37个反应循环，对步 骤②提取的基因组DNA进行PCR扩增。20μl反应体系包括Taq酶 (5U/μL)0.2μL、10×buffer 2.0μL、dNTP(2.0mM)2.0μL、FPrime 1.0μL、 RPrimer 1.0ML、DNA 2.0μL、ddH2O11.8μL。PCR扩增共进行37个 循环。第一个循环在94℃下预变性4分钟；接着，94℃变性45秒， Tm℃退火45秒，72℃延伸1-4分钟，退火温度Tm℃与延伸时间见 表2，循环35次；最后，72℃延伸8分钟；

表2线粒体特异引物序列及其扩增条件

④多态性检测：利用凝胶电泳法将步骤③中的PCR扩增产物分别 与溴化乙锭按10∶1混合染色后，用移液枪取10μL，用1.5％琼脂糖 凝胶在TBE缓冲溶液中进行电泳，检测多态性；加5μLDL2000 Marker 在120V电压、400mA电流条件下电泳1小时后，用EB染色5分钟， 用凝胶成像仪观察结果并自动成像记录(见图1)；

⑤细胞质来源进化树的生成：对步骤④中电泳图谱上清晰且可重 复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现的带记为“0”，生成由“1” 和“0”组成的原始矩阵(见表3)，用NTSYS-pc2.1软件进行数据分析， 用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，生成胞质来源进化 树(见图2)。

表3线粒体多态性数据原始矩阵

(2)母本衍生进化图的构建：利用系谱追踪法将111份谷子育 种材料按步骤(1)中进化树中的排列顺序进行纵向排列，通过逐代 向上追踪育种材料的母本，直到追踪到农家品种为止。经过追踪，111 份材料中12份来源于同一母本材料沁源母鸡嘴、13份材料来源于同 一母本材料黄软谷、63份材料来源于同一母本材料日本60日、6份 材料来源于同一母本材料硬穗谷、5份材料来源于同一母本材料黑枝 谷，12份材料未追踪到其母本，便于研究命名为系谱丢失I型和系 谱丢失II型，依据系谱将同一母本衍生的育种材料按照衍生关系逐步 连接起来，形成了母本衍生进化图(见图3)。

(3)特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类：将步 骤(2)中构建的谷子育种材料的母本衍生进化图与步骤(1)中构建 的谷子育种材料的胞质来源进化树进行结合分析，当遗传相似系数为 0.74时能将109份育种材料中来源于同一母本衍生系统聚为一个分 枝，0.74即为对供试材料的细胞质来源进化树进行纵切的特定遗传相 似系数，在该遗传相似系数下对谷子育种材料的胞质来源进化树进行 纵切，将其纵切为7个分枝，每个分枝代表1个胞质来源的分子类群， 这样将胞质来源进化树纵切为7个类群(见图4)。该纵切结果与母 本衍生进化图一致性达98.2％。

(4)细胞质类型的确定：将步骤(3)中的分子聚类图与步骤(2) 中构建的母本衍生进化图结合，将胞质来源的7个分子类群分别与对 应的母本衍生系进行逐一对比，确定各类群材料的胞质类型，分别为 来源于“沁园母鸡嘴”的Q型，来源于“日本60日”的R型，来源于 “黄软谷”的H型，来源于“硬穗谷”的Y型，来源于“黑枝谷” 的S型，还有两种由于系谱丢失，追踪不到母本来源，分别定名为M I型和M II型(见图5)。

2、桥梁父本的创制：以谷子不育系长高146A为母本，以抗咪唑 乙烟酸谷子除草剂中间材料M200为父本配制杂交组合，即杂种1代， 在该杂种1代4叶期，按照每亩喷施40公斤咪唑乙烟酸除草剂原药∶ 水＝1∶200的咪唑乙烟酸除草剂，杀除假杂种，正常成活的植株为 真杂种，真杂种是含有不育基因和抗咪唑乙烟酸除草剂基因的正常可 育株，即为本发明的抗咪唑乙烟酸除草剂的杂种1代-桥梁父本。

3、谷子H型细胞质抗咪唑乙烟酸除草剂三交1代的创制：根据 细胞质呈母系遗传的特点，用步骤1中的H型胞质谷子育种材料大同 29为母本，与步骤2中创制的“长高146A×M200”的杂种1代为父 本进行杂交，创制H型胞质的三交1代。

4、谷子H型胞质的抗咪唑乙烟酸不育系的创制：(1)三交1代 假杂种和不抗除草剂单株的去除：种植步骤3中获得的三交1代种子， 于4叶期按照每亩喷施40公斤咪唑乙烟酸除草剂原药∶水＝1∶200 的咪唑乙烟酸除草剂，杀除假杂种和其中不抗咪唑乙烟酸的杂交后 代，存活下来的为抗咪唑乙烟酸除草剂的杂合可育株和纯合可育株， 抽穗期全部套袋自交，蜡熟期从中选择优良单株作为三交2代种子； (2)后代的选择：种植步骤(1)中获得的三交2代种子，于4叶期 按照每亩喷施40公斤咪唑乙烟酸除草剂原药∶水＝1∶200的咪唑乙 烟酸除草剂，杀除其中分离的不抗咪唑乙烟酸除草剂的不育株和可育 株，存活下来的为抗咪唑乙烟酸除草剂不育株和抗咪唑乙烟酸除草剂 的可育株两种类型，抽穗期选择其中的不育株，全部套袋，蜡熟期按 穗行从中选择优良不育单株，作为三交3代种子供下代继续选择；如 此连续经过4代的选择，获得稳定的具有H型胞质的抗咪不育系 “DZ2010N169A”。

实施例2：谷子R型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育系的培育

在实施例1步骤2中以谷子不育系长高146A为母本，以抗咪唑 乙烟酸谷子除草剂中间材料M117为父本配制杂交组合进行桥梁父本 的创制；在实施例1步骤3中用步骤1中的R型胞质谷子育种材料 济谷12为母本，与步骤2中创制的桥梁父本“长高146A×M117”的杂 种1代进行杂交，创制R型胞质的三交1代；在实施例1的步骤4(2) 后代的选择中如此连续经过5代的选择，获得稳定的具有R型胞质 的抗咪不育系“DZ20110634A”。其余步骤同实施例1。

实施例3：谷子Y型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育系的培育

在实施例1步骤2中以谷子不育系长高229A为母本，以抗咪唑 乙烟酸谷子除草剂中间材料M302为父本配制杂交组合进行桥梁父本 的创制；在实施例1步骤3中用步骤1中的Y型胞质谷子育种材料 晋谷35为母本，与步骤2中创制的桥梁父本“长高229A×M302”的杂 种1代进行杂交，创制Y型胞质的三交1代；在实施例1的步骤4(2) 后代的选择中如此连续经过5代的选择，获得稳定的具有Y型胞质 的抗咪不育系“DZ20111260A”。其余步骤同实施例1。

实施例4：谷子S型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育系的培育

在实施例1步骤2中以谷子不育系长高146A为母本，以抗咪唑 乙烟酸谷子除草剂中间材料M195为父本配制杂交组合进行桥梁父本 的创制；在实施例1步骤3中用步骤1中的S型胞质谷子育种材料复 532为母本，与步骤2中创制的桥梁父本“长高146A×M195”的杂种1 代进行杂交，创制S型胞质的三交1代；在实施例1的步骤4(2)后 代的选择中如此连续经过5代的选择，获得稳定的具有S型胞质的抗 咪不育系“DZ20112208A”。其余步骤同实施例1。

实施例5：谷子M_I型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育系的培 育

在实施例1步骤2中以谷子不育系长高229A为母本，以抗咪唑 乙烟酸谷子除草剂中间材料M195为父本配制杂交组合进行桥梁父本 的创制；在实施例1步骤3中用步骤1中的M_I型胞质谷子育种材料 冀谷21为母本，与步骤2中创制的桥梁父本“长高229A×M195”的杂 种1代进行杂交，创制M_I型胞质的三交1代；在实施例1的步骤4 (2)后代的选择中如此连续经过6代的选择，获得稳定的具有M_I型胞质的抗咪不育系“DZ20110718A”。其余步骤同实施例1。

实施例6：谷子M_II型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育系的培 育

在实施例1步骤2中以谷子不育系长高229A为母本，以抗咪唑 乙烟酸谷子除草剂中间材料M195为父本配制杂交组合进行桥梁父本 的创制；在实施例1步骤3中用步骤1中的M_II型胞质谷子育种材料 铁大粒黄为母本，与步骤2中创制的桥梁父本“长高229A×M195”的 杂种1代进行杂交，创制M_II型胞质的三交1代；在实施例1的步骤 4(2)后代的选择中如此连续经过6代的选择，获得稳定的具有M_II型胞质的抗咪不育系“DZ20111369A。其余步骤同实施例1。

实施例7：谷子Q型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育系的培育

在实施例1步骤2中以谷子不育系长高117A为母本，以抗咪唑 乙烟酸谷子除草剂中间材料M150为父本配制杂交组合进行桥梁父本 的创制；在实施例1步骤3中用步骤1中的Q型胞质谷子育种材料 长高117A为母本，与步骤2中创制的桥梁父本“长高117A×M150” 的杂种1代进行杂交，创制Q型胞质的三交1代；其余步骤与实施例 1相同，获得稳定的具有Q型胞质的抗咪不育系“KMA91”。

本发明列举的实施例旨在进一步地阐述一种不同胞质类型抗咪 唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，而不对本发明的范围构 成任何限制。