检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒

摘要

本发明提供一种检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒，该试剂盒中包括Seq ID No.1-4所示的引物组合。本发明基于15bp插入片段在牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置，设计了跨越15bp插入片段区域的2对引物，并在此基础上建立了PCR检测体系。其中，第1对引物（Seq ID No.1和2）仅能特异扩增出野生型的等位基因；第2对引物（Seq ID No.3和4）仅能特异扩增出突变型等位基因；2个PCR产物长度相差94bp，利用低浓度的琼脂糖凝胶，经过较短时间电泳即能灵敏区分不同的基因型，从而准确筛查出遗传缺陷携带者。

说明书

技术领域

本发明涉及遗传学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种检测 牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒。

背景技术

凝血是血液由液体状态转变为不流动的凝胶状态的过程，是生物 体天然的自我保护机制，能阻止血液从破损的血管中流失。除血小板 外，所有参与凝血过程的物质统称为凝血因子，目前已知的凝血因子 有20余种，包括传统的因子I-XIII，以及PK、HMWK等。当血管内皮 细胞受到创伤，组织因子等蛋白与血液接触，凝血会立即启动。首先 血小板流向创伤点堆积形成栓塞，称为初级止血反应；同时，血浆中 的各种凝血因子发生级联反应形成纤维蛋白，在血小板栓塞上形成紧 密的纤维蛋白网，该过程称为次级止血反应。血液凝固是一系列凝血 因子连锁反应的结果，其特点是当凝血过程被激活时，其中一个凝血 因子以其上游凝血因子为底物，使之激活为具有活性的酶，而该酶又 催化激活下一个因子。凝血异常将增加失血或血栓形成的风险。

牛凝血因子XI缺失（Factor XI deficiency）最早（1969年）发现 于美国荷斯坦牛中（Kociba等,1969），此后，1975年在加拿大也发现 一头患病的荷斯坦公牛（Gentry等,1975）。该遗传缺陷病的临床表现 为血凝时间延长，血浆中XI因子活性降低。杂合个体除因注射、去角、 阉割等损伤而发生出血症外（严重的需要输血），出血可能性相对较 小，而隐性纯合子出血情况较为严重，其新生犊牛大多死亡。其分子 致病机理是牛27号染色体上的凝血因子XI（Factor XI）基因第12外显 子上一个76bp的插入造成（Marron等,2004）。

2005年日本科学家报道了日本黑牛中一种新的凝血因子XI突变。 在Factor XI基因的第9外显子上有15bp的插入，造成凝血活性降低 （Kunieda等,2005）。同时，报道了一种检测该变异的方法。其基本 原理是，在该突变两侧设计引物，通过聚合酶链式反应扩增目的片段， 进而通过琼脂糖凝胶电泳方法进行基因型判定。然而，在实际应用中， 由于琼脂糖凝胶分辨率低，而该目的片段的野生型与突变型的条带只 相差15bp，因此不易区分，导致出现假阴性的结果。此外，该检测方 法所需高浓度琼脂糖凝胶的制作过程也较为繁琐，且电泳时间长。

发明内容

本发明的目的是克服现有检测方法中易出现假阴性结果的缺陷， 提供一种能够准确高效地检测牛凝血因子XI基因外显子9内15个核苷 酸插入突变的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测牛凝血因子 XI基因第9外显子内15bp插入突变的PCR引物组合，其为：

引物对1：

a）上游引物wild-F5’-CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’；

b）下游引物wild-R5’-GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3’；和

引物对2：

a′）上游引物mutant-F5’-TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3’；

b′）下游引物mutant-R5’-AATGGCATATATTCTGCACA-3’。

引物对1的上游引物跨越了插入片段区域，但不包含插入片段， 因此仅能与野生型等位基因序列特异结合，特异性地扩增野生型等位 基因；而突变型等位基因没有扩增产物。

引物对2的下游引物包含插入片段的序列，因此仅能与突变型等 位基因序列特异结合，特异性地扩增突变型等位基因；而野生型等位 基因没有扩增产物。

本发明还提供含有上述引物组合的检测牛凝血因子XI基因第9外 显子内15bp插入突变的试剂盒。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应 缓冲液中的一种或多种。

更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供上述PCR引物组合或试剂盒在检测牛凝血因 子XI基因第9外显子内15bp插入突变中的应用，包括步骤：1）提取待 测牛的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，分别采用 引物对1和引物对2，进行PCR扩增反应；3）分析PCR产物。

其中，步骤3）具体为：

扩增反应结束后，将分别用引物对1和引物对2扩增的产物混合， 进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判断待测牛的基因型：若扩 增结果仅出现一条206bp的DNA条带，则判定待测牛的基因型为不含 15bp插入突变的野生型纯合子；若扩增结果仅出现一条112bp的DNA 条带，则判定待测牛的基因型为含15bp插入突变的突变纯合子；若扩 增结果出现206bp和112bp两条DNA条带，则判定待测牛的基因型为含 15bp插入突变的杂合子。

上述PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：94℃7min；94℃30s，57℃30s，72℃30s， 共35个循环；72℃7min。

用引物对1和引物对2扩增的PCR产物长度相差94bp，利用低浓度 （2%）的琼脂糖凝胶，经过较短时间（约30min）电泳即能灵敏区分 不同的基因型。避免了已有方法的缺点，提高了检测的准确性。

本发明提供的检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变 的试剂盒，操作简便，特异性好，灵敏度高，通过对基因型的判定， 从而准确筛查出遗传缺陷携带者。

附图说明

图1为本发明野生型等位基因及突变型等位基因的测序图。

图2为本发明的引物在牛凝血因子XI基因序列上的位置。

图3为本发明实施例3中利用引物组合PCR检测凝血因子XI基因 型的结果；其中，1-6分别为6个待检样本，NC为阴性对照，PC为阳 性对照，M为DNA分子量标准。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手 册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的操 作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1用于检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变 的PCR引物组合的合成

根据15bp插入片段在牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置（图 1），人工合成以下引物：

引物对1：

a）上游引物wild-F5’-CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’；

b）下游引物wild-R5’-GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3’；和

引物对2：

a′）上游引物mutant-F5’-TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3’；

b′）下游引物mutant-R5’-AATGGCATATATTCTGCACA-3’。

上述引物组合对应于牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置如图 2所示。引物对1的上游引物（wild-F）跨越了插入片段区域，但不包 含插入片段，因此仅能与野生型等位基因序列特异结合，特异性地扩 增野生型等位基因；而突变型等位基因没有扩增产物。引物对2的下 游引物（mutant-R）包含插入片段的序列，因此仅能与突变型等位基 因序列特异结合，特异性地扩增突变型等位基因；而野生型等位基因 没有扩增产物。

引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

实施例2检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试 剂盒

检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒包 括：实施例1中的引物组合，即引物对1和引物对2。此外，还可包 括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多 种。为了便于检测结果分析，还可进一步包括已知基因型的阳性对照。

实施例3利用PCR引物组合检测牛凝血因子XI基因第9外显子内 15bp插入突变遗传缺陷的特异性分析

1.1样本来源

本实施例中采用的牛源：随机选取辽宁雪龙牧场的普通牛（Bos  taurus）六头，分别编号1~6。

1.2DNA提取

1.2.1牛血液DNA提取

采用天根生化生物技术公司DP318试剂盒从血块中提取基因组 DNA，具体步骤如下：

1)取出样品，融化后，剪取200μL于2mL离心管中；

2)加入600μL细胞裂解液CL，摇匀；

3)10000rpm离心1min，弃去暗红色上清；

4)重复2和3步一次；

5)加入200μL缓冲液GS，用涡旋仪充分悬浮血块颗粒；

6)加入20μL蛋白酶K，220μL缓冲液GB，充分晃动摇匀；

7)56℃烘箱中消化3小时以上，消化早期，要颠倒混匀数次，直 至溶液变澄清，无血块颗粒；

8)加入200μL无水乙醇，轻轻晃动混匀，转移到吸附柱中， 12000rpm离心30s,弃去收集管中的暗绿色废液；

9)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s,弃去 收集管中废液；

10)向吸附柱中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30s,弃 去废液；

11)加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s,弃去废液；

12)12000rpm离心2min；

13)将吸附柱转移到新的1.5mL离心管中，开口凉干；

14)加入100μL在64℃预热的洗脱缓冲液TB，静置2min；

15)12000rpm离心2min，弃吸附柱。基因组DNA存在于离心 管中溶液中，4℃保存备用或-20℃长期保存。

1.2.2公牛冻精DNA的提取

1）将细管冻精转移到2mL离心管中，加入500μL生理盐水， 涡旋离心，弃废液保留沉淀，重复以上操作一次；

2）向沉淀中加入400μL冻精裂解液（含DTT）、100μL20%的 SDS，涡旋，最后加入10μL的蛋白酶K，充分混匀，56℃消化4h 或过夜；

3）消化结束，加入300μL饱和食盐水，颠倒混匀，低温离心， 去除蛋白质杂质，将上清液转管保留，并加入1000μL冰乙醇，轻 轻颠倒混匀至絮状沉淀不再增加，再离心，此时弃去上清液，所得的 沉淀即DNA，用500μL75%乙醇洗涤2次，晾置几分钟使酒精挥发， 最后加适量TE缓冲液溶解，-20℃保存。

1.3样品DNA的梯度稀释

检测上述提取的牛基因组的DNA浓度，进行梯度稀释，稀释后 最低浓度为20μM，于-20℃保存备用。

1.4PCR反应

分别采用引物对1和引物对2，进行PCR扩增反应。

反应体系（20μl）：

使用Applied Biosystems9700型PCR仪，PCR反应程序：94℃预变 性7min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，共35个循环； 最后72℃延伸7min。

两对引物的PCR反应体系和扩增条件完全相同。

1.5结果

各取扩增产物2μL混合后，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳（TAE 缓冲液），电压为110V，30分钟后在凝胶成像系统中观察电泳结果。 如图3所示，根据分子量标准（Marker）判定每个样品的基因型，其 中，泳道1~6分别对应于编号1~6的牛。泳道1和2内仅观察到112bp 条带，由此判定为突变纯合子；泳道3和4内观察到112bp条带和 206bp条带，由此判定为杂合子；泳道5和6内仅观察到206bp条带， 由此判定为野生型纯合子。

本发明基于15bp插入片段在牛凝血因子XI基因第9外显子中的位 置，巧妙设计了跨越15bp插入片段区域的2对引物，并在此基础上建 立了PCR检测体系。其中，第1对引物（wild-F和wild-R）仅能特异扩 增出野生型的等位基因；第2对引物（mutant-F和mutant-R）仅能特异 扩增出突变型等位基因；2个PCR产物长度相差94bp，利用低浓度 （2%）的琼脂糖凝胶，经过较短时间（约30min）电泳即能灵敏区分 不同的基因型。避免了已有方法的缺点，提高了检测的准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。