一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法

摘要

本发明提供了一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法和一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒及其构建方法和应用。本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因folA和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因metF序列。本发明提供的提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法为，将L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒转化累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株，获得重组菌并发酵该重组菌。最终发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸累积量显著高于原始细菌株，提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，具体地说，是关于一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的 生物合成方法。

背景技术

L-5-甲基四氢叶酸又名(6S)-5-甲基四氢叶酸，化学名称为(6S)-N-[4-[[(2-氨基-1，4，5，6，7， 8-六氢-4-氧-5-甲基-6-喋啶基)甲基]氨基]苯甲酰]-L-谷氨酸。

L-5-甲基四氢叶酸是叶酸最具生物活性和功能的形式，在人生命活动中起着不可或缺的 作用。普通叶酸只有转换为L-5-甲基四氢叶酸才能参与甲基化过程及DNA合成。

L-5-甲基四氢叶酸是体内重要的甲基供体，可参与体内多种生化反应。例如，L-5-甲基四 氢叶酸是叶酸循环中的主要形式，也是同型半胱氨酸甲基化合成蛋氨酸反应的甲基供体，如 果缺乏则导致体内同型半胱氨酸含量的升高，造成高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血 症是动脉粥样硬化、血栓栓塞、血管损伤的独立致病因素，并与高血脂、脑血管疾病、肾脏 疾病、糖尿病、冠状动脉疾病、周围血管病、类风湿关节炎、自然流产及阿尔茨海默症高度 相关。

L-5-甲基四氢叶酸是人体血浆和细胞内游离叶酸存在的唯一形式，也是唯一可以穿透血 脑屏障的叶酸类药物，并对阿兹海默症有很好的防治作用。此外它还可以与抗癌药物甲酰蝶 呤等配伍使用，降低药物的毒副作用。L-5-甲基四氢叶酸也被用于巨幼红细胞性贫血、风湿 性关节炎等疾病的治疗。

叶酸也在肿瘤的发生中起着重要作用。一方面，叶酸受体正成为值得期待的肿瘤治疗靶 点，常用的载体为叶酸和叶酸类似物，叶酸类似物主要有L-5-甲基四氢叶酸、亚甲基四氢叶 酸等。叶酸与叶酸类似物在其γ羧基与效应分子结合形成叶酸偶联物的过程中，大分子物质 的生物活性不会受到破坏。另一方面，叶酸在人体中的主要功能是作为一碳单位载体参与核 酸代谢，叶酸缺乏导致肿瘤发生可能有两个机制：影响核酸甲基化和破坏DNA完整性。

美国、日本和欧洲已经批准将L-5-甲基四氢叶酸上市，作为一种食品添加剂添加到各种 食品中，使得其市场需求量剧增。目前，L-5-甲基四氢叶酸的生产主要依靠化学方法合成， 但由于其自身稳定性很差，合成工艺复杂，所以并未得到普遍工业化。在合成L-5-甲基四氢 叶酸过程中会不可避免的产生难以拆分的光学异构体D-5-甲基四氢叶酸，该异构体不能被人 体吸收利用，无治疗保健作用。虽然目前的拆分方法已有不少报道，包括微生物拆分法、化 学拆分法、高效液相色谱拆分法等，但拆分效率都不理想，收率也不高。

由于化学合成对合成工艺的要求极高，使得生产成本也较高，因此，需要寻找一种新方 法降低生产成本，并且得到光学纯度较高的L-5-甲基四氢叶酸。

微生物一般都能在常温常压下，利用简单的营养物质生长繁殖，而且代谢旺盛。目前L-5- 甲基四氢叶酸的生物合成研究较少。生物体的代谢由酶促反应组成，酶促反应具有高度特异 性，一种酶只能特异地产生唯一产物，而不会产生异构体。因此利用生物体的代谢反应，在 生物体中合成L-5-甲基四氢叶酸，可以产生唯一的代谢产物，从而解决化学方法难以达到的 对光学纯度要求高的难题，是未来发展的趋势，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠 定基础。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒，以用于转化 累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株。

本发明还有一个目的在于，提供一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒的构建 方法。

本发明还有一个目的在于，提供一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒的应用。

本发明还有一个目的在于，提供一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的方法。

本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒包括二氢叶酸还原酶基因folA 序列、亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF和一个合适的载体片段；所述folA和metF序列分别 如NCBI上Gene ID为944790和948432的序列所示。

根据本发明的一个优选实施例，在L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒中，folA 和metF编码区置于T7启动子和lac操纵子之下。

根据本发明的另一个优选实施例，所述L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒还包 括一个卡那霉素抗性基因(nptII)，用以筛选重组菌。

本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒的构建方法包括以下步骤：

A)PCR扩增获得folA和metF序列；

B)将folA和metF序列共同克隆入合适的表达载体。

本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒可用于转化累积L-5-甲基四氢 叶酸的原始细菌株。

本发明提供的提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法包括通过将本发明提供的 L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒转化累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株的步骤， 获得重组菌。

根据本发明的一个优选实施例，通过发酵培养该重组菌，提高L-5-甲基四氢叶酸累积量。

根据本发明的另一个优选实施例，该重组菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

根据本发明的另一个优选实施例，提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法还通过， 在发酵培养一定时间后，用诱导剂诱导L-5-甲基四氢叶酸代谢途径中的两个关键酶基因- folA和metF的表达。

使用本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒可以转化累积L-5-甲基四 氢叶酸的原始细菌株，获得的重组菌发酵培养，发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸累积量显著高 于累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株E.coli BL21(DE3)。说明采用本发明提供的提高L-5- 甲基四氢叶酸累积量的方法，提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，可为进一步研究 生物法合成L-5-甲基四氢叶酸建立一个基础模型，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化 奠定基础。

附图说明

图1是PCR扩增获得的folA的检测结果，其中泳道1为folA。

图2是PCR扩增获得的metF的检测结果，其中泳道1为metF。

图3是质粒pETfolAmetF的三酶切凝胶电泳检测结果，其中，5350bp左右的条带为质粒 pET-28a(+)的DNA片段，900bp左右的条带为基因metF的DNA片段，500bp左右的条带为 基因folA的DNA片段。

图4是质粒pETfolAmetF的结构示意图。

图5是含pETfolAmetF、pETfolA和pETmetF质粒的菌株的可溶性蛋白SDS-PAGE检测结果， 其中泳道1为含pETfolAmetF质粒的菌株，泳道2为含pETmetF质粒的菌株，泳道3为含 pETfolA质粒的菌株，泳道4为含pET-28a(+)质粒的空白对照菌株。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明 而非用于限定本发明的范围。

以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南 精编版》(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2006)中所述的条件或厂商提供的方案进行。

在本发明的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒 均购自生工生物公司。

在本发明的下述实施例中，使用的pMD-18T Simple Vector，Hind III，Sac I，BamH I， Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，DNA Marker，蛋白质Marker，均购自Takara公司。

在本发明的下述实施例中，使用的表达载体pET-28a(+)，菌种E.coli BL21(DE3)、E.coli  DH5α，为中国药科大学生化教研室保存，其中菌种E.coli BL21(DE3)的ATCC编号为 BAA-1025^TM。

在本发明的下述实施例中，使用的E.coli BL21(DE3)感受态细胞、E.coli DH5α感受态细 胞，购自天根生化科技有限公司。

在本发明的下述实施例中，使用的LB培养基的配方为：1％胰蛋白栋，0.5％酵母浸粉， 1％NaCl；使用的摇瓶发酵培养基的配方为：0.5％蔗糖，0.4％酵母浸粉，0.1％(NH₄)₂SO₄， 0.3％K₂HPO₄；使用的发酵罐发酵培养基的配方为：1.2％蔗糖，0.5％酵母浸粉，0.2％(NH₄)₂SO₄， 0.5％K₂HPO₄，0.01％MgSO₄，0.3％NaCl。配置固体LB平板培养基时，按照上述配方添加1％ 琼脂粉。

在本发明的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，按照Invitrogen公司Pichia  Expression Kit手册中提供的方法进行。

在本发明的下述实施例中，L-5-甲基四氢叶酸累积量的检测参照：Jelena Jastrebova，Anders  Grahn，Ulla Svensson，et al.HPLC determination of folates in raw and processed beetroots[J].Food  Chemistry，2003，80：579-588.

实施例1共表达质粒的构建

1.1引物设计

根据NCBI报道的folA和metF序列，设计以下4条引物：

folAUP：GAGCTCGGGATAATGATCAGTCTGATTGCGGC

folADOWN：AAGCTTTTACCGCCGCTCCAGAATCTCAA

metFUP：GGATCCATGAGCTTTTTTCACGCCAGCCAGCG

metFDOWN：GAGCTCTTATAAACCAGGTCGAACCCCCA

其中folAUP和folADOWN用于扩增folA编码区；metFUP和metFDOWN用于扩增metF 编码区；folAUP、folADOWN、metFUP、metFDOWN上的下划线表示在folAUP、folADOWN、 metFUP、metFDOWN上分别引入的Sac I酶切位点、Hind III酶切位点、BamH I酶切位点和 Sac I酶切位点。

1.2 PCR扩增folA和metF序列

抽提得到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组。

以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组为模板，分别以步骤1.1中设计的引物对folAUP和 folADOWN以及引物对metFUP和metFDOWN为引物对，进行PCR扩增，具体如下：

扩增folA和metF的反应体系均为：10×PCR Buffer 5μL，2mM dNTPs 2μL，25mM MgSO₄  1μL，上下游引物(10μM)各1μL，E.coli BL21(DE3)基因组DNA 5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL， 加入去离子水，至体系总体积为50μL。

扩增folA的反应条件：94℃5min；94℃1min，50℃1min，72℃5min，25个循环； 72℃10min。

扩增metF的反应条件：94℃5min；94℃1min，50℃2min，72℃5min，25个循环； 72℃10min。

PCR扩增产物分别进行凝胶电泳检测，检测结果如图1和图2所示。根据图1和图2的 结果，获得的产物的大小分别为500bp和900bp，符合folA和metF产物的预期大小。

1.3表达载体的构建

1.3.1构建预处理

使用胶回收试剂盒纯化步骤1.2中获得的PCR产物，然后和pMD-18T SimpLe载体，用 T4 DNA连接酶连接过夜，反应体系如下：

1μL的PCR产物，4μL pMD-18T SimpLe载体，5μL SoLution I。

连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布含有20μg/mL氨苄青霉素的固体LB平板，37℃培 养至转化子长出。其中E.coli DH5α是无氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有氨苄青霉素的固体 LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了pMDfolA或pMDmetF质粒的大肠杆 菌。挑取转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得两个质粒pMDfolA和pMDmetF。

质粒pMDfolA和pMDmetF经测序验证，分别包含folA、metF编码区(folA、metF编码 区序列分别如SQ ID NO.1和SQ ID NO.2所示)，而且编码区无氨基酸残基突变。

1.3.2表达载体的构建

将1.3.1中双酶切产物folA和metF凝胶回收纯化，分别与Sac I/Hind III酶切的表达载体 pET-28a(+)和BamH I/Sac I酶切的表达载体pET-28a(+)连接，将连接产物分别转化入宿主菌 E.coli DH5α，并涂布含有20μg/mL卡那霉素的固体LB平板，37℃培养至转化子长出。其中 E.coli DH5α是无氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固体LB平板上生长，因此， 平板上长出的转化子均为转化了pETfolA或pETmetF质粒的大肠杆菌。挑取转化子鉴定，根 据鉴定结果，最终获得两个质粒pETfolA和pETmetF。

质粒pETfolA和pETmetF经测序验证，分别包含folA、metF编码区(folA、metF编码 区序列分别如SQ ID NO.1和SQ ID NO.2所示)，其中folA、metF编码区分别置于T7启动子 和lac操纵子之下，而且编码区无氨基酸残基突变。

由于T7启动子是强转录和翻译信号，因此，在合适浓度的诱导剂诱导下，这两个质粒可 以分别高水平表达folA和metF。

1.4共表达质粒的构建

BamH I/Sac I酶切质粒pETmetF，获得metF表达框，然后将其连入使用BamH I/Sac I酶 切的质粒pETfolA，获得质粒pETfolAmetF。

质粒pETfolAmetF的三酶切鉴定：提取阳性克隆的质粒pETfolAmetF，并用Sac I/Hind  III/BamH I进行三酶切，酶切体系为：Sac I 5μL，BamH I 5μL，Hind III 5μL，质粒pETfolAmetF 10μL，10×K Buffer 5μL，补水至50μL。酶切时间为5min，将酶切产物凝胶电泳，结果如图3。 根据图3的结果，获得的产物的大小分别为500bp、900bp和5350bp的DNA片段，符合folA 和metF产物的预期大小。

经测序，并对测序结果进行分析获得pETfolAmetF质粒的结构示意图，结果如图4所示。 该质粒中，folA和metF编码区(folA、metF编码区序列分别如SQ ID NO.1和SQ ID NO.2 所示)串联排列在质粒pETfolAmetF的T7启动子和lac操纵子之下，而且编码区无氨基酸残 基突变。根据图4、SDS-PAGE的检测结果以及T7启动子的强转录和翻译信号，在合适浓度 的乳糖诱导下，质粒pETfolAmetF可以高水平共表达folA和metF。

实施例2表达质粒转化累积L-5-甲基四氢叶酸细菌株

将质粒pETfolAmetF、pETfolA、pETmetF和pET-28a(+)分别转化入宿主菌E.coli  BL21(DE3)，各自命名为PAF01、PA02、PF03和P04，并涂布含有20μg/mL卡那霉素的固体 LB平板，37℃培养至转化子长出。其中E.coli BL21(DE3)是无卡那霉素抗性菌株，不能在含 有卡那霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子为转化了pETfolAmetF、 pETfolA、pETmetF和pET-28a(+)质粒的大肠杆菌。

分别随机挑取PAF01、PA02、PF03和P04的转化子，摇瓶发酵培养，在适当时间添加诱 导剂，继续培养3-8h，超声破碎细胞，对可溶性蛋白进行SDS-PAGE，结果如图5。根据图5 的结果，PAF01、PA02和PF03分别高水平表达了folA和metF、folA、metF，符合folA和 metF产物的预期大小；而P04既没有大量表达folA，也没有大量表达metF。

抽提PAF01、PA02和PF03的质粒DNA，分别使用引物folAUP和folADOWN、metFUP 和metFDOWN作为引物对，进行PCR反应，分别扩增获得了长度为500bp和900bp的DNA 片段、500bp的DNA片段、900bp的DNA片段、0bp的DNA片段。经质粒测序验证，folA 和metF表达框插入了质粒pETfolAmetF，folA表达框插入了质粒pETfolA，metF表达框插入 了质粒pETmetF。

根据上述结果，质粒pETfolAmetF、pETfolA和pETmetF均成功转化入宿主菌E.coli  BL21(DE3)，分别命名为PAF01、PA02和PF03。

实施例3 PAF01、PA02、PF03和E.coli RL21(DE3)摇瓶发酵L-5-甲基四氢叶酸

将于37℃固体LB平板上生长过夜的PAF01、PA02、PF03和E.coli BL21(DE3)(原始菌， 命名为BL21)的单菌落，分别接入液体LB培养基中，摇瓶培养过夜。

分别取适量菌液转接入摇瓶发酵培养基，培养10h。其中，在适当时间加入诱导剂；适 时添加前体叶酸0.05g和甘油8％，并于发酵4h、6h、8h、10h取样，检测发酵产物中L-5-甲 基四氢叶酸的累积量，检测结果如表1所示。

根据表1的结果，PAF01、PA02、PF03和BL21中的L-5-甲基四氢叶酸的累积量，在发 酵10h时达到最高，分别达到原始菌的大约11倍、5倍、1.5倍，且菌株PAF01的累积量最 大。因此，在下一实施例中，仅选取摇瓶发酵后期累积量最高的PAF01进行发酵罐发酵。

表1 PAF01、PA02、PF03和BL21中L-5-甲基四氢叶酸的累积量随培养时间的变化

实施例4 PAF01发酵罐发酵L-5-甲基四氢叶酸

将于固体LB(含有20μg/mL卡那霉素)平板上长出的PAF01单菌落，接种至发酵罐发 酵培养基，摇瓶培养过夜；取1mL接种至100mL发酵罐发酵培养基，摇瓶培养2h左右；然 后接入1L的发酵罐发酵培养基中(2.5L发酵罐)，并添加消泡剂聚氧丙稀聚氧乙烯甘油醚(即 泡敌GPE)，发酵罐发酵培养，发酵过程中适时添加适当浓度的诱导剂，并流加满足细胞生长 需要的甘油，同时，通过流加氨水，控制pH为6.4；发酵过程中添加前体物质叶酸。发酵10h 停止发酵。

采用上述方法，进行平行实验，并分别取样检测发酵产物中的L-5-甲基四氢叶酸累积量， 检测结果显示，在上述平行实验中，发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸的累积量达到0.4-1.1mg/L， 均高于目前报道的关于L-5-甲基四氢叶酸累积的27.5μg/L的最高水平。

综上所述，使用本发明提供的共表达质粒可以转化累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株， 获得的重组菌发酵培养，发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸累积量显著高于累积L-5-甲基四氢叶 酸的原始细菌株E.coli BL21(DE3)。这说明采用本发明提供的生物合成方法，提高了原料利用 率，降低了生产成本和能耗，可为进一步研究生物法合成L-5-甲基四氢叶酸建立一个基础模 型，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠定了基础。

虽然，在本发明的实施例中，转化pETfolA和pETmetF质粒的累积L-5-甲基四氢叶酸原 始细菌株中L-5-甲基四氢叶酸的累积量，低于转化pETfolAmetF质粒的累积L-5-甲基四氢叶 酸原始细菌株，但是通过将质粒pETfolA和pETmetF转化累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株， 获得重组菌，发酵该重组菌，并在一定时间加诱导剂乳糖，提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的 方法，同样应当属于本发明的范围。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于 以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出 或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

中国药科大学

中国药科大学生命科学与技术学院生物化学教研室

一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法

2

1

480

DNA

大肠杆菌

1

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ccgtggaacc tgcctgccga tctcgcctgg tttaaacgca acaccttaaa taaacccgtg    120

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891

DNA

大肠杆菌

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