栖热菌TC16的单链DNA结合蛋白和编码此蛋白的多核苷酸

摘要

本发明公开了一种栖热菌TC16的单链DNA结合蛋白和编码此蛋白的多核苷酸，该蛋白来源于栖热菌

说明书

技术领域

 本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于栖热菌TC16的单链DNA结合蛋白及编码此蛋白的多核苷酸。 

背景技术

单链DNA结合蛋白（single-strand DNA blinding protein，SSB），即结合在单链DNA上的一类蛋白，它参与所有生物中的大部分的细胞途径。SSB（单链DNA结合蛋白）在DNA进行复制、转录及修复等生理过程中起着重要的角色，主要表现在于dsDNA（双链DNA）解旋时结合在ssDNA（单链DNA）上，保障ssDNA的稳定，以防ssDNA重新配对成双链或被核酸酶降解，从中对ssDNA起到相应的保护作用。除了对ssDNA二级结构的作用之外，SSB还促进同源的核苷酸链进行配对，另外，它们还被认识为可以修复和调整一些DNA生理代谢的关键蛋白。

SSB首先是在T4噬菌体上被证明的，随后在细菌、古菌、真核生物及病毒中也普遍发现。在氨基酸水平上，SSB的进化上是表现为在不同有机体中较大地缺乏同源性，但有一个被视为典型的决定性因素——保守结构区域。这保守区域称为寡核苷酸/寡糖结合位点折叠区（OB-fold），其涉及到核苷酸的结合点。

除了OB-fold之外，SSB还被认为是通过多聚体构型来构成功能蛋白形式。在真核生物中，最具有特征的SSB蛋白是人类的复制型蛋白A（RPA），其是通过三个紧密的亚基形成并总共提供6个OB-fold，其中4个参与和DNA的结合。在原核生物分支的真细菌SSB基本都是被具有高同源性的单基因编码翻译，如E.coli的SSB(SSBEC)，在代谢过程中，它们功能形式基本是以同源四聚体为主要构型，在这种构型下，每个单体提供1个OB-fold。在古细菌Crenarcheota中，报道了仅有一种类型的SSB，并仅含有一个OB-fold。与之相反，真核及可培养的古菌类的SSB是具有更多样性的SSB，其具有一个或者几个OB-fold。在栖热菌中，SSB也是以多种构型结合在ssDNA上，每个单体基本拥有2个OB-fold，并且它们功能构型的种类是随着核苷酸链的长度大小而发生变化。这表明在栖热菌中，它们的SSB相比其它种类还具有更为多样性的功能构型。

等温PCR是一种DNA扩增技术，可以实现热变性、杂交退火后，在恒定温度下进行PCR。由于内切核酸酶V可以实现引物-模板复合物的循环再生，引发DNA合成反应，而单链DNA结合蛋白与解螺旋酶可提高等温PCR效率，实现对目标核酸的大规模扩增，SSB对ssDNA是起到了保护作用及促进dsDNA的解链作用， 其是等温PCR体系中的重要组分。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种栖热菌TC16单链DNA结合蛋白，其具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供一种编码栖热菌Thermus TC16单链DNA结合蛋白的多核苷酸，其具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，或其具有与SEQ ID NO.2互补的核苷酸序列。

本发明同时提供含有编码单链DNA结合蛋白的多核苷酸的重组载体及表达方法。

本发明的有益效果如下：

本发明获得的单链DNA结合蛋白，可以在常温和高温下（20-80℃）和单链DNA结合，能应用于恒温PCR作为扩增DNA反应体系的添加物，保护ssDNA的完整性，促进解旋酶的解旋效率，以达到提高扩增效率的结果。

附图说明

   图1是本发明栖热菌TC16的单链DNA结合蛋白基因的PCR扩增产物电泳示意图，其中：

M是Marker；1是TC16-SSB基因PCR产物；

图2是本发明单链结合蛋白TC16-SSB的保守区域分析示意图；

图3是本发明单链结合蛋白TC16-SSB在含重组质粒的E.coli BL21中的表达及纯化；其中：泳道1是纯化的单链结合蛋白TC16-SSB，泳道M是蛋白质分子量marker；

图4是本发明不同浓度ssDNA与TC16-SSB结合的效果电泳示意图，其中1是10pmol ssDNA（35base）；2是10pmol ssDNA+10μg TC16-SSB；3是20pmol ssDNA ；4是20pmol ssDNA+10μg TC16-SSB；

   图5本发明不同浓度的TC16-SSB对ssDNA吸附效果电泳示意图，其中1是2ul ssDNA（39 base）；2是2ul ssDNA+1ul TC16-SSB；3是2ul ssDNA+2ul TC16-SSB；4是2ul ssDNA+3ul 

TC16-SSB；5是2ul ssDNA+4ul TC16-SSB。

 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例1：单链DNA结合蛋白SSB的克隆和表达

一、栖热菌TC16 SSB基因的扩增（以嗜热菌TC16 DNA为模板）

（1）栖热菌TC16 SSB基因扩增所用引物序列如下：

正向引物：5'-CCATGGCTCGAGGCCTGA ACCGCGTTTTCC -3'

反向引物：5'-AAGCTT AAACGGCAACTCCTCCTCC-3'

（2）扩增体系如下（见表1）：

表1：扩增反应体系组分

模板10 ngPremix exTaq25 μl引物各1 μl双蒸水ddH2O补充至50μl

（3）扩增条件如下：

将反应体系混匀，先在94℃预变性4min，然后在94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后， 72℃延伸10min。反应完后取产物5 μl，在10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳分析（见图1），结合蛋白TC16-SSB基因的大小为810 bp，测序验证成功扩增了单链DNA结合蛋白TC16-SSB基因。

二、PCR产物的胶回收纯化  

（1）在电泳仪中灌制1.0％琼脂糖凝胶；

（2）将待分离纯化的PCR产物点样电泳，于适当位置停止电泳；

（3）在紫外灯下切下含该目的片断的凝胶，转移到1.5ml的Ep管中；

（4）用天根生物公司胶回收试剂盒进行目的片段的回收，回收方法按说明书操作进行。

将基因序列提交NCBI数据库Conserved Domain Database蛋白质保守序列分析软件进行分析，单链结合蛋白TC16-SSB基因分析结果见图2，图中可见TC16-SSB基因具有两个单链DNA结合保守结构域，证明所得序列为SSB基因序列。

三、重组表达载体的构建

为了把目的基因片断连接到表达载体pET28a，就需要使目的片断带有粘性末端的片断，即带有酶切位点。但经PCR扩增得到的目的基因上只带有polyA，而pMD18-T载体上带有polyT，因此，可以先将目的片断连接到pMD18-T 载体上，再进行相应的酶切，最终得到带有粘性末端的目的片段，为下一步表达载体构建实验做准备。具体实验步骤如下：

（1）将嗜热菌TC16-SSB基因片段连接到pMD18-T 载体上，得到重组质粒；

 连接反应体系如表2：

表2：反应体系组分

PCR胶回收产物7.5 μl10×T4 DNA 连接酶缓冲液1 μlpMD18-T线性载体0.5 μlT4 DNA 连接酶1μl总量10 μl

 条件：16℃，连接过夜。

（2）重组质粒的回收

① 取连接产物10μl，加入40μl ddH2O；

② 转移到1.5ml的effpendorf管里；

③ 加5μl 醋酸钠 (pH 5.2)；

④ 加2.5倍以上体积的无水乙醇；

⑤ 在-80℃下放置15min；

⑥ 4℃离心5min，13000rpm，弃上清；

⑦ 70%的乙醇洗两次，100%的乙醇洗一次；

⑧ 自然晾干后，加10μl ddH2O溶解。

（3）重组质粒的转化。

在100μL感受态细胞（E.coli BL21）里，加入10μL连接产物，冰浴30min，然后42℃加热1~2min，再冰浴2min，之后加入400μL LB液体培养基，于37℃，150rpm摇床培养1h；然后涂布含有卡那霉素(Kan+)的LB固体平板，于37℃倒置培养12h。

（4）通过菌落PCR检测含重组质粒的菌株，筛选出阳性菌落

 观察转化平板，随机挑选几个菌落，用10μl枪头挑起，溶解在20μl ddH2O中，混匀后，转移10μl菌液到LB液体培养基中，剩余10μl菌液用于热裂解，裂解温度98℃，时间10min；

② 裂解后用掌上离心机轻甩，裂解液用作菌落PCR模板；

③ 菌落PCR扩增反应体系如表3： 

表3：反应体系组分

模板2  μlPremix rTaq12.5 μl引物（正、反向引物）各1μlddH2O补充至 25μl

 菌落PCR反应条件如下：

将反应体系混匀后，在94℃预变性4min；然后在94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环； 72℃延伸10min。反应完成后取产物5 μl，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

 鉴定出阳性菌落。

（5）阳性克隆增菌

①取卡那霉素5μl(终浓度50μg/ml)加入5ml LB培养基中；

②用接种环挑取阳性克隆，接种于Kan+-LB培养基中；

③然后放入37℃培养箱中，摇床培养，过夜。

（6）重组质粒抽提 （采用质粒抽提试剂盒提供的方法）

①收集菌体：把步骤（5）中培养的菌液加入到5ml的离心管中，离心收集菌体沉淀，弃上清液；

②加溶液Ⅰ（含RNA酶）100μl，振荡至菌体彻底分散均匀，转入1.5ml的EP管中；

③加入溶液Ⅱ 150μl，混匀，室温放置5min，使溶液Ⅰ的RNA酶消化细菌中RNA；

加入溶液Ⅲ 150μl，4℃离心，13000rpm，10min；

⑤将上清液转入DNA吸附柱中，再加入420μl结合缓冲液，混匀，室温离心，5000rpm，1 min，回收两次，弃下清液；

⑥加入750 μl漂洗液于吸附柱中，室温离心，5000rpm，1min，弃下清滤液（重复一次）；

⑦室温13000rpm，2min再离心一次；

⑧将吸附柱移入新的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入70μl ddH2O，放置1min，然后室温离心，13000rpm， 2min；

⑨将所得到的质粒取1 μl电泳分析。

（6）重组质粒的酶切鉴定

酶切体系如表4：

表4：反应体系组分

质粒5 μl(约200ng)10×H 缓冲液1 μlNco I0.3 μlHand Ⅲ0.3 μl双蒸水3.4 μl总量10 μl

酶切条件：37 ℃，过夜，回收SSB基因片段。

（7） 带有粘性末端线性载体pET28a的制备

为了将目的基因片断连接到表达载体pET28a上，就需要使目的片断带有粘性末端的片断，即带有酶切位点。同样，为了使目的片断能插入载体中，也需要使载体带有粘性末端，并且使它们的酶切位点相同。

A、质粒抽提：用质粒提取试剂盒（博亚），操作步骤如下：

菌种活化：无菌接种环蘸取-80℃冻存的菌种保存液，三线法接种于氨苄LB平板，37℃培养12-16小时；

②增菌并收集菌体：增菌方法同步骤5，并将培养的菌液加入到5 ml的离心管中，室温离心5 min，5000 rpm，使菌体沉淀，弃上清液；

③在离心管中加溶液S1（含RNA酶） 250 μl，振荡至菌体彻底悬浮，转入1.5ml的EP管中；

④在EP管加入溶液S2 250 μl，轻轻颠倒几次，室温放置5 min，使溶液Ⅰ的RNA酶把其中的RNA降解后，加溶液S3 400 μl, 室温离心，13000 rpm，10 min；

⑤将离心后所得的上清液转入DNA吸附柱中，室温离心，5000 rpm，1 min，回收两次，弃下清；

⑥在吸附柱中加入500 μl漂洗液(W1溶液)，室温离心，5000 rpm，1 min；

⑦然后加750 μl漂洗液(W2溶液)，室温离心，5000rpm，1min，弃下清（重复一次）；再室温离心一次，13000 rpm，2 min；

⑧将吸附柱移入新的1.5 ml的离心管中，在吸附膜中央加入70 μl ddH2O水，放置1 min，然后室温离心，13000 rpm， 2 min，弃上清，得到质粒。

⑨将所得的质粒取1μl进行电泳检测，并定量。

B、质粒pET28a酶切鉴定

酶切体系如表5：

表5：反应体系组分

质粒5 μl(约200ng)10×H 缓冲液1 μlNco I0.3 μlHand Ⅲ0.3 μl双蒸水3.4 μl总量10 μl

②反应条件：37℃，过夜。

（8）重组表达载体的构建、栖热菌TC16-SSB蛋白的诱导表达和纯化

①将前面实验得到的带有粘性末端的线性载体pET28a和栖热菌TC16-SSB基因片段，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体。

②栖热菌TC16-SSB蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

将构建好的重组载体TC16-SSB/pET28a转化大肠杆菌BL21，含重组质粒的菌株经培养过夜，菌液按1%比例接种到30 ml Kan+-LB(卡那霉素终浓度50μg/ml)培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为1.0；取出1ml菌液用作对照实验；其余菌液放入37℃，60 rpm摇床培养诱导表达6小时。

③栖热菌TC16-SSB蛋白 SDS-PAGE检测

取出少量诱导后菌液测OD值，根据菌液OD值不同取不同的菌液量，使其菌体量相等，5000rpm，离心5min，弃上清；加入80 μl 双蒸水，20 μl 2×上样缓冲液，振荡使菌体散开后；在98℃下放置15min，使菌体裂解，释放蛋白质；取诱导表达后的菌液，制备样品；将样品上样于电泳仪中在100V，60mA，电泳2h后，加入100ml R250考马斯亮蓝染色液染色，摇床振荡，100 rpm，20min后；将染色液倒出，用清水漂洗，再加入适量脱色液100 rpm，10h，最后用扫描仪扫描凝胶，检测蛋白表达情况。

④重组单链结合蛋白的纯化

利用上述方法大量诱导含重组质粒TC16-SSB/pET28a的BL21菌株，菌液经离心收集大肠杆菌菌体(4oC，5,000x g，10 min)。菌体悬浮于适量（使菌悬液的OD600达到20）缓冲液A[20 mM磷酸钠，500 mM NaCl ，30 mM 咪唑，pH 7.4] 中，冰上超声破碎细胞，4℃，20,000x g离心10 min，上清上样于已用缓冲液A平衡好的HisTrap HP柱（1 ml, GE Healthcare）中，再用缓冲液A冲洗未结合的蛋白直至UV值恒定；结合的蛋白用20 ml 含有咪唑梯度（0-500 mM）的缓冲液B[20 mM 磷酸钠， 500 mM NaCl , 30 mM 咪唑，pH 7.4]洗脱，分段收集洗脱液，带组氨酸标签的重组蛋白洗脱峰在475 mM，合并洗脱峰组分，最后用缓冲液[50 mM Tris-HCl, 25 mM Mg2+，pH7.4] 透析过夜，纯化的重组蛋白组分进行SDS-PAGE分析。

通过SDS-PAGE显示，重组单链DNA结合蛋白TC16-SSB基因成功在大肠杆菌BL21上清中表达成功，破碎后的上清通过His-NI+纯化，其结果如下图3的泳道1，分子量大小为32KD，与理论大小相符，说明TC16-SSB获得了正确的克隆和表达。

 

实施例2： 重组单链DNA结合蛋白TC16-SSB的与单链DNA的结合功能

单链DNA结合蛋白与单链DNA的关系采用琼脂凝胶阻滞法验证。当单链DNA结合蛋白和单链DNA结合，则带有蛋白的DNA由于不能通过凝胶孔径而被阻拦在最初上样孔中，而没有被单链DNA结合蛋白结合的DNA可以正常地在凝胶中穿梭，通过观测DNA浓度的变化，可以确定蛋白和DNA之间的关系。

本方法中采用的是0.7%的凝胶，组分为： 0.7g琼脂糖，100mL H2O，6μL EB。

设置室温温育的反应物体系：1是10pmol ssDNA（35base）；2是10pmol ssDNA+10μg TC16-SSB；3是20pmol ssDNA ；4是20pmol ssDNA+10μg TC16-SSB；后电泳15min，于凝胶成像系统观看结果，见图4。结果显示，当ssDNA中加入TC16-SSB后，导致电泳检测到的ssDNA含量下降，说明TC16-SSB和ssDNA结合了。

设置室温温育的反应物体系：1是2ul ssDNA（39 base）；2是2ul ssDNA+1ul TC16-SSB；3是2ul ssDNA+2ul TC16-SSB；4是2ul ssDNA+3ul TC16-SSB；5是2ul ssDNA+4ul TC16-SSB；后电泳15min，于凝胶成像系统观看结果，见图5。图5结果表明在一定量的ssDNA内随着TC16-SSB量的增加，条带的亮度逐渐减弱，说明了随着TC16-SSB的增加，剩余的ssDNA不断地与TC16-SSB结合成为不能通过凝胶的复合体。因此从两图谱上看，ssDNA条带亮度的变化，即说明TC16-SSB是有相应的结合功能活性。

序列表

<110>  昆明理工大学

 

<120>  栖热菌TC16的单链DNA结合蛋白和编码此蛋白的多核苷酸

<160>  2    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  270

<212>  PRT

<213>  Thermus TC16

<400>  1

 

Met Ala Arg Gly Leu Asn Arg Val Phe Leu Ile Gly Thr Leu Thr Ala Arg Pro Asp Met

1                                   10                                      20

Arg Tyr Thr Pro Gly Gly Met Ala Ile Leu Asp Leu Ser Leu Ala Gly Gln Asp Thr Leu

21                                  30                                      40

Leu Asp Ala Ser Gly Gln Glu Arg Glu Val Ala Trp Tyr His Arg Val Arg Leu Leu Gly

41                                  50                                      60

Arg Gln Ala Glu Met Trp Gly Asp Ile Leu Glu Arg Gly Gln Leu Val Phe Val Glu Gly

61                                  70                                      80

Arg Leu Glu Tyr Arg Gln Trp Glu Arg Glu Gly Glu Arg Arg Ser Glu Ile Gln Ile Arg

81                                  90                                      100

Ala Asp Phe Ile Asp Pro Leu Glu Gly Arg Gly Arg Glu Thr Leu Glu Asp Ala Arg Gly

101                                 110                                     120

Gln Pro Arg Leu Arg His Ala Leu Asn Gln Val Ile Leu Met Gly Asn Leu Thr Arg Asp

121                                 130                                     140

Pro Asp Leu Arg Tyr Thr Pro Gln Gly Thr Ala Val Val Arg Leu Gly Leu Ala Val Asn

141                                 150                                     160

Glu Arg Arg Pro Gly Gln Gly Pro Asp Gly Glu Lys Thr His Phe Val Glu Val Gln Ala

161                                 170                                     180

Trp Arg Asp Leu Ala Glu Trp Ala Ser Glu Leu Arg Arg Gly Glu Gly Leu Leu Val Ile

181                                 190                                     200

Gly Arg Leu Val Asn Asp Ser Trp Thr Ser Ser Thr Gly Glu Arg Arg Phe Iln Thr Arg

201                                 210                                     220

Val Glu Ala Leu Arg Leu Glu Arg Pro Thr Arg Gly Pro Glu Arg Thr Gly Gly Ser Pro

221                                 230                                     240

Arg Gln Glu Pro Gly Arg Ser Val Gln Thr Gly Gly Val Asp Ile Asp Glu Gly Leu Asp

241                                 250                                     260

Glu Phe Pro Pro Glu Glu Glu Leu Pro Phe

261                                 270

 

 

 

<210>  2

<211>  810

<212>  DNA

<213>  Thermus TC16

<400>  2

atggctcgag gcctgaaccg cgttttcctc atcggtaccc ttaccgcccg 50

cccggacatg cgctataccc cgggggggat ggccattctg gacctgagcc 100

tggcgggcca ggataccctt ctggatgcct ccggccagga gcgggaggtg 150

gcctggtacc accgggtccg cctgttgggc cggcaggcgg agatgtgggg 200

ggatattctg gaaaggggcc agctggtctt tgtggagggc cggctggagt 250

accggcagtg ggagcgggaa ggggagaggc ggagcgagat ccagatccgg 300

gcggacttca tcgacccctt ggaggggcgg ggccgcgaga ccctggagga 350

cgcccggggc cagcccaggc tccgccacgc cctcaaccag gtgatcctca 400

tgggcaacct cacccgcgat cccgatctgc gctacacccc ccaggggacg 450

gcggtggtca ggctgggcct ggcggtgaac gagcgccgcc cgggccaggg 500

gccggatggg gagaagaccc acttcgtgga ggttcaggcc tggcgcgacc 550

tggccgagtg ggcctccgag cttaggcggg gtgaggggct tttggtgatc 600

ggccgtttgg tgaacgactc ctggacgagc tccaccgggg agaggcgctt 650

ccagacccgt gtggaagccc tcaggttgga gcgacccacc cgtgggcctg 700

aaaggaccgg cggaagcagg ccccaagagc cagggcgctc tgtccagacg 750

ggtggggtgg acatcgacga aggactggaa gacttcccgc cggaggagga 800

gttgccgttt                                             810