一种牡蛎近缘物种鉴定的方法

摘要

本发明涉及近缘种鉴定技术，具体的说是一种牡蛎近缘物种鉴定的方法。具体为以牡蛎基因组DNA为模板，根据牡蛎物种基因组的标签序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线(HRM)中的Tm值差异进而区分牡蛎物种。采用本发明能够快速、经济、简便的进行物种之间的鉴定，与标签序列测序结果相比较准确率为100％。

说明书

技术领域

本发明涉及近缘种鉴定技术，具体的说是一种牡蛎近缘物种鉴定的方 法。

背景技术

牡蛎属软体动物门中的瓣鳃纲(或双壳纲)。牡蛎具有很高的经济价值， 是世界各国重要的水产养殖对象，已成为中国乃至世界水产养殖产量最大 的经济动物。尤其是牡蛎全基因组测序的完成，标志着牡蛎进入了基因组 时代，牡蛎的分子生物学研究，功能基因学研究，组学研究等相关基础研 究和应用性研究相继展开。物种的区分和鉴定是各种研究工作的基础，然 而牡蛎物种种类十分复杂，外形极易受到环境的影响；关于其分类也存在 诸多的争议和分歧，分类依据也不尽相同。近年来，随着分子生物学的发 展，利用分子生物学手段来鉴定物种已经逐渐成为一种趋势，并为大多数 的生物学家所接受。目前最常见的是应用线粒体COI基因及ITS序列差异 作为区分不同物种的分类依据，但是这些基因序列之间的区别往往是SNP 或者是In/de l，不同物种之间序列长度的变化并不明显，因此难以应用电 泳等方法区别不同物种；测序可以取得这个基因或者序列的详细碱基信息， 但是测序实验过程比较繁琐，花费也较高，并且需要大型仪器的支持，很 难在短时间内实现准确、快速、简单的物种鉴定。

发明内容

本发明目的在于提供一种牡蛎近缘物种鉴定的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种牡蛎近缘物种鉴定的方法，以牡蛎基因组DNA为模板，根据牡蛎 各物种基因组的标签序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨 率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)中的Tm值差异进而区分牡 蛎物种。

通过上述扩增获得40bp-100bp的PCR产物，添加核酸饱和染料后95 ℃变性处理10分钟，冷却至室温进行HRM测定。

以待鉴定牡蛎基因组DNA为模板，根据牡蛎的COI基因序列设计引物 进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线(HRM)中的Tm值差异 进而区分贝类相近物种；序列扩增引物为：

COI-F1：TACTTAATATTGGGTTTTTAGGGT；

COI-R1：CGCGTATCAATATCCATTCC。

本发明所具有的优点：

1.方法简单易行；不需要测序，直接通过扩增片段的Tm值来反应DNA 水平上的区别而区分不同物种。

2.结果明确直观；不用进行序列比对等步骤，不同物种之间DNA水平 的差异以直观的峰图形式表现出来，极易区分辨别。

3.准确有效；本发明鉴定方法采用高分辨率熔解曲线(HRM)具有分辨 单个核苷酸差异的能力，能够准确反映DNA水平上的差异，使得鉴定结果 准确可靠，与测序结果相比较准确率为100％。

4.应用性广泛；与测序不同，不需要将待鉴定的所有个体一一测序分 析。本发明中一组引物可以在无限多同类个体上进行物种鉴定而不需要重 新设计引物。其次，本发明为一个开放体系，应用范围广泛；不仅可用于 特定几种牡蛎近缘物种的鉴定，只要是基于DNA水平上的差异能够区分的 牡蛎物种均可以利用该方法来鉴定。

附图说明

图1为本发明实施例提供的巨蛎属牡蛎近缘物种鉴定高分辨率熔解曲 线图(其中横坐标为温度(℃)，纵坐标为荧光强度的对数值；每条曲线的 最高点所对应的横坐标即为该曲线对应的PCR产物的Tm值)。

图2为本发明实施例提供的巨蛎属牡蛎近缘物种PCR扩增产物1％琼脂 糖凝胶电泳检测图。

具体实施方式

本发明在依靠核酸序列区别而进行物种鉴定的过程中引入高分辨率熔 解曲线方法，仅用一对PCR引物将不同物种在DNA水平上的差异转化成更 直观的熔解曲线。其步骤为：

a.物种鉴定依据序列的获得：从已有数据库或其它来源获得能够区分 目标物种的依据序列(如COI基因序列等生物标签序列)。

b.引物设计：比对不同物种之间依据序列的差异，寻找能够明显区分 目标物种的区域，利用primer premier5软件在该区域内设计PCR扩增引 物，使扩增产物在不同物种间应有明显序列差异(即Tm值不同)，主要体 现为G、C含量不同。

c.PCR扩增：以待鉴定目标贝类的基因组DNA为模板，利用上述引物进 行PCR扩增。

d.产物检测及处理：利用1％琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物， 确定扩增产物单一，无非特异性扩增后，每个反应添加1μl核酸饱和染料 LC-green(Idaho，美国)，在普通PCR仪上运行95℃变性10min后冷却至 室温。

e.高分辨率熔解曲线(HRM)分析：上述产物在Lightscanner96(Idaho， 美国)平台上运行HRM，结束后利用平台上的分析软件获得产物熔解曲线， 通过产物的熔接曲线来区分不同物种。

PCR扩增引物退火温度在50℃-60℃之间，PCR产物长度控制在 40bp-100bp之间。PCR扩增引物内尽量避免包含SNP位点和In/del，PCR 产物序列在待鉴定的不同目标物种之间有明显的Tm值差异。PCR扩增程序 为：95℃(预变性10min)，95℃(变性30sec)，Tm(复性30sec)，72℃(延 伸30sec)变性、复性、延伸三步共循环55次后72℃后延伸10min，16℃ (降温)结束。用于物种鉴定的依据序列可以根据需要自由选择针对不同 物种最优的参照序列，可以是COI基因序列或其他符合生物标签特征的序 列。

实施例1

巨蛎属中的牡蛎近缘物种的鉴定：

巨蛎属中的牡蛎物种比较多，并且牡蛎外形受到环境的影响很大，很 难以通过表型来正确区分不同物种。在物种分类和鉴定上，曾经一度存在 诸多的争议。如今，逐渐趋向于采用线粒体COI基因序列等生物标签序列 在不同物种间的差异来鉴定不同的物种。

a.物种鉴定依据序列的获得：以我国境内比较常见的巨蛎属内不同近缘 牡蛎物种的COI基因序列，作为物种鉴定依据序列。

b.引物设计：在上述蛎物COI基因中选择能够明显区分目标物种的序 列区域，利用Primer Premier 5软件在该区域内设计PCR扩增引物，引物 扩增产物在不同物种间应有明显Tm值差异，主要体现为G、C含量不同。

引物序列为：COI-F1：TACTTAATATTGGGTTTTTAGGGT；

            COI-R1：CGCGTATCAATATCCATTCC。

c.PCR扩增：以待鉴定牡蛎样本的基因组DNA为模板，利用上述引物进 行PCR扩增。

PCR扩增程序依照：95℃(预变性10min)，95℃(变性30sec)，Tm(复 性30sec)，72℃(延伸30sec)变性、复性、延伸三步共循环55次后72 ℃后延伸10min，16℃(降温)结束。

d.产物检测及处理：将上述PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测 (图2)确定扩增产物单一后，每个反应添加1μl LC-green，在普通PCR 仪上运行95℃变性10min后冷却至室温。

e.高分辨率熔解曲线(HRM)分析：上述产物在Lightscanner96平台上 运行HRM，收集55℃-95℃之间的荧光信号数据。结束后利用平台上自带的 分析软件将荧光信号转化成熔解曲线峰图；根据不同曲线的峰值对应的Tm 值的差异来区分不同的巨蛎属近缘物种(参见图1)。

本实施例利用我国四个滨海地区(福建厦门，江苏南通，青岛田横，青 岛胶南)潮间带采集的5种巨蛎属牡蛎作为物种鉴定材料。以COI基因为 生物标签特征的序列，其是由于这些牡蛎样品已经经过传统的形态学、动 物地理学以及COI基因测序比对的方法进行过物种鉴定，物种信息已经明 确。

由图1可见：熔解曲线分别聚成5束，分别呈现5种不同的Tm值，对 应样品中5种不同物种的巨蛎属牡蛎。类型A为Crassostrea  hongkongensis；类型B为Crassostrea ariakensis；类型C为Crassostrea  angulata；类型D为Crassostrea sikamea；类型E为Crassostrea gigas。 上述区分结果与测序序列比对结果相对比完全一致，正确率为100％。