结核分枝杆菌rpoB基因的核酸指纹特征图谱库及其用途

摘要

本发明公开了一种检测结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（RRDR）突变型方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录、限制性内切酶酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。基于该方法，可建立结核分枝杆菌野生型及突变型RRDR的特征酶切质谱峰图数据库。根据实验产生的质谱峰图，与数据库进行比对，以检测结核分枝杆菌rpoB基因RRDR是否突变及突变型，从而判断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。检测结果可广泛运用于临床检验、疾病预防、流行病调查、进出口检验等领域。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种结核分枝杆菌rpoB基因RRDR的核酸指纹图谱制备的方法，以及使用该方法，对待检结核分枝杆菌rpoB基因RRDR的突变型进行检测的方法。 

背景技术

近年来，结核病耐药疫情日趋严重，有关调查表明，超过50个国家存在广泛耐多药结核病患者，中国在全球27个耐多药结核高负担国家中排行第二，仅次于印度。早期耐药性诊断技术的突破是当前控制结核病的关键，因此，建立快速、灵敏的结核病耐药性检测技术迫在眉睫。细菌学的耐药性检测方法仍然是结核病耐药性检测的金标准，但受制于结核分枝杆菌生长缓慢的特性，目前所有的结核病细菌学耐药性检测方法都达不到快速的目的。以耐药基因检测为主的各种分子药敏检测技术具有快速、准确、通量高等优势，越来越成为研究的热点。利福平RFP是一种广谱抗菌药，可作用于结核分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶亚基β亚单位(RNA polymerase B subunit，rpoB)，从而抑制mRNA的转录。结核分枝杆菌对利福平耐药是结核病化疗失败的主要原因，并且利福平耐药性的检测是判断多重耐药结核病(MDR-TB)的标志。 

rpoB基因是一单拷贝基因，序列高度保守，全长3543个碱基。研究证实，当高度保守核心区域（RRDR）发生突变时，利福平不能与RNA聚合酶β亚单位结合，抑制转录。95%左右的RFP耐药菌株的基因突变都集中在507～533位的27个氨基酸(81bp)组成的区域，其中，以531位Ser→Leu和Trp转换，526位His→Tyr、Asp、Asn和Pro的突变最为常见，且以上两个位点的突变是引起高水平耐药的主要原因。除上述两位点外，511、516、518、522位点也有突变，相对531和526较少，且是引起低水平耐药的原因。 

已有一些公开文献对结核杆菌的利福平耐药位点决定区（RRDR）进行鉴定，例如，中国专利申请201110271351、“多重PCR-反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐药性的方法”，公开了一种基于多重PCR的反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐药性的方法，包括了引物的设计、探针的设计、杂交试验、结果判定，能够同时检测结核分枝杆菌对RIF、INH和EMB的耐药相关的rpoB，katG，inhA基因调节区和embB基因突变热点区的碱基突变。然而，该方法需要设计多重引物，并克服多重PCR中引物相互干扰的缺陷，同时多重PCR过程繁琐，且反向斑点杂交技术需要昂贵的免疫生化试剂和大量时间，因此难以实现快速、准确的检测目的。 

中国专利申请200910114023、“检测结核杆菌耐药基因膜芯片”公开了一种检测结核杆菌耐药基因膜芯片，是针对结核杆菌rpoB、kagG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突变位点设计探针并杂交在尼龙膜上进行检测。然而，该方法需要设计多达54种探针，且检测过程中探针点样和膜芯片均需要准确定量和灵敏的洗脱结合等操作，因此也难以实现上述目的。 

陈双红等（结核杆菌实验诊断的研究进展，《海军医学杂志》第2002年第23卷第2期）综合报道了利用细菌性检测、免疫学检测、PCR诊断、DNA指纹技术、基因芯片检测技术以及质谱分析来分型结核杆菌。其中报道了各种检测方法的优劣点，并指出目前对于rpoB基因突变位点的检测仍然集中于PCR技术，该文对于质谱检测和分析突变位点未作进一步的分析。质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da（其中ddTMP是经过修饰的），它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点（SNP）、插入/缺失（InDel）、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化（copy number variation，CNV）等多种DNA变化类型进行检测。 

然而，由于质谱技术检测细菌存在着难以确定标准质谱特征图谱的问题。也就是说，尽管不同细菌之间的基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，但如果没有建立标准的质谱图谱数据库，则因为出现每次质谱检测细菌的结果因待检的基因组过于庞大而缺乏重复性，导致准确度下降。 

例如，朱健等人（“高效液相色谱-电喷雾多级质谱法对格尔德霉素粗品中各组分的初步判别及分类”，《中国抗生素》，2011年 03期 ）报道了应用高效液相色谱-电喷雾多级质谱法(LC-ESI-MSn) 对格尔德霉素(GDM)粗品中各组分进行与质量数相关的结构信息方面的初步判别及分类。该方法针对格尔德霉素(GDM)中不同组分的多级质谱碎片进行的分析整理，并对各种化合物进行了准确分类，但并不涉及针对细菌特定物质进行检测从而对细菌进行分类的方法。 

刘海洪（“MALDI TOF MS在细菌检测和鉴定中的应用”，《微生物学免疫学进展》，2003年 02期）报道了“细菌体内含有大量的生物标志分子能用于细菌的化学分类和鉴定，针对如根据细菌的组成成分获得 指纹图谱检测和鉴定细菌”，并对该方法预测其理论上的可行性。然而，该研究仅仅是理论上探讨了利用MALDI TOF MS对细菌进行分类的方向，其既没有指明所针对细菌的何种组分进行检测，也没有说明具体研究方法和过程。由于细菌中可用于分类的组分（如蛋白、DNA、RNA、多糖等）种类太多，且质谱技术针对不同待测物也存在各种实验参数的组合和选择，因此在此之后的近10年内并没有利用MALDI TOF MS进行细菌鉴定的新的报道。 

中国专利申请201110154723、“MALDI TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法”公开了一种利用MALDI TOF MS技术辅助鉴定细菌的方法，包括：预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDI TOF MS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理（通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测），尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。 

由于质谱技术检测细菌存在的上述缺陷，导致目前使用质谱技术检测细菌甚至结核杆菌的耐药突变基因一直没有进展。作为最接近的现有技术，中国专利申请201110178412、“结核杆菌耐药蛋白的筛选方法”报道了一种结合SDS凝胶电泳和质谱技术来筛选结核杆菌耐药蛋白的方法，该方法主要通过凝胶电泳纯化蛋白后，使用液相质谱来分离和鉴定耐药蛋白，并不涉及鉴定耐药基因和相关质谱特征库，因此也无法解决上述问题。因此目前需要新的结核杆菌rpoB基因的耐药突变基因的检测方法（如质谱法）来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。 

发明内容

本发明原理在于：针对结核分枝杆菌rpoB基因高度保守核心区域（RRDR）的DNA设计合适的引物进行PCR扩增，然后将PCR产物通过特定内切酶进行消化，产生一系列长度不一丰度不一的核酸片段，并通过MALDI-TOF MS质谱进行核酸分析并形成谱图。由于针对结核分枝杆菌野生型和突变型的rpoB基因RRDR的扩增后酶切，显著的缩小了质谱检测的基因组区域，且通过酶切后的质谱具有稳定的特征图谱，因而实现对利福平耐药性的检测。 

因此，发明人经过大量摸索和比对，针对结核分枝杆菌野生型及利福平耐药区域71种突变类型的研究，发现选用特定引物对结核分枝杆菌DNA进行PCR扩增，使用特殊酶对扩增产物处理后，进行质谱检测可以得到各种突变型核酸指纹特征图谱。  

因此，本发明的第一个目的在于提供能用于结核分枝杆菌利福平耐药性检测用途的试剂盒，包含用于扩增结核分枝杆菌DNA的RRDR区域特定引物对，所述引物如下表所示： 

SEQ ID No：1>cagtaatacgactcactatagggagaaggctGAGCGGATGACCACCCAGG>SEQ ID No：2>aggaagagagCACGCTCACGTGACAGACC>

其中，所述基因组区域中的突变引起了结核分枝杆菌对利福平的耐药性。  

在一个实施方案中，所述试剂盒还包括： 

（1）特定引物对的缓冲液； 

（2）SAP酶及其缓冲液； 

（3）RNAase及其缓冲液； 

（4）用于纯化酶切产物的树脂； 

（5）用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。 

在一个实施方案中，其中所述引物是SEQ ID NO:1-2。 

在另一实施方案中，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。 

本发明第二个目的在于提供利用上述试剂盒制备结核分枝杆菌rpoB基因RRDR的核酸指纹图谱的方法，它包括如下步骤： 

（1）PCR反应：使用结核分枝杆菌特定的PCR引物，扩增结核分枝杆菌核酸模板，得到含RRDR的PCR产物； 

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶处理步骤（1）得到的PCR产物； 

（3）酶切反应：使用特定内切酶，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的扩增产物进行酶切反应，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； 

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物，以避免盐离子对后续检测的影响； 

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到不同结核分枝杆菌分离株的特征核酸指纹谱图； 

在一个实施方案中，步骤3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。 

在另一个具体实施方案中，步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟。在另一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。 

上述任一方案中，其中所述结核分枝杆菌包括如表1所列的野生型及常见的69种突变类型。表中所述突变类型均发生在包含RRDR区域在内的200bp的基因序列上。 

突变位点>野生型>突变型>489>CCG>CCC>490>CAG>CAC>491>ACG>CAG>501>GCG>GCA>507>GGC>GAC/GGT>508>ACC>CCC>510>CAG>CAC>511>CTG>TTG/ATG/CCG/CGG/>512>AGC>GGC/AGG>513>CAA>CGA/AAA/CCA/GAA>515>ATG>ATT/GTG>516>GAC>GCC/GTC/GAA/GGC/AAA/AAC/TAC>517>CAG>CTG/CGG>518>AAC>GAC/AGC/TAC>519>AAC>AAT>521>CTG>TTG>522>TCG>GCG/TTG/CCG/TCC/ACG/TGG>523>GGG>GCG/GGC>525>ACC>ACT>526>CAC>GCC/GAC/CTC/AAC/CCC/CAG/CGA/CGC/GTC/TAC>529>CGA>AAA/CAA/CGG>530>CTG>CGG>531>TCG>GCG/TTC/TTG/CCG/CAG/TGG/TAC>532>GCG>GAG/GTG>533>CTG>TTG/ATG/CCG/>

表1 

本发明的第三个目的是提供建立结核分枝杆菌rpoB基因RRDR的核酸指纹特征图谱库的方法，至少包括： 

上述步骤1-5，和： 

(6)将步骤5得到的结核分枝杆菌野生型及突变型的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的结核分枝杆菌rpoB基因RRDR的核酸指纹特征图谱库。 

在一个实施方案中，所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。 

本发明的第四目的是提供上述方法所制备的结核分枝杆菌rpoB基因的RRDR突变区的核酸指纹特征图谱库。  

本发明第五目的是提供一种利用上述特征图谱库进行结核分枝杆菌利福平耐药性检测的方法，包括： 

（1）PCR反应：使用特定的PCR引物，扩增待测结核分枝杆菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物； 

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物； 

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； 

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物； 

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该菌株利福平耐药决定区的核酸指纹特征图谱； 

（6）将所得核酸指纹特征图谱与核酸指纹特征图谱库进行比较，从而判断待测结核分枝杆菌的rpoB基因RRDR是否发生突变及突变类型。 

在一个实施方案中，步骤3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。在另一个具体实施方案中，步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。 

定义 

本发明所述的“结核分枝杆菌rpoB基因RRDR突变型检测”，包括对结核分枝杆菌突变类型和利福平耐药性的判断。例如，对个体的血样或组织液样品进行分析，判断其结核分枝杆菌rpoB基因RRDR是否发生突变及突变类型，从而判断结核分枝杆菌是否对利福平出现耐药性，从而有利于相关药物的筛选。 

本发明所述的“核酸指纹图谱”是指包括结核分枝杆菌利福平耐药决定区在内的一段长度在200bp左右的DNA序列，经酶切后质谱检测所获得的谱图。利福平耐药决定区(rifampicin resistance determing region，RRDR)，是指位于结核分枝杆菌rpoB基因上长度为81bp的保守序列，RFP耐药菌株的基因突变都集中在507～533位的27个氨基酸(81bp)组成的区域， 97%利福平耐药株是由该序列(511、513、515、516、518、519、522、526、531和533位点)突变所致。 

本发明利用结核分枝杆菌的81bp保守区段设计通用引物（SEQ ID No：1至SEQ ID No：2），该引物的扩增包含结核分枝杆菌利福平耐药决定区域（RRDR，81bp）在内的200 bp左右的序列，本发明的突变型数据库包括RRDR上常见的突变位点也包括该区域上下游已发现的部分突变位点。 

目前应用于利福平耐药性检测的技术路线基本上是在用PCR方法对rpoB基因突变集中区域扩增基础上，对扩增产物进行突变鉴定，已有方法有直接测序法、多聚酶链式反应-单链构象多态性分析法（PCR-SSCP）、双脱氧指纹图法、异源双链形成法（HDF）、反向系列探针杂交法（LiPA）等。质谱技术用于利福平耐药性检测是一种新的技术手段，较现有的分子生物学检测方法该技术，该方法兼具快速、准确、价格低廉等优势。 

有益效果 

1.本发明反复研究结核分枝杆菌野生型及69种突变型的利福平耐药决定区酶切和质谱检测结果，发现并获得各种结核分枝杆菌核酸指纹特征图谱，建立数据库，可有效检测结核分枝杆菌的利福平耐药性；  

2.本发明首次提出将结核分枝杆菌的利福平耐药决定区域作为待测物进行质谱检测，以获得结核分枝杆菌不同的核酸指纹图谱，用于利福平耐药性的检测； 

3.经过反复实验和摸索，首次设计出利用质谱检测利福平耐药决定区域，获得结核分枝杆菌核酸指纹图谱的流程； 

4.由于质谱检测的高灵敏性，使用本方案对样品中菌量检测下限能够远超出其他技术方案（如生化检测、测序检测等）； 

5.本发明的数据库是开放式的，可不断补充新发现的突变类型，不断完善和扩大数据库，更好的服务于结核病利福平耐药检测和研究； 

6.相对于传统的细菌学的耐药性检测方法，该检测过程仅仅数小时内完成，省时省力； 

7.相对于直接测序方法，细菌核酸指纹图谱对于混合样品有更好的分辨能力，且更为省时和节约成本； 

8.使用本方案，可以快速的判断结核分枝杆菌利福平的耐药性及其突变型，该技术可广泛应用于结核病的临床治疗，及流行病的调查研究。 

附图说明

图1、2为结核分枝杆菌标准菌株核酸指纹特征图谱。 

图3、4为结核分枝杆菌分离株1的核酸指纹特征图谱。 

图5、6为结核分枝杆菌分离株2的核酸指纹特征图谱。 

图7-图76为野生型及表2中所示69种结核分枝杆菌突变型的模拟酶切核酸指纹特征图谱。 

图8 表2中第1号突变型（489位CCG→CCC）。 

图27表2中第20号突变型（518位AAC→AGC）。 

图47表2中第40号突变型（513位CAA→CGA）。 

图67表2中第60号突变型（532位GCG→GTG）。 

图77-78为实施例3中痰液样本1核酸指纹图谱和测序结果图谱。 

图77 实施例3痰液样本1质谱图。 

图78实施例3痰液样本1测序谱图。 

图79-80为实施例4中痰液样本2核酸指纹图谱和测序结果图谱。 

图79 实施例4痰液样本2质谱图。 

图80实施例4痰液样本2测序谱图。 

图81-82为实施例4中痰液样本3核酸指纹图谱和测序结果图谱。 

图81 实施例4痰液样本3质谱图。 

图82实施例4痰液样本3测序谱图。 

图83-84为实施例4中痰液样本4核酸指纹图谱和测序结果图谱。 

图83 实施例3痰液样本4质谱图。 

图84实施例4痰液样本4测序谱图。 

图85-86为实施例4中痰液样本5核酸指纹图谱和测序结果图谱。 

图85 实施例4痰液样本5质谱图。 

图86实施例4痰液样本5测序谱图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。 

实施例1：单个结核分枝杆菌利福平耐药决定区核酸指纹图谱的建立 

一、设计并选择合适引物 

根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)的rpoB基因RRDR的81bp序列，设计通用PCR引物，分别为： 

SEQ ID No：1>cagtaatacgactcactatagggagaaggctGAGCGGATGACCACCCAGG>SEQ ID No：2>aggaagagagCACGCTCACGTGACAGACC>

其中序列GAGCGGATGACCACCCAGG与CACGCTCACGTGACAGACC分别与rpoB待扩增区域匹配， cagtaatacgactcactatagggagaaggct与aggaagagag是在上下游PCR引物上添加的额外序列，确保为了对PCR产物进行转录， SEQ ID No：1引物的5'端含有31bp的tag（cagtaatacgactcactatagggagaaggct），SEQ ID No：2引物的5'端含有10bp的tag（aggaagagag）。 

相关引物在生工生物工程（上海）有限公司进行合成。 

二、通用引物扩增 

根据《分子克隆》的提取细菌DNA的方法，分别提取结核杆菌标准菌种1和2以及待测的分离株1和2的结核分枝杆菌的DNA，使用ABI 9700型PCR仪，进行生物学实验操作。 

1.PCR扩增 

（1）PCR的反应体系为：  

PCR反应缓冲液（10x PCR Buffer with 20mM MgCl₂）>0.5ul>dNTP mix（25mM each）>0.04ul>Taq酶（PCR Enzyme，5U/ul）>0.04ul>SEQ ID No：1（1μM）>1ul>SEQ ID No：2（1μM）>1ul>细菌DNA>1ul>超纯水>1.42ul>

以上试剂，除细菌DNA、超纯水、引物外，均来自于美国Sequenom公司。 

（2）PCR的循环参数为：  

95℃，4分钟，1个循环，  

95℃，20秒，56℃，30秒，72℃，60秒，45个循环，  

72℃，3分钟，1个循环， 

4℃，保存。 

2.SAP酶消化 

（1）SAP酶消化的反应体系为： 

在5ul的PCR产物中，加入RNase-free ddH₂O：1.7ul，SAP酶（SAP enzyme，1.7U/ul）：0.3ul。 

以上试剂均来自于美国Sequenom公司。 

（2）SAP酶消化的反应参数为： 

37℃，20分钟，1个循环，  

85℃，5分钟，1个循环， 

4℃，保存。 

3.转录和核酸酶切 

（1）转录和核酸酶切的反应体系为： 

取2ul的消化产物，加入： 

RNase-free ddH2O>0.5ul>5xT7 Polymerase Buffer>0.04ul>T Cleavage Mix>0.04ul>DTT（100mM）>1ul>T7 RNA & DNA Polymerase>1ul>RNaseA>1ul>

以上试剂，均来自于美国Sequenom公司。 

（2）转录和酶切的反应参数为：  

37℃，3h。  

4.纯化 

在7ul的转录和酶切产物中加入20ul超纯水，混匀后，再加入6mg树脂（resin，美国Sequenom公司），上下颠倒混匀15分钟。 

三、建立单个结核分枝杆菌利福平耐药决定区核酸指纹图谱 

纯化后的产物使用纳升点样仪（Nanodispenser，美国Sequenom公司），点至含基质的芯片上（SpectroCHIP，美国Sequenom公司），并使用飞行时间质谱仪（美国Sequenom公司）进行检测和结果判断。 

使用上述方案，进行验证实验，对结核分枝杆菌分离株1和2进行酶切和质谱鉴定。两个菌株各重复两次，均得到相同的核酸指纹特征图谱，其中图3和图4、图5和图6分别显示结核分枝杆菌分离株1和2的利福平耐药决定区的核酸指纹特征图谱。 

将待测的分离株1和2的质谱结果图与对照图1-2进行比较，可以看出，本实施方案所选的结核分枝杆菌利福平耐药决定区域，经过生物学实验操作，产生了不同长度和不同丰度的核酸片段组合，经质谱检测，形成不同于对照图谱的特异核酸指纹图谱（如2000-3000m/z、3400-4000 m/z区域），且分离株1和2的图谱也存在差异，这表明分离株1和2相对于野生株，具有不同的突变耐药位点。经过生物学分析，可判断分离株1发生了516位GAC→GGC的突变，分离株2发生了526位CAC→AAC的突变。由此，可用于对利福平耐药性进行判断。  

实施例2：结核分枝杆菌rpoB基因RRDR的核酸指纹特征图谱库的建立 

根据实施例一所述的方法以及引物，对表1中所列的结核分枝杆菌突变型进行酶切和质谱鉴定，得到所有常见突变型的核酸指纹特征图谱。 

将这些特征图谱，通过Bioexplore软件进行整合分析，从而得到包括结核分枝杆菌野生型及常见突变型在内的rpoB基因RRDR的核酸指纹特征图谱库。 

如表2所示，图7为结核分枝杆菌野生型的核酸指纹特征图谱，图8-图76分别显示69种结核分枝杆菌突变型的核酸指纹特征图谱。 

第1-23号突变类型>第24-46号突变类型>第47-69号突变类型>489位CCG→CCC>516位GAC→GGC>526位CAC→AAC>490位CAG→CAC>516位GAC→AAA>526位CAC→CCC>491位ACG→CAG>516位GAC→AAC>526位CAC→CAG>501位GCG→GCA>516位GAC→TAC>526位CAC→CGA>507位GGC→GGT>517位CAG→CTG>526位CAC→CGC>507位GGC→GAC>517位CAG→CGG>526位CAC→GTC>508位ACC→CCC>518位AAC→GAC>526位CAC→TAC>510位CAG→CAC>518位AAC→AGC>529位CGA→AAA>511位CTG→TTG>518位AAC→TAC>529位CGA→CAA>511位CTG→ATG>519位AAC→AAT>529位CGA→CGG>511位CTG→CCG>521位CTG→TTG>530位CTG→CGG>511位CTG→CGG>522位TCG→GCG>531位TCG→GCG>512位AGC→GGC>522位TCG→TTG>531位TCG→TTC>512位AGC→AGG>522位TCG→CCG>531位TCG→TTG>513位CAA→CGA>522位TCG→TCC>531位TCG→CCG>513位CAA→AAA>522位TCG→ACG>531位TCG→CAG>513位CAA→CCA>522位TCG→TGG>531位TCG→TGG>513位CAA→GAA>523位GGG→GCG>531位TCG→TAC>515位ATG→ATT>523位GGG→GGC>532位GCG→GAG>515位ATG→GTG>525位ACC→ACT>532位GCG→GTG>516位GAC→GCC>526位CAC→GCC>533位CTG→TTG>516位GAC→GTC>526位CAC→GAC>533位CTG→ATG>516位GAC→GAA>526位CAC→CTC>533位CTG→CCG>

[0116] 表2 

实施例3：利用建立的结核分枝杆菌利福平耐药决定区的核酸指纹特征图谱库，对临床样本进行检测 

取结核病患者痰液2ml。其中对待测样本1进行以下处理，加入2.5倍体积4% NaOH，37℃温育30min。将液化后的痰液离心，弃上清，所得沉淀用于样本DNA的提取。用商品化的基因组DNA提取试剂盒进行样本DNA的提取。将获得的基因组DNA一分为二，样本1根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程耗时1-2小时。结果如图7所示。 

将所得的质谱特征图与实施例2中获得的结核分枝杆菌rpoB基因RRDR的核酸指纹特征图谱库进行比对，比对过程通过BioExplore软件完成，主要分为两个步骤，如下： 

1.实验获得的图谱与库中野生型比对，采用的判断标准是： 

当2.300≤匹配分数≤3.000，表示序列鉴定为野生型的可信度很高； 

当0.000≤匹配分数＜2.300，表示可能发生突变。 

若判断为可能发生突变，则进行步骤2的判断。 

2. 实验获得的图谱与库中突变型数据比对，采用的判断标准是： 

当2.300≤匹配分数≤3.000，表示该突变型的可信度很高；  

当2.000≤匹配分数＜2.300，表示发生突变但该突变型不可确定；  

当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能发生突变；  

在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。  

对比分析结果如下： 

待测样品图谱分别与本发明所建立的图谱库中的谱图对比，报告为该结核分枝杆菌利福平耐药决定区发生突变，且该突变类型为511位CTG→CCG，该菌对利福平有耐药性。 

对照实施例1： 

使用前述提取细菌DNA的方法，将样本1进行直接测序检测，结果如图8所示。 

经过分析，测序结果与质谱检测结果一致，该菌株在511位发生了CTG→CCG的突变。 

实施例3的核酸指纹特征图谱法鉴定的结果表明，该病患对利福平药物出现耐药性，需要及时改变治疗方案。 

实施例4利用建立的结核分枝杆菌利福平耐药决定区的核酸指纹特征图谱库，对多个临床样本进行检测 

根据实施例3的方法，对多个病患的痰液样品进行质谱检测，同时进行测序检测，结果如表3所示。 

待测样本>质谱结果图>突变类型>测序结果图>突变类型>2>图79>CAC→TAC>图80>CAC→TAC>3>图81>CAC→GAC>图82>CAC→GAC>4>图83>TCG→TTG>图84>TCG→TTG>5>图85>CAC→CGC>图86>CAC→CGC>

SEQUENCE LISTING

 

<110>  向华

 

<120>  结核分枝杆菌rpoB基因的核酸指纹特征图谱库及其用途

 

<130>  2012

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tgagcggatg accacccagg                  50

 

 

<210>  2

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

aggaagagag cacgctcacg tgacagacc                                         29