一种用于磁光双模生物标记的稀土掺杂氟化钆钾纳米材料及其制备方法

摘要

一种用于磁光双模生物标记的稀土掺杂氟化钆钾纳米材料及其制备方法，涉及利用据丙烯亚胺为表面活性剂，在蒸馏水、乙醇、乙二醇中，将氯化钆、氯化钾、氟化铵混合，在50-230℃下水热处理一段时间。进行洗涤干燥后，即可得到KGdF

说明书

 

技术领域

本发明涉及磁光双模生物标记材料及其制备方法，尤其是涉及稀土掺杂氟化钆钾纳米材料的制备及其在磁光双模生物标记领域的应用。

 

背景技术

多模生物检测，由于其能够同时实现光、核、磁、超声等多种模式的成像检测，而受到了科学界和社会越来越广泛的关注，而其中磁光双模生物标记尤为引人注目。这是由于能够提供检测手段中最高的检测灵敏度的光检测容易受到探测深度的限制，磁共振成像虽能够进行三维检测，却因为较低的探测灵敏度和分辨率而限制了其广泛应用。因此能够将磁光两种检测模式集中在一起的磁光双模生物标记，就可以实现高分辨率、高灵敏度、和生物活体的体内检测。当前的磁光双模标记材料大多是通过超顺磁的氧化铁纳米颗粒与有机染料或量子点的结合来制备得到的。然而这种杂化材料在生物标记领域的应用却面临许多困难，如超顺磁氧化铁纳米颗粒对正常细胞组织的磁诱导效应不利于其在生物体内的磁共振成像检测；有机染料的光漂白、发射峰宽、光色度不纯等弱点导致其探测信号的不稳定；量子点毒性较大,制备成本较高，不适宜用作生物体内成像标记材料。此外，将两种不同的颗粒结合在一起，往往会破坏它们各自的光学和磁学特性，而且必然会使颗粒尺寸增大，从而导致应用效果大打折扣。（Kim, J. et al. “Multifunctional Uniform Nanoparticles Composed of a Magnetite Nanocrystal Core and a Mesoporous Silica Shell for Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging and for Drug Delivery” Angewandte Chemie-International Edition Vol.47, 8438-8441, 2008；Huh, Y. M. et al. “In vivo magnetic resonance detection of cancer by using multifunctional magnetic nanocrystals” Journal of the American Chemical Society Vol.127, 12387-12391, 2005）。稀土掺杂的含钆纳米材料，由于其优良的发光和磁学性能，而被广泛认为是新一代最佳的磁光双模生物标记材料。稀土掺杂的纳米晶的荧光发射峰较窄、色度纯、寿命长、光稳定，比较适合作为生物荧光标记材料。钆离子由于其4f电子层含有七个单电子，被认为是元素周期表中最佳的T₁磁共振成像造影剂的金属离子。更为重要的是，由于发光的稀土离子和提供磁诱导效应的钆离子来自于同一个纳米颗粒，因此该方法可以避免复杂的合成程序和颗粒尺寸变大。氟化物，特别是AREF₄（A=碱金属, RE=稀土离子）结构的氟化物，由于其声子能量较低并能够实现其他稀土离子的高浓度掺杂，所以被广泛用作稀土离子掺杂的基质。本发明通过在氟化钆钾纳米材料中掺杂不同的稀土离子可以实现其多色发光。同时利用纳米颗粒表面的氨基可以与生物分子进行连接而应用于生物标记。而利用基质中含有的钆离子，该纳米颗粒可以进行T₁磁共振成像标记。

 

发明内容

本发明提出一种用于磁光双模标记的稀土掺杂氟化钆钾纳米材料的制备方法。

本发明制备的稀土掺杂氟化钆钾纳米材料的组分为：xLn³⁺－(1-x) KGdF₄（Ln=Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb; x=0-60 mol％）。

本发明采用如下制备工艺：将稀土氯化盐、氯化钆、氯化钾和聚丙烯亚胺完全溶解在蒸馏水、乙醇和乙二醇中;另将适量氟化铵溶解在蒸馏水和乙醇中并滴加到上述溶液,然后在50-230℃下水热处理。沉淀经过分离、洗涤、干燥后可得到表面氨基化的KGdF₄:Ln纳米晶粉末。

所述的稀土掺杂氟化钆钾纳米材料的表征：通过X射线粉末衍射（XRD）实验检测表明制备出的氟化钆钾纳米晶为纯立方相结构。透射电镜（TEM）测试显示得到的是25纳米左右的均匀分散纳米颗粒；高分辨透射电镜（HRTEM）照片可以清楚的观察到均匀连续的晶格条纹，表明纳米颗粒结晶较好。另外，在纳米晶中，可以通过掺杂不同的稀土离子实现所需要的特定荧光发射。

选用据丙烯亚胺为表面活性剂，既可控制纳米晶大小，又可实现其表面的氨基功能化。

所得到氨基化的稀土掺杂氟化钆钾纳米材料的用途，其特征在于：应用于磁光双模生物标记和检测。制备所得的稀土掺杂氟化钆钾纳米材料利用其表面的氨基与生物分子进行连接，同时可通过稀土掺杂氟化钆钾纳米材料内掺杂不同的稀土离子实现特定的发光，来对这一生物连接进行检测，应用于荧光生物标记等领域。

本发明材料制备工艺简单、成本低、重复性好、可以进行大批量生产。本发明与目前国内外制备的其他磁光双模生物标记材料相比，纳米晶颗粒均一，尺寸小，发射峰窄，发光强度高，发光寿命长，磁驰豫率大，是一种优良的新型的磁光双模生物标记材料。纳米颗粒表面有氨基基团，具有较好的水溶性，可以直接应作磁光双模生物标记材料。

 

附图说明

附图1：KGdF₄: Ln纳米晶用作磁光双模标记材料的示意图。

附图2：KGdF₄: Eu³⁺ (2.5 mol%) 纳米晶XRD衍射图样。

附图3: 掺KGdF₄:Tb³⁺ (2.5 mol%)纳米晶的透射电镜图。

附图4: 掺KGdF₄:Dy³⁺ (2.5 mol%)纳米晶的高分辨透射电镜图。

附图5:胚肺成纤维细胞与不同浓度的KGdF₄纳米晶培养24小时后的活性图。

附图6：掺Ln³⁺ 1.5at％(Ln=Eu³⁺, Tb³⁺, Dy³⁺)的KGdF₄纳米晶的激发和发射光谱。

附图7：KGdF₄:Tb³⁺纳米晶生物素化的流程示意图。

附图8：生物素化的KGdF₄:Tb³⁺ (2.5 mol%) 对于不同浓度的抗生物素蛋白的检测曲线。

附图9：KGdF₄纳米晶的 (a) 磁共振驰豫率以及 (b) 不同浓度水溶液的磁共振成像示意图。

具体实施方式

实例1：称取0.0037 g氯化铕(EuCl₃·6H₂O)、0.8 g氯化钾(KCl)和0.37 g氯化钆(GdCl₃·6H₂O)完全溶解在12 mL蒸馏水中，然后加入1 mL乙醇、20 mL乙二醇、和10 mL聚丙烯亚胺溶液，搅拌得到透明溶液A；在另一烧杯中将适量氟化铵溶解在0.5 mL蒸馏水中,然后加入2.5 mL乙醇，搅拌得到透明溶液B；在搅拌状态下，往溶液B中逐滴加入到溶液A，继续搅拌十分钟,将溶液转移入水热罐中，在170 ℃下水热处理20小时。冷却后，将上层澄清液去掉，将下层沉淀用水和乙醇轮流洗涤三次后干燥，然后在60 ℃真空条件下干燥得到KGdF₄:Eu³⁺ 纳米晶粉末。将该纳米晶粉末溶解在蒸馏水，可以得到无色透明溶液，在272.5 nm激发下，能够观察到较强红色发光。

实例2：称取0.0037g氯化铽(TbCl₃·6H₂O)、1.8g氯化钾(KCl)和0.37g氯化钆(GdCl₃·6H₂O)完全溶解在5mL蒸馏水中,然后加入25mL乙醇、5mL乙二醇和5 mL聚丙烯亚胺溶液,搅拌得到透明溶液A;在另一烧杯中将适量氟化铵溶解在1mL蒸馏水中,然后加入1mL乙醇，搅拌得到透明溶液B;在搅拌状态下,往溶液B中逐滴加入到溶液A,继续搅拌十分钟,将溶液转移入水热罐中,在110 ℃下水热处理18小时.冷却后,将上层澄清液去掉,将下层沉淀用水和乙醇轮流洗涤三次后干燥，然后在50℃真空条件下干燥得到KGdF₄:Tb纳米晶粉末。将2毫克KGdF₄:Tb³⁺ 纳米晶粉末溶解在20mL的蒸馏水，可以得到KGdF₄:Tb无色透明溶液。用272.5 nm激发下，能够看到绿色的发光。

实例3：称取0.0037g氯化镝(DyCl₃·6H₂O)、1.8g氯化钾(KCl)和0.37g氯化钆(GdCl₃·6H₂O)完全溶解在2mL蒸馏水中,然后加入28mL乙二醇和0.5 mL聚丙烯亚胺溶液,搅拌得到透明溶液A;在另一烧杯中将适量氟化铵溶解在5mL蒸馏水中,然后加入1mL乙醇，搅拌得到透明溶液B;在搅拌状态下,往溶液B中逐滴加入到溶液A,继续搅拌十分钟,将溶液转移入水热罐中,在140 ℃下水热处理24小时.冷却后,将上层澄清液去掉,将下层沉淀用水和乙醇轮流洗涤三次后干燥，然后在65 ℃真空条件下干燥得到KGdF₄:Dy³⁺ 纳米晶粉末。将15毫克KGdF₄:Dy纳米晶粉末溶解在20mL的蒸馏水，可以得到KGdF₄:Dy无色透明溶液。用272.5nm激发下，能够看到蓝色的发光。

实例4：称取不同质量的KGdF₄纳米晶，分别加入到相同数量的胚肺成纤维细胞的培养皿中，在37摄氏度，5%CO₂的培养箱中孵育24小时后，利用细胞活性检测技术，发现不同胚肺成纤维细胞在较大浓度的KGdF₄纳米晶水溶液中，仍然保持95%以上的活性，说明KGdF₄纳米晶具有生物兼容性。

实例5：KGdF₄:Tb纳米晶连接生物素的制备。称取0.2 mmol生物素（biotin）以及0.2 mmol 1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和0.5 mmol N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），溶解于20 mL磷酸盐缓冲液（pH=7.2），搅拌15分钟，接着向其中加入20 mg KGdF₄:Tb纳米颗粒，搅拌1天，然后将沉淀离心分离，用蒸馏水和乙醇洗涤多次，在真空干燥箱中干燥，即可得到表面修饰生物素的KGdF₄:Tb无机纳米晶。

实例6：将连接上生物素的KGdF₄:Tb纳米晶溶解于磷酸盐缓冲液（pH=7.2），分成相同体积的数份，然后与不同浓度的标记有异硫氰酸荧光素的亲和素（FITC-avidin）进行培养后，在荧光读板机上采取时间分辨光谱法进行检测，激发波长为253 nm，延迟时间为100 μs，门控时间为1 ms。由于纳米颗粒内掺杂的稀土离子Tb³⁺与荧光素FITC存在的荧光共振能量传递（FRET），结果显示随着加入的FITC-avidin浓度的增大，检测到Tb³⁺对应于489 nm波段的发光强度减小，同时荧光素FITC对应于520 nm波段的发光强度增大，在3.7-200（？） nM范围内，亲和素浓度与荧光强度变化之间存在着较好的线性关系，说明利用纳米颗粒的荧光可以应用于检测亲和素。

实例7：将KGdF₄纳米晶溶解在水中，并稀释成不同浓度的KGdF₄的水溶液。在医用磁共振成像仪T₁检测序列下，随着KGdF₄浓度的增加，得到的图片亮度逐渐增加，说明KGdF₄可以用作T₁磁共振成像造影剂。