蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明适用于微生物技术领域，提供了一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括DNA提取液、PCR反应液。本发明蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒及检测方法能同时检测蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的检测。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒及检测方法。 

背景技术

蜡样芽胞杆菌是一种杆状、产生芽孢的革兰氏阳性细菌，由于蜡样芽胞杆菌自然界分布甚广，常存在于土壤、飞尘、腐草和空气中，极易在食品加工、运输、存储、销售过程中，通过苍蝇、蟑螂等昆虫和不卫生的用具和手污染。在临床上可导致脓肿、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎等报道，但最常见的是导致不同类型的食物中毒：腹泻型和呕吐型。阪崎肠杆菌(又称阪崎氏肠杆菌)是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和茵血症，死亡率高达50％以上。金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌″的别称，是革兰氏阳性菌的代表。金黄色葡萄球菌致病力强弱主要取决于其产生的侵袭性酶和毒素，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。 

国际上通用的金黄色葡萄球菌采用培养检测如下： 

(1)样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。 

(2)增菌培养：将10-1稀释液接入7.5％NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37℃培养24小时。 

(3)分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37℃培养24～48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2～3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。 

(4)染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5～1μm。 

(5)血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1℃培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。 

(6)耐热核酸酶试验 

将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36±1℃培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。 

阪崎肠杆菌采用培养法检测如下： 

(1)前增菌和增菌 

取检样100g(mL)加入已预热至44℃装有900mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36℃±1℃培养18h±2h。移取1mL转种于10mL ST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。 

(2)分离 

轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36℃±1℃培养24h±2h。挑取1个～5个可疑菌落，划线接种于TSA平板。25℃±1℃培养48h±4h。 

(3)鉴定 

自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。 

(4)结果与报告 

综合菌落形态和生化特征，报告每100g(mL)样品中检出或未检出阪崎肠杆菌。 

根据上述通用方法，同时检测样品中蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌这三种细菌的周期长(至少48小时)、操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂(生化试验试剂和血清)繁多等缺点已远远不能满足快速检测蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的要求。 

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒，解决现有技术中同时检测蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌灵敏的低，周期长等技术问题，以及蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的检测方法。 

本发明是这样实现的， 

一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液中包括蜡样芽孢杆菌正向引物、蜡样芽孢杆菌反向引物、蜡样芽孢杆菌探针、阪崎肠杆菌第一引物、阪崎肠杆菌第二引物、阪崎肠杆菌探针、金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针，所述蜡样芽孢杆菌正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，蜡样芽孢杆菌反向引物序列如 SEQ ID NO：2所示，蜡样芽孢杆菌探针序列如SEQ ID NO：3所示，阪崎肠杆菌第一引物序列如SEQ ID NO：4所示，阪崎肠杆菌第二引物序列如SEQ ID NO：5所示，阪崎肠杆菌探针序列如SEQ ID NO：6所示，金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQ ID NO：7所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO：8所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQ ID NO：9。 

本发明进一步提供一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法，包括如下步骤： 

提供蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA样品； 

进行荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用前述的蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒。 

本发明蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒及检测方法能同时检测蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌，不用对待测样品进行长时间的增菌培养，同时加入有检测引物和探针，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的检测。 

附图说明

图1是本发明实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒中阳性对照PCR扩增图； 

图2是本发明实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒阴性对照PCR扩增图； 

图3是本发明实施例一蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试方法中阳性样本PCR扩增图； 

图4是本发明实施例一蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试方法中阴性样本PCR扩增图； 

图5是蜡杨芽孢杆菌培养法检测流程图。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。 

本发明实施例提供一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液中包括蜡样芽孢杆菌正向引物、蜡样芽孢杆菌反向引物、蜡样芽孢杆菌探针、阪崎肠杆菌第一引物、阪崎肠杆菌第二引物、阪崎肠杆菌探针、金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针，所述蜡样芽孢杆菌正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，蜡样芽孢杆菌反向引物序列如SEQ ID NO：2所示，蜡样芽孢杆菌探针序列如SEQ ID NO：3所示，阪崎肠杆菌第一引物序列如SEQ ID NO：4所示，阪崎肠杆菌第二引物序列如SEQ ID NO：5所示，阪崎肠杆菌探 针序列如SEQ ID NO：6所示，金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQ ID NO：7所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO：8所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQ ID NO：9。 

具体地，本发明实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其中包括DNA提取液、PCR反应液，可以同时进行蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的检测；该试剂盒中还包括蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌阴性对照、阳性对照。试剂盒的规格： 

阴性对照的规格为1管，40μl/管，阳性对照的规格为1管，40μl/管，DNA提取液为5ml/管(共1管)，PCR反应液为8管/条×6条，20μl/管。 

该阴性对照为不含有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌基因的Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)。 

该阳性对照为使用蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌和DNA提取制备的阳性模板对照品，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)稀释后冷冻保存。该阴性和阳性对照用于检测时的自我检验，防止检出误差的出现。请参阅图1和图2，图1显示试剂盒中阳性对照的PCR扩增图谱，图2显示试剂盒中阴性对照的PCR扩增图谱。 

具体地，该DNA提取液(用于提取DNA)具体成分为：Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)，含0.01％NP-40。 

具体地，该PCR反应液包括第一反应、第二反应液及石蜡，该第一反应液和第二反应液通过石蜡实现分隔，在PCR反应过程中，由于温度在95℃，石蜡融化，第一反应液和第二反应液混合，PCR反应得以进行，该石蜡的具体内容见专利(200910190112.7)。该PCR 反应试剂存放于普通离心管中，该第一反应液位于下端，石蜡位于中间，该第二反应液位于石蜡上面。 

具体地，该第一反应液包括缓冲液，氯化镁，dNTPs，蜡样芽孢杆菌正向引物、蜡样芽孢杆菌反向引物、蜡样芽孢杆菌探针、阪崎肠杆菌第一引物、阪崎肠杆菌第二引物、阪崎肠杆菌探针、金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针，以及，灭菌超纯水，第一反应液的总体积为18微升/管。 

该缓冲液为10×Buffer，该缓冲液(宝生物工程(大连)有限公司)中不含有镁离子。该缓冲液的体积为2～4微升/管； 

该该氯化镁的浓度为25mM，该氯化镁的体积为2～4微升/管； 

该dNTPs的浓度2.5mM，体积为2～4微升/管； 

该蜡样芽孢杆菌正向引物的浓度为50μM，体积为0.1～0.2微升/管，例如0.15微升/管，该蜡样芽孢杆菌正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’-AAATCAA ACAAATTGTT GCGC-3’-； 

该蜡样芽孢杆菌反向引物的浓度为50μM，体积为0.1～0.2微升/管，例如0.15微升/管，该蜡样芽孢杆菌反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为： 

5’-CCATATTAGTGAAAGCCGCACT-3’； 

该蜡样芽孢杆菌探针的浓度为50μM，体积为0.1～0.2微升/管，例如0.15微升/管，该蜡样芽孢杆菌探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：5’-(FAM)TAGTT TGTTTAACAA CGCGCG(DABCYL)-3’； 

该阪崎肠杆菌第一引物的浓度为50μM，体积为0.1～0.2微升/管，例如0.15微升/管，该阪崎肠杆菌第一引物的核苷酸序列如SEQ ID  NO：4所示，具体为：5’-AGCTTCCG CAGTGAAACG TCACG-3’； 

该阪崎肠杆菌第二引物的浓度为50μM，体积为0.1～0.2微升/管，例如0.15微升/管，该阪崎肠杆菌第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：5’-GCACTGCAAAGTGACGCCTTCG-3’； 

该阪崎肠杆菌探针的浓度为50μM，体积为0.1～0.2微升/管，例如0.15微升/管，该阪崎肠杆菌探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体为： 

5’-(HEX)CTGGCTC GCGAAAACGC ACGC(DABCYL)-3’； 

该金黄色葡萄球菌第一引物的浓度为50μM，体积为0.1～0.2微升/管，例如0.15微升/管，该金黄色葡萄球菌第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，具体为：5’-ATACACCT GAAACAAAGCATCC-3’-； 

该金黄色葡萄球菌第二引物的浓度为50μM，体积为0.1～0.2微升/管，例如0.15微升/管，该金黄色葡萄球菌第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，具体为： 

5’-AAGTCCTGGTATAAAGAGATGTGG-3’； 

该金黄色葡萄球菌探针的浓度为50μM，体积为0.1～0.2微升/管，例如0.15微升/管，该金黄色葡萄球菌探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，具体为：5’-(ROX)GGTGTAGAG AAATATGGTC CTGA(DABCYL)-3’； 

该灭菌超纯水的量为4.2～11.1微升/管，实现第一反应液的体积为18微升/管。 

具体地，该第二反应液包括Taq酶、显色剂及灭菌超纯水，该第二反应液的总体积为2微升/管。 

该Taq酶的体积为0.15-0.3微升/管，显色剂的体积为0.01-0.02微升/管，该显色剂例如，溴酚兰。该灭菌超纯水的量为1.68～1.84微升/管，使第二反应液的体积满足2微升/管。 

具体地，该石蜡的体积为20微升/管。 

本发明实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒能同时检测蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的检测。 

本发明实施例进一步提供一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法，包括如下步骤： 

步骤S01，增菌培养和标本处理： 

提供蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA样品； 

步骤S02，实时荧光PCR： 

进行实时荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用上述的蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒。 

具体地，步骤S01在无菌条件下操作。 

具体地，步骤S01中，采集样本，该样本中可能含有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌，也可能不含有，需要本发明实施例的检测方法进行检测确定。因此，本步骤S01中，蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA样品中可能含有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA，也可能不含有。 

将采集后的标本放置37℃恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理： 

取1ml增菌液加入DNA提取液50μL，反复抽吸3次充分混匀标 本。 

具体地，步骤S02中，取步骤S01中所得到的上清液，进行荧光定量PCR分析，本步骤中所使用的荧光定量PCR设备没有限制，ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon 2)、Stratagene MX系列、Roche LightCycler、Cepheid SmartCycler、Corbett Rotor-Gene、杭州博日系列。 

步骤S02中PCR反应的条件为： 

50-55℃：2-5min； 

94-95℃：2-3min； 

94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；(40循环)。 

本发明实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法中，每次检测都设置试剂盒中的阳性对照和阴性对照，以防止检测过程中污染的出现。 

以下结合具体实施例对上述蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法进行详细说明。 

实施例一 

本发明实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法包括如下步骤： 

1、采集蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的样本，该样本数为20个，其中一些样本中含有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌，一些样本没有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌。将采集后的标本放置37℃恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理： 

取1ml增菌液加入DNA提取液50μL，反复抽吸3次充分混匀标 本，得到蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA样品； 

2、取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为： 

在如下条件下进行实施荧光定量PCR反应，并进行检测： 

50-55℃：2-5min； 

94-95℃：2-3min； 

94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；(40循环)。 

实施例二 

本发明实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法包括如下步骤： 

1、采集蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的样本，该样本数为20个，其中一些样本中含有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌，一些样本没有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌。将采集后的标本放置37℃恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理： 

取1ml增菌液加入DNA提取液50μL，反复抽吸3次充分混匀标本，得到蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA样品； 

2、取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为： 

在如下条件下进行实施荧光定量PCR反应，并进行检测： 

50-55℃：2-5min； 

94-95℃：2-3min； 

94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；(40循环)。 

实施例三 

本发明实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法包括如下步骤： 

1、采集蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的样本，该样本数为20个，其中一些样本中含有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌，一些样本没有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌。将采集后的标本放置37℃恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理： 

取1ml增菌液加入DNA提取液50μL，反复抽吸3次充分混匀标本，得到蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA样品； 

2、取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为： 

在如下条件下进行实施荧光定量PCR反应，并进行检测： 

50-55℃：2-5min； 

94-95℃：2-3min； 

94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；(40循环)。 

对比例 

本对比例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法包括如下步骤： 

1、采集含有蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的样本，该对比例的样本和实施例一的样本一致，将采集后的标本放置37℃恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理： 

取1ml增菌液加入DNA提取液50μL，反复抽吸3次充分混匀标本，得到蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA样品； 

2、按照前面背景技术所讲的国际通用方法进行检测。 

请参阅下表，下表显示应用实施例一和对比例的方法检测20例样本的结果： 

从该表中可以看出，本发明实施例一的方法和对比例的方法接侧结果一致。 

请参阅图3、图4，图3是本发明实施例一蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试方法中阳性样本PCR扩增图；图4是本发明实施例一蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试方法中阴性样本PCR扩增图将图3和图1、图4和图2对比后可知，本发明实施例一的蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法，能够检测出样本中阳性样本和阴性样本，检测结果正确。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。