MPG蛋白在抑制p53基因转录中的应用

摘要

本发明公开了一种MPG蛋白在抑制p53基因转录中的应用。本发明发现MPG蛋白可用于抑制p53蛋白的转录活性、抑制与p53蛋白有关的代谢通路、抑制p53蛋白下游靶蛋白的编码基因的转录，导入MPG蛋白的编码基因后，细胞中的p53蛋白含量降低，而p53蛋白是一种已知的重要的转录因子，其含量降低后，转录活性相应降低，其下游的靶蛋白的含量也随之变化。本发明对于进一步研究p53蛋白的代谢通路，人为促进或抑制p53蛋白的代谢通路具有重大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及MPG蛋白在抑制p53基因转录中的应用。

背景技术

p53蛋白作为序列特异性转录因子，能通过调节大量靶基因的表达介导不同的下游 功能，参与细胞周期阻滞、凋亡、老化和DNA损伤修复等诸多细胞事件。

p53蛋白作为转录因子，具有经典的序列特异性转录因子特征，它的结构包含有N 端转录活化区，中部的DNA结合区(DBD，DNA binding domain)和C端的四聚化区。 p53能特异的与被称为p53保守结合模序的序列结合。这个模序又被称为p53反应元 件(p53REs，p53 response elements)，通常存在于许多p53靶基因转录起始位点(TSS， transcriptional start site)的上游和下游，包含有两段重复的保守序列 ——RRRCWWGYYY(R=A,G;W=A,T;Y=C,T),中间间隔有0-13个碱基。然而， 并不是所有含有p53REs的靶基因与p53的结合力都是一致的，提示了p53作为转录因 子功能的复杂性。p53REs的DNA拓扑结构可能从功能上也产生了不同启动子区的区别。 目前的研究发现，一部分基因的p53REs临近区域保持持续的松散、非核小体结合状态， 如GADD45和MDM2，而另一部分基因则与此相反，提示了p53对不同靶基因活化差别 的可能机制。另一方面，DNA自身的构象也很重要，例如MDM2和p21的启动子区更倾 向于形成非B型DNA构象。总体来说，p53的下游靶基因虽然都含有相似的p53REs， 但是p53对各个基因中的p53REs亲和力是有很大差别的，相较而言，p53对周期相关 靶基因的亲和力大于与凋亡相关的靶基因。这种p53的不同亲和力进一步提示了p53 对于细胞命运决定的倾向性。少量的p53倾向于引起细胞周期阻滞，而大量p53累积 则更容易引起细胞凋亡。

发明内容

本发明的目的是提供MPG蛋白在抑制p53基因转录中的应用。

本发明提供了MPG蛋白在制备与p53蛋白有关的代谢通路的抑制剂中的应用。所 述与p53蛋白有关的代谢通路具体可为细胞周期。所述与p53蛋白有关的代谢通路具 体可为MCF7细胞或HEK293细胞中与p53蛋白有关的代谢通路。

本发明还提供了MPG蛋白在制备产品中的应用；所述产品具有如下功能中的至少 一种：（1）抑制p53蛋白的转录活性；（2）抑制与p53蛋白有关的代谢通路；（3）抑 制p53蛋白下游靶蛋白的编码基因的转录；（4）抑制p53蛋白的编码基因的表达。所 述靶蛋白可为周期相关蛋白，如p21蛋白、14-3-3σ蛋白或Gadd45蛋白。所述（1） 中，所述p53蛋白的转录活性具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中p53蛋白的转录活 性。所述（2）中，所述与p53蛋白有关的代谢通路具体可为MCF7细胞或HEK293细胞 中与p53蛋白有关的代谢通路。所述（3）中，所述p53蛋白下游靶蛋白的编码基因的 转录具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中p53蛋白下游靶蛋白的编码基因的转录。所 述（4）中，所述p53蛋白的编码基因的表达具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中p53 蛋白的编码基因的表达。

MPG蛋白可用于抑制p53蛋白的转录活性。所述p53蛋白的转录活性具体可为MCF7 细胞或HEK293细胞中p53蛋白的转录活性。

MPG蛋白可用于抑制与p53蛋白有关的代谢通路。所述与p53蛋白有关的代谢通 路具体可为细胞周期。所述与p53蛋白有关的代谢通路具体可为MCF7细胞或HEK293 细胞中与p53蛋白有关的代谢通路。

MPG蛋白可用于抑制p53蛋白下游靶蛋白的编码基因的转录。所述靶蛋白可为周 期相关蛋白，如p21蛋白、14-3-3σ蛋白或Gadd45蛋白。所述p53蛋白下游靶蛋白 的编码基因的转录具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中p53蛋白下游靶蛋白的编码基 因的转录。

MPG蛋白可用于抑制p53蛋白的编码基因的表达。所述p53蛋白的编码基因的表 达具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中p53蛋白的编码基因的表达。

本发明还提供了抑制MPG蛋白编码基因表达的物质在制备与p53蛋白有关的代谢 通路的促进剂中的应用。所述与p53蛋白有关的代谢通路具体可为细胞周期。所述与 p53蛋白有关的代谢通路具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中与p53蛋白有关的代谢 通路。

本发明还提供了抑制MPG蛋白编码基因表达的物质在制备产品中的应用；所述产 品具有如下功能中的至少一种：（1）促进p53蛋白的转录活性；（2）促进与p53蛋白 有关的代谢通路；（3）促进p53蛋白下游靶蛋白的编码基因的转录；（4）促进p53蛋 白的编码基因的表达。所述靶蛋白可为周期相关蛋白，如p21蛋白、14-3-3σ蛋白或 Gadd45蛋白。所述（1）中，所述p53蛋白的转录活性具体可为MCF7细胞或HEK293 细胞中p53蛋白的转录活性。所述（2）中，所述与p53蛋白有关的代谢通路具体可为 MCF7细胞或HEK293细胞中与p53蛋白有关的代谢通路。所述（3）中，所述p53蛋白 下游靶蛋白的编码基因的转录具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中p53蛋白下游靶蛋 白的编码基因的转录。所述（4）中，所述p53蛋白的编码基因的表达具体可为MCF7 细胞或HEK293细胞中p53蛋白的编码基因的表达。

抑制MPG蛋白编码基因表达的产品可用于促进p53蛋白的转录活性。所述p53蛋 白的转录活性具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中p53蛋白的转录活性。

抑制MPG蛋白编码基因表达的产品可用于促进与p53蛋白有关的代谢通路。所述 与p53蛋白有关的代谢通路具体可为细胞周期。所述与p53蛋白有关的代谢通路具体 可为MCF7细胞或HEK293细胞中与p53蛋白有关的代谢通路。

抑制MPG蛋白编码基因表达的产品可用于促进p53蛋白下游靶蛋白的编码基因的 转录。所述靶蛋白可为周期相关蛋白，如p21蛋白、14-3-3σ蛋白或Gadd45蛋白。 所述p53蛋白下游靶蛋白的编码基因的转录具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中p53 蛋白下游靶蛋白的编码基因的转录。

抑制MPG蛋白编码基因表达的产品可用于促进p53蛋白的编码基因的表达。所述 p53蛋白的编码基因的表达具体可为MCF7细胞或HEK293细胞中p53蛋白的编码基因 的表达。

以上任一所述的MPG蛋白为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与p53蛋白的转录活性相关的由序列1衍生的蛋白质。

以上任一所述的p53蛋白为如下（c）或（d）：

（c）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（d）将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有转录活性的由序列3衍生的蛋白质。

以上任一所述的MPG蛋白编码基因为如下(1）或(2）或(3）所述的DNA分子：

（1）序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

（3）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白的 DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下 杂交并洗膜。

以上任一所述的p53蛋白的编码基因为如下(4）或(5）或(6）所述的DNA分子：

（4）序列表中序列4所示的DNA分子；

（5）在严格条件下与（4）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

（6）与（4）或（5）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白的 DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下 杂交并洗膜。

所述抑制MPG蛋白编码基因表达的产品可为如下（e）或（f）：

（e）序列表的序列5自5’末端第1至21位核苷酸所示的双链RNA分子（siRNA）；

（f）序列表的序列5所示的单链核酸分子和序列表的序列6所示的单链核酸分子 组成的双链核酸分子。

本发明发现MPG蛋白具有抑制p53蛋白编码基因表达的作用，导入MPG蛋白的编 码基因后，细胞中的p53蛋白含量降低。而p53蛋白是一种已知的重要的转录因子， 其含量降低后，转录活性相应降低，其下游的靶蛋白的含量也随之变化。本发明对于 进一步研究p53蛋白的代谢通路，人为促进或抑制p53蛋白的代谢通路具有重大意义。

附图说明

图1为实施例1的实验1的结果。

图2为实施例1的实验2的结果。

图3为实施例1的实验3的结果。

图4为实施例2的步骤一中实时定量PCR的结果。

图5为实施例2的步骤一中Western Blot的结果。

图6为实施例2的步骤二中实时定量PCR的结果。

图7为实施例2的步骤二中Western Blot的结果。

图8为实施例2的步骤三中实时定量PCR的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

MPG蛋白如序列表的序列1所示，其编码基因（MPG基因）如序列表的序列2所示。 p53蛋白如序列表的序列3所示，其编码基因（p53基因）如序列表的序列4所示。

报告基因质粒(又称pG13-Luc质粒或pG13L质粒，包含有13个串联重复序列的p53 反应原件)：公众可从中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所获得；参 考文献：Chunyan Tian,Guichun Xing,Ping Xie,Kefeng Lu,Jing Nie,Jian Wang, Li Li,Mei Gao,Lingqiang Zhang，and Fuchu He，KRAB-type zinc-finger protein  Apak specifically regulates p53-dependent apoptosis，nature cell biology  volume11，number5，MAY2009，580-591；p53蛋白是一个转录因子，它能与其下游 靶基因的保守序列结合，启动下游靶基因的表达，这段保守序列就是p53的结合原件。 pG13L质粒是一个报告基因质粒，在其启动子区上游，构建了13个串联的p53结合原件， 如果p53蛋白存在会与结合原件结合从而引发该质粒的表达，发出荧光，根据荧光强度 来判断p53的转录活性。

pCMV-Myc质粒（真核表达载体）：购自Clontech公司。

pCMV-Flag质粒：Sigma，目录号：E3762。

Myc-MPG质粒：Myc-MPG质粒是在pCMV-Myc质粒的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插 入序列表的序列2所示的MPG基因得到的重组质粒。

p53质粒：是在pCMV-Flag质粒的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间插入序列表的序 列4所示的p53基因得到的重组质粒。

pRL-TK质粒：Promega公司，产品号E2241。

Actin抗体、MPG抗体、p21抗体购自Santa Cruz公司。Myc抗体购自Clontech 公司。Gadd45抗体购自Abnova公司。14-3-3σ抗体购自NeoMarkers公司。

MCF7细胞（人乳腺癌细胞）：美国模式培养物集存库（简称ATCC； http://www.atcc.org/），编号为HTB-22。

HEK293细胞：美国模式培养物集存库（简称ATCC；http://www.atcc.org/），编 号为CRL-1573。.

p53缺失型的H1299细胞：美国模式培养物集存库（简称ATCC； http://www.atcc.org/），编号为CRL-5803

p53缺失型的HCT116细胞（又称p53-/-HCT116 cells或HCT116 p53-/-细胞）： 公众可从中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所获得；参考文献： Chunyan Tian,Guichun Xing,Ping Xie,Kefeng Lu,Jing Nie,Jian Wang,Li Li, Mei Gao,Lingqiang Zhang，and Fuchu He，KRAB-type zinc-finger protein Apak  specifically regulates p53-dependent apoptosis，nature cell biology volume 11， number 5，MAY 2009，580-591。

实施例1、MPG以剂量依赖的方式抑制内源p53转录活性

一、试验1

将MCF7细胞加入24孔板中（每孔8×10⁴个细胞/mL），培养至细胞达到70-90%融合 率后分组进行如下平行处理（每组设置三个复孔；借助购自Invitrogen的转染试剂 l ipofectamine2000并按说明书进行转染）：

第一组：每孔细胞转染100ng pG13L质粒和1ng pRL-TK质粒；

第二组：每孔细胞转染0.1微克Myc-MPG质粒、100ng pG13L质粒和1ng pRL-TK质粒；

第三组：每孔细胞转染0.2微克Myc-MPG质粒、100ng pG13L质粒和1ng pRL-TK质粒；

第四组：每孔细胞转染0.3微克Myc-MPG质粒、100ng pG13L质粒和1ng pRL-TK质粒；

转染48小时后采用双荧光素酶报告基因试剂盒（Promega，产品目录号为E1980） 检测荧光强度。以第四组细胞的荧光强度为1，计算各组细胞的相对荧光强度，即相对 p53活性。结果见图1（1至4依次代表第一组至第四组；进行三次重复试验，结果取平 均值；*,P＜0.05）。

转染48小时后提取细胞的蛋白，采用Myc抗体作为一抗进行Western Blot，结果见 图1。结果表明，MPG蛋白以剂量依赖的方式明显抑制内源p53基因的转录活性。

二、试验2

根据对MPG基因进行分析和筛选，设计用于抑制MPG基因表达的siRNA（siRNA甲） 如下：

5’-AAGAAGCAGCGACCAGCUAGATT-3’(序列表的序列5)；

3’-TTUUCUUCGUCGCUGGUCGAUCU-5’。

设计作为阴性对照的siRNA（siRNA乙）如下：

5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；

3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’。

将MCF7细胞和HEK293细胞分别进行如下RNA干扰试验：

将细胞加入24孔板中（每孔8×10⁴个细胞/mL），培养至细胞达到70-90%融合率后 分组进行如下平行处理（每组设置三个复孔；借助购自Invitrogen的转染试剂 lipofectamine2000并按说明书进行转染）：

第一组（Con）：每孔细胞转染20pmol siRNA甲、100ng pG13L质粒和1ng pRL-TK 质粒；

第二组（MPG）：每孔细胞转染20pmol siRNA乙、100ng pG13L质粒和1ng pRL-TK 质粒。

转染48小时后采用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光强度。以第二组细胞的荧 光强度为1，计算各组细胞的相对荧光强度，即相对p53活性。结果见图2（进行三次 重复试验，结果取平均值；*,P＜0.05）。

转染48小时后提取细胞的蛋白，采用MPG抗体作为一抗进行Western Blot，结 果见图2（采用Actin蛋白为内参）。

结果表明，在MCF7细胞和HEK293细胞中，利用RNA干扰抑制内源MPG基因表达 后，极大的增强了内源p53基因的转录活性。

三、试验3

将p53缺失型的H1299细胞和p53缺失型的HCT116细胞分别进行如下试验：

将细胞加入24孔板中（每孔8×10⁴个细胞/mL），培养至细胞达到70-90%融合率后 分组进行如下平行处理（每组设置三个复孔；借助购自Invitrogen的转染试剂 lipofectamine2000并按说明书进行转染）：

第一组：每孔细胞转染100ng pG13L质粒和1ng pRL-TK质粒；

第二组：每孔细胞转染50ng p53质粒、100ng pG13L质粒和1ng pRL-TK质粒；

第三组：每孔细胞转染0.1微克Myc-MPG质粒、50ng p53质粒、100ng pG13L质粒和 1ng pRL-TK质粒；

第四组：每孔细胞转染0.3微克Myc-MPG质粒、50ng p53质粒、100ng pG13L质粒和 1ng pRL-TK质粒；

第五组：每孔细胞转染0.5微克Myc-MPG质粒、50ng p53质粒、100ng pG13L质粒和 1ng pRL-TK质粒。

转染48小时后采用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光强度。以第二组细胞的荧 光强度为1，计算各组细胞的相对荧光强度，即相对p53活性。结果见图3（1至5依 次代表第一组至第五组；进行三次重复试验，结果取平均值；*,P＜0.05）。

转染48小时后提取细胞的蛋白，采用Myc抗体作为一抗进行Western Blot，结 果见图3。

结果表明，当缺乏外源p53基因时，pG13L不能被激活；转入外源p53基因后， pG13L能被有效活化，共转的MPG基因能以剂量依赖的方式抑制p53基因的活性。

实施例2、MPG特异性调控p53下游周期相关靶基因mRNA水平

一、MCF7细胞中MPG对p53下游靶基因mRNA水平的调节

将MCF7细胞加入6孔板中（每孔3×10⁵个细胞/mL），培养至细胞达到70-90%融合 率后分组进行如下平行处理（每组设置三个复孔；借助购自Invitrogen的转染试剂 lipofectamine2000并按说明书进行转染）：

第一组：每孔细胞转染2微克pCMV-Myc质粒；

第二组：每孔细胞转染2微克Myc-MPG质粒；

转染48小时后提取细胞的总RNA，并反转录为cDNA，采用实时定量PCR鉴定细胞 中MPG基因和周期相关靶基因（p21、14-3-3σ、Gadd45）的表达量（GAPDH基因作为 内参基因）。

用于鉴定MPG基因的引物对如下：

F,5’-CTTCTGCATGAACATCTCCAGC-3’；

R,5’-AGGGTGCTGCGAAGCTGACGC-3’。

用于鉴定p21基因的引物对如下：

F,5’-CACCGAGACACCACTGGAGG-3’；

R,5’-GAGAAGATCAGCCGGCGTTT-3’。

用于鉴定14-3-3σ基因的引物对如下：

F,5’-GGCCATGGACATCAGCAAGAA-3’；

R,5’-CGAAAGTGGTCTTGGCCAGAG-3’。

用于鉴定Gadd45基因的引物对如下：

F,5’-TGCGAGAACGACATCAACAT-3’；

R,5’-TCCCGGCAAAAACAAATAAG-3’。

用于鉴定GAPDH基因的引物对如下：

F,5’-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’；

R,5’-TTGAGGTCAATGAAGGGGTCA-3。

以第二组的基因表达量为1，计算各组细胞中各个基因的相对表达量，结果见图4 （进行三次重复试验，结果取平均值；*,P＜0.05）。结果表明，MPG基因过表达选 择性下调p53下游与周期相关靶基因mRNA水平。

转染24小时后提取细胞的蛋白，采用针对各个蛋白的抗体作为一抗进行Western  Blot，用灰度扫描软件进行定量分析，结果见图5（采用Actin蛋白为内参）。在MCF7 细胞中，过表达MPG基因，p21,Gadd45和14-3-3σ蛋白水平下调。

二、MCF7细胞中敲低MPG能选择性上调p53下游的周期相关靶基因和靶蛋白

将MCF7细胞加入6孔板中（每孔3×10⁵个细胞/mL），培养至细胞达到70-90%融合 率后分组进行如下平行处理（每组设置三个复孔；借助购自Invitrogen的转染试剂 lipofectamine2000并按说明书进行转染）：

第一组：每孔细胞转染100pmol siRNA甲；

第二组：每孔细胞转染100pmol siRNA乙；

转染48小时后提取细胞的总RNA，并反转录为cDNA，采用实时定量PCR鉴定细胞 中MPG基因和周期相关靶基因（p21、14-3-3σ、Gadd45）的表达量（GAPDH基因作为 内参基因）。方法同步骤一。

以第二组的基因表达量为1，计算各组细胞中各个基因的相对表达量，结果见图6 （进行三次重复试验，结果取平均值；*,P＜0.05）。结果表明，抑制MPG基因表达 能上调p53下游周期相关靶基因。

转染48小时后提取细胞的蛋白，采用针对各个蛋白的抗体作为一抗进行Western  Blot，结果见图7（采用Actin蛋白为内参）。在MCF7细胞中抑制MPG基因表达，MPG 蛋白水平的降低导致p21,Gadd45和14-3-3σ蛋白水平上调。

三、HEK293细胞中MPG对p53下游靶基因mRNA水平的调节

将HEK293细胞加入6孔板中（每孔3×10⁵个细胞/mL），培养至细胞达到70-90%融 合率后分组进行如下平行处理（每组设置三个复孔；借助购自Invitrogen的转染试剂 lipofectamine2000并按说明书进行转染）：

第一组：每孔细胞转染100pmol siRNA甲；

第二组：每孔细胞转染100pmol siRNA乙；

转染48小时后提取细胞的总RNA，并反转录为cDNA，采用实时定量PCR鉴定细胞 中MPG基因和周期相关靶基因（p21、14-3-3σ、Gadd45）的表达量（GAPDH基因作为 内参基因）。方法同步骤一。

以第二组的基因表达量为1，计算各组细胞中各个基因的相对表达量，结果见图8 （进行三次重复试验，结果取平均值；*,P＜0.05）。结果表明，抑制MPG基因表达 能上调p53下游周期相关靶基因。