与冠心病易感性关联的易感区域chr4q32的单核苷酸多态性位点及其应用

摘要

本发明公开了与疾病易感性相关联的单核苷酸多态性位点，特别涉及一种与冠心病易感性关联的易感区域chr4q32的单核苷酸多态性位点及其在评估冠心病易感性中的应用，属于生物技术领域。所述单核苷酸多态性位点是位于染色体4q32上的GUCY1A3-GUCY1B3基因区域下游的一系列单核苷酸多态性位点，为：rs2625269，rs1976041，rs1905261，rs1905262，rs2705455，rs1483041，rs2200168，rs716428，rs990619，rs1842896，rs2625245，rs1123037。根据本发明染色体4q32由一段邻近GUCY1A3-GUCY1B3基因区域下游的SNP位点以及由一系列SNP位点组成的单体型的变异特性判断冠心病易感人群的方法，可以对未出现冠心病早期临床症状的人群，尤其具有传统危险因素的冠心病高危人群，进行无创快速简便的筛查，早期发现冠心病易感对象，并采取相应的保健措施，降低冠心病与心肌梗死的发病率。

说明书

技术领域

本发明涉及与疾病易感性相关联的单核苷酸多态性位点，特别涉及一种与冠心病易感性 关联的易感区域chr4q32的单核苷酸多态性位点及其在评估冠心病易感性中的应用，属于生 物技术领域。

背景技术

动脉粥样硬化性心脑血管病已成为世界范围关注的主要健康问题。2004年的世界卫生组 织（WHO）报告显示，全世界每年心血管疾病以冠心病和脑卒中为主导致的死亡人数达高达 1720万，占所有死亡人数的三分之一。预计2020年这一数字将进一步增加50%，高达2500 万，心血管疾病是全球人类的“头号杀手”。在中国进行的一项大规模前瞻性研究也显示，心 脏疾病已经成为中国人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第1位。我国 每年新发心肌梗死50万人，随着生活方式的改变以及动脉粥样硬化相关的危险因素持续增 加，冠心病与心肌梗死发病也还将呈持续上升趋势。

大量的研究资料表明，冠心病是一种复杂疾病，是由多个微效基因与环境因素长期相互 作用所致。因此鉴定出与冠心病相关的易感基因或致病基因，在人群中进一步筛选增加疾病 风险的易感基因确定易感个体，将有助于冠心病的发病风险预测、新药开发、诊断和个体化 治疗。从基础到临床，人们对此进行了大量的研究，并在冠心病的危险因素和冠心病发生的 病理生理学方面积累了大量的知识，但是关于冠心病与心肌梗死发生的确切遗传分子机制却 知之甚少，对于怎样鉴定遗传易感基因以及鉴定受试者的冠心病遗传易感性，一直缺乏全面 系统有效的识别方法。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一系列与冠心病易感性显著相关 的单核苷酸多态性位点（SNP，single nucleotide polymorphism)），并找出其中与冠心病易 感性关联最显著的代表性位点，继而提供将所述单核苷酸多态性位点用于评估冠心病易感性 的用途。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：

第一方面，提供一系列与冠心病易感性显著相关的易感区域chr4q32的单核苷酸多态性 位点（SNP）。在中国汉族人群中选取1515例冠心病患者和5019例正常人为研究对象，使用 全基因组芯片（Affymetrix Axiom^TM Genome-Wide CHB 1 Array Plate）芯片对全基因组范围内 SNP进行基因分型。利用芯片得到的数据，评价基因型和表型的关联关系，从而得到可能与 冠心病之间存在潜在关联的区域是在染色体4q32上的GUCY1A3-GUCY1B3基因区域的下 游，与冠心病易感性显著关联的单核苷酸多态性位点是位于该区域的一系列单核苷酸多态性 位点，为：rs2625269，等位基因为A/G；rs1976041，等位基因为A/G；rs1905261，等位基因 为A/C；rs1905262，等位基因为A/T；rs2705455，等位基因为G/A；rs1483041，等位基因 为A/G；rs2200168，等位基因为C/T；rs716428，等位基因为C/T；rs990619，等位基因为 G/C；rs1842896，等位基因为G/T；rs2625245，等位基因为A/G；rs1123037，等位基因为A/T。

第二方面，使用logistic回归分析评估每个SNP位点与冠心病的关系，计算危险等位基 因的相对危险度(Odds ratio,OR)和95%的可信区间，得到这一系列SNP位点的危险等位 基因分别是：rs2625269多态性位点为A，rs1976041多态性位点为G，rs1905261多态性位点 为A，rs1905262多态性位点为A，rs2705455多态性位点为G，rs1483041多态性位点为A， rs2200168多态性位点为C，rs716428多态性位点为C，rs990619多态性位点为G，rs1842896 多态性位点为T，rs2625245多态性位点为G，rs1123037多态性位点为T。

第三方面，选择chr4q32区域代表位点rs1842896，在数据分析中使用Haploview软件计 算染色体区域位点间的连锁不平衡(Linkage disequilibrium,LD)情况。该区域rs1842896多态 性位点与rs2625269，rs1976041，rs1905261，rs1905262，rs2705455，rs1483041，rs2200168， rs716428，rs990619，rs2625245，rs1123037，具有强的连锁不平衡。同时使用FludigmEP1 基因分析系统（FludigmEP1 ^TMGENETIC ANALYSIS system），Taqman MGB探针法进行基 因分型，进一步在15460例冠心病患者和11472例对照样本中验证，合并所有16975例病例 和16491对照样本分析显示rs1842896与冠心病的关联更加显著，这一结果进一步证实了 chr4q32区域多态位点与冠心病密切相关。

第四方面，根据上述与冠心病易感性显著相关的单核苷酸多态性位点，构建单体型 （haplotype）比较其在患者和正常对照之间的频率差异，用以评估冠心病易感性。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

根据本发明染色体4q32由一段邻近GUCY1A3-GUCY1B3基因区域下游的SNP位点以及 由一系列SNP位点组成的单体型的变异特性判断冠心病易感人群的方法，可以对未出现冠心 病早期临床症状的人群，尤其具有传统危险因素的冠心病高危人群，进行无创快速简便的筛 查，早期发现冠心病易感对象，并采取相应的保健措施，降低冠心病与心肌梗死的发病率。

根据本发明也可以为研发针对性的冠心病基因治疗提供了科学依据。本发明为进一步检 测基因表达调控、蛋白功能，深入研究冠心病的致病机制，开发新型治疗药物和基因治疗， 实现基于遗传学背景的个体化诊疗奠定了重要基础，并带来重要的医学健康效益和经济效益。

附图说明

图1为实施例1中所确定的chr4q32区域SNP位点与冠心病的关联图。

图2为在实施例2的重复验证阶段的检测中，其中96个样本（94个待测样本及2个阴 性对照）的代表位点rs1842896基因分型结果聚类图；

图3为应用SNP Genotyping Analysis softgware version 3.0软件对图2所述的96个样本（94 个待测样本及2个阴性对照）的代表位点rs1842896进行基因分型的截图；

图4为图2所述的96个样本（94个待测样本及2个阴性对照）代表位点rs1842896基因 分型结果导出数据的截图。

图1中：横坐标“Position on chr”为染色体上的位置（单位Mb）；纵坐标为单核苷酸多 态性位点与冠心病的关联显著性P值（-log10(p-value))，右侧Recombination rate为重组率， 单位（CM/Mb）；代表位点rs1842896以◆表示。

图2中：X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：红色1为G/G纯 合子，绿色2为T/T纯合子，蓝色3为G/T杂合子，黑色4为阴性对照（NTC）。

其中：横坐标X：Allele为等位基因，VIC-MGB代表VIC荧光标记MGB探针；纵坐 标Y：Allele为等位基因，FAM-MGB为FAM荧光标记MGB探针；上方表示SNP位点、 call rate为这张芯片上该位点检出率、Auto Confidence为软件给出的自动判别基因型的可信 度；下方Chip Run Name为实验中采用的EP1芯片名称。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细 描述。

实施例1确定与冠心病易感性显著关联的单核苷酸多态性位点、等位基因及其危险等 位基因：

一、方法

首先在中国汉族人群中选取1515例冠心病患者和5019例正常人为研究对象。使用 Affymetrix公司的全基因组芯片（Affymetrix Axiom^TM Genome-Wide CHB 1 Array Plate）由上 海交通大学BIO-X中心检测。获得1515例冠心病患者和5019例正常人全基因组芯片SNP 的基因型数据。通过全基因组关联（GWAS）分析计算获得SNP芯片中每个位点与冠心病关 联显著性水平（P值），按照显著性水平（P值小于0.001）找出与冠心病之间存在潜在关联的 染色体区域，并得到冠心病易感性显著关联的单核苷酸多态性位点及其等位基因。统计分析 时采用plink软件进行logistic回归分析评估每个SNP位点与冠心病关联的显著性，计算危 险等位基因的相对危险度(Odds ratio,OR)和95%的可信区间，分析中直接获得OR值、可 信区间和P值，从而得到所述位点的危险等位基因。

二、病例和对照样本入选标准

冠心病病例包括心肌梗死患者和心绞痛患者，心肌梗死病例的入选诊断标准为急性心肌 梗塞诊断标准（根据WHO 1979年的诊断标准）：即典型胸痛症状持续30分钟以上；心电图 连续2个导联ST段抬高(肢体导联0.1mv，胸导联0.2mv)并有系列动态变化；心肌坏死的血 清标记物浓度升高，如肌钙蛋白（TNT/TNI）升高，心肌同工酶（CK-MB）升高大于正常值 高限的2倍。心绞痛病例的入选诊断标准为经冠脉造影发现冠状动脉至少一个主要分支狭窄 超过70%。经各项检查除外心脏瓣膜疾病、先天性心脏病、心力衰竭、严重的肾脏及肝脏疾 病、继发性高血压、心肌病、家族性高胆固醇血症及可疑冠心病患者。对照组入选标准：既 往无冠心病或其他动脉粥样硬化病史，无胸痛、胸闷等心脏病症状，心电图无明显缺血性改 变。病例组和对照组均为中国汉族人，且无血缘关系。

三、测试人群的基本特征

测试人群为芯片检测样本其基本特征如表1所示：

表1：

四、结果

通过全基因组关联（GWAS）分析发现位于染色体4q32上在GUCY1A3-GUCY1B3基因 区域下游76kb的一段紧密连锁区域内的一系列SNP位点（rs2625269，rs1976041，rs1905261， rs1905262，rs2705455，rs1483041，rs2200168，rs716428，rs990619，rs1842896，rs2625245， rs1123037）与冠心病易感性显著相关（参见图1），其与冠心病的关联结果如表2所示。

这一系列SNP位点及其等位基因是：rs2625269，等位基因为A/G；rs1976041，等位基 因为A/G；rs1905261，等位基因为A/C；rs1905262，等位基因为A/T；rs2705455，等位基 因为G/A；rs1483041，等位基因为A/G；rs2200168，等位基因为C/T；rs716428，等位基 因为C/T；rs990619，等位基因为G/C；rs1842896，等位基因为G/T；rs2625245，等位基因 为A/G；rs1123037，等位基因为A/T。其中危险等位基因分别是：rs2625269多态性位点为A， rs1976041多态性位点为G，rs1905261多态性位点为A，rs1905262多态性位点为A，rs2705455 多态性位点为G，rs1483041多态性位点为A，rs2200168多态性位点为C，rs716428多态性 位点为C，rs990619多态性位点为G，rs1842896多态性位点为T，rs2625245多态性位点为G， rs1123037多态性位点为T。（见表2）。携带这些危险等位基因的个体发生冠心病的相对风险 是没有携带者的1.22-1.24倍。其中rs1842896多态性位点T等位基因携带者的冠心病发病风 险是G等位基因的携带者的1.23倍（OR=1.23，95%CI：1.11-1.37），P值最显著（见表2）。

表2.Chr4q32区域SNP位点与冠心病的关联结果

其中“区域”，表示该多态性位点所在的染色体区带；“Risk allele”，表示风险等位基因； “Other allele”，表示参照等位基因；“基因频率”，为风险等位基因频率。“OR（95%CI）”， 表示与携带参照等位基因的个体相比，携带风险等位基因的个体发生冠心病的相对风险。染 色体位置为参照Human Genome NCBI Build36。

实施例2确定与冠心病易感性关联最显著的代表性单核苷酸多态性位点

一、方法

使用Haploview软件计算实施例1所得的染色体区域单核苷酸多态性位点间的连锁不平 衡(Linkage disequilibrium,LD)情况，用r²表示（0-1）。选择其中有强的连锁不平衡的代表性 位点，进一步在15460例冠心病患者和11472例对照样本中验证，验证的方法是使用Fludigm EP1基因分析系统（FludigmEP1 ^TMGENETIC ANALYSIS system），Taqman MGB探针法对 15460个病例和11472个对照样本进行基因分型，合并所有16975例病例和16491对照样本 的分型结果，分析其与冠心病的关联，确定与冠心病易感性关联最显著的代表性单核苷酸多 态性位点。

二、病例和对照样本入选标准

病例和对照样本入选标准与实施例1所述相同。

三、测试人群的基本特征

测试人群为重复验证样本，其基本特征如表3所示：

表3：

四、结果

与冠心病易感性关联的单核苷酸多态性位点中，rs1842896多态性位点与rs2625269， rs1976041，rs1905261，rs1905262，rs2705455，rs1483041，rs2200168，rs716428，rs990619， rs2625245，rs1123037具有强的连锁不平衡（r²>0.8,见表4）。

表4.Chr4q32区域rs1842896与同区域SNP位点连锁不平衡关系（r²）

 SNP多态位点   区域   染色体位置   r²  rs2625269   4q32.1   156699160   1.00   rs1976041   4q32.1   156705490   0.89   rs1905261   4q32.1   156721728   1.00   rs1905262   4q32.1   156721898   1.00   rs2705455   4q32.1   156722307   1.00   rs1483041   4q32.1   156722890   1.00   rs2200168   4q32.1   156723970   0.89   rs716428   4q32.1   156726319   0.89   rs990619   4q32.1   156727128   1.00   rs1842896   4q32.1   156730909   1.00   rs2625245   4q32.1   156731096   1.00   rs1123037   4q32.1   156734175   0.86

Chr4q32区域rs1842896多态性位点进一步在15460例冠心病患者和11472例对照样本中 验证，合并所有16975例病例和16491对照样本分析显示rs1842896与冠心病的关联更加显 著（P=1.26×10^-11），这一结果进一步证实了Chr4q32区域多态位点与冠心病密切相关（见表 5）。

表5.Chr4q32区域代表位点rs1842896在16975例病例和16491例对照样本中的关联结果

其中“区域”，表示该多态性位点所在的染色体区带；“Risk Allele(Freq)”，表示风险 等位基因及其基因频率。“OR（95%CI）”，表示与携带参照等位基因的个体相比，携带风险等 位基因的个体发生冠心病的相对风险。

针对重复验证阶段检测易感位点的方法：

实验平台：Fludigm EP1基因分析系统（Fludigm EP1 ^TMGENETIC ANALYSIS  system），该系统为美国芯片Fludigm公司开发的高通量基因分型系统，由集成流体管道（IFC） 芯片、集成流体管道控制器（IFC controller）、热循环系统和荧光信号采集系统（EP1 reader） 构成；采用Taqman基因分型常规试剂，可同时对96个样本96个SNP位点或48个样本48 个SNP位点进行基因分型；是一种高通量的开放式基因分析平台。Taqman MGB探针法进行 包括rs1842896在内的96个SNP位点基因分型实验。

一、仪器：Fludigm EP1（基因分析系统）

二、材料：

1.试剂、样本：

^*该引物和探针由供应商根据用户提供的检测位点而配备。ROX为一种荧光染料。

耗材：

  96.96基因分型芯片  （96.96 Dynamic Array(138X)）   96孔PCR板和一次性封板膜  （96well plates and seal(one-off)）

三、实验方法

(一)操作步骤：

1.测试液（Assay）制备：在96孔PCR板上，参照下表制备测试混合液（Assay mix）

组分 每个加样孔体积(μl) 40×Taqman Genotyping Assay  1.25 2×Assay Loading Reagent   2.5   ROX(50×)   0.25

  DNase/RNase-free water   1.0   总体积   5.0

加完后，盖上一次性封板膜，微孔板振荡器上充分混匀，微孔板离心机上2500～3000rpm （500g离心力左右）离心30秒，放置冰上备用。

2.样本（sample）制备：在96孔板PCR板中，参照下表：

加完后，盖上一次性封板膜，微孔板振荡器上充分混匀，微孔板离心机上2500～3000rpm （500g离心力左右）离心30秒左右，放置冰上备用。

3.加样及扩增过程

芯片于集成流体管道控制器HX中初始化后，加样（Assay的加样量为4.2μl/孔，Sample 的加样量为5.2μl/孔）。将加好样的芯片重新放置于集成流体管道控制器HX中，启动“Load  Mix(138X)”程序，进行分液和混合。

上述过程完成后，马上（一小时内）将芯片从集成流体管道控制器HX中取出，去掉芯 片后面蓝色的贴膜，将芯片置于热循环系统（Stand alone Thermo Cycler）中，启动Thermo  Cycler PCR仪，选取内置固化程序PROGTM96，进行PCR过程。PCR结束后，关掉PCR仪 下方真空泵（Vacuum Pump），打开PCR仪上面盖子，取下芯片。

（二）数据采集：启动荧光信号采集系统（EP1 reader），应用数据采集软件（Data Collection Software version 3）采集数据。

（三）数据分析：应用SNP Genotyping Analysis 3.0软件，根据单核苷酸多态位点不同等 位基因的荧光信号强度进行聚类分析并报告基因型。

参见图2，以X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光，根据两种荧光信号的相对 高度进行聚类，红色1为G/G纯合子，绿色2为T/T纯合子，蓝色3为GG/T杂合子,黑色4 为阴性对照（NTC）；参见图3为应用SNP Genotyping Analysis 3.0软件（Genotyping Analysis  software version 3.0）对96个样本（94个待测样本及2个阴性对照）代表位点rs1842896进行 基因分型的截图。基因分型结果以excel表格输出（参见图4）。

实施例3与冠心病易感性显著关联单核苷酸多态性位点用于评估冠心病易感性的用途

一、方法

由4q32区域rs2625269，rs1976041，rs1905261，rs1905262，rs2705455，rs1483041， rs2200168，rs716428，rs990619，rs1842896，rs2625245，rs1123037位点构建4种单体型。 根据全基因组芯片获得的1515个病例和5019个对照样本的基因型数据，分析这些SNP位点 以及由此一系列SNP位点构成的单体型在患者和正常人之间频率差异，可以得出各位点具体 碱基的变异及由其组成的单体型差异和冠心病易感性的关系。同样应用Fludigm EP1 ^TMGENETIC ANALYSIS system，TaqmanMGB探针法对待检人群进行基因分型实验，即可以 确定人群中冠心病易感人群。

二、结果

1、Chr4q32区域SNP单体型与冠心病的关联结果

上述4种单体型中，单体型AGAAGACCGTGT和GACTAGTTCGAA在人群中最为常见，频率分别为 0.76和0.194。这两个单体型与冠心病的易感性相关联，其频率在冠心病患者和正常人对照之 间存在显著性差异（见表6）。冠心病风险单体型为AGAAGACCGTGT，在冠心病病例中的频率为 0.7888，显著的高于对照组的频率0.753。

表6.Chr4q32区域SNP单体型与冠心病的关联结果

*单体型分别由rs2625269，rs1976041，rs1905261，rs1905262，rs2705455，rs1483041，rs2200168， rs716428，rs990619，rs1842896，rs2625245，rs1123037组成。其中，P值为单体型在病例对 照中频率差异的显著性水平。

2、人群中冠心病易感人群的评估

根据实施例1中表2.Chr4q32区域SNP位点与冠心病的关联结果，以及本实施例中表 6.Chr4q32区域SNP单体型与冠心病的关联结果，经用FludigmEP1^TM GENETIC ANALYSIS  system，Taqman MGB探针法测得待检人群的易感位点后，如属于以下特征之一的人群均为 冠心病的易感人群：染色体4q32区域内GUCY1A3-GUCY1B3基因区域下游76kb的rs2625269 多态性位点为A，rs1976041多态性位点为G，rs1905261多态性位点为A，rs1905262多态性 位点为A，rs2705455多态性位点为G，rs1483041多态性位点为A，rs2200168多态性位点为 C，rs716428多态性位点为C，rs990619多态性位点为G，rs1842896多态性位点为T，rs2625245 多态性位点为G，rs1123037多态性位点为T，以及由位于此基因区域下游76kb的SNP位点 rs2625269，rs1976041，rs1905261，rs1905262，rs2705455，rs1483041，rs2200168，rs716428， rs990619，rs1842896，rs2625245，rs1123037组成的单体型AGAAGACCGTGT的个体。

Chr4q32区域SNP位点序列：

如序列表中的SEQ ID NO.1所示：

rs2625269 ATCATATATGGAATAAAGGAAAATAT[A/G]GGTAAAGATTTATACAATCTCAATA

如序列表中的SEQ ID NO.2所示：

rs1976041 TACATGTGATAAATGTTGTAGGTATC[A/G]GGATGGAAAATAAAGCTATTCTCTT

如序列表中的SEQ ID NO.3所示：

rs1905261 ggaacaagttgatttcagccctgatg[A/C]atgattttgaagggttcaaggccag

如序列表中的SEQ ID NO.4所示：

rs1905262 tatgaatgagcaagaaaaggagtttc[A/T]tgagatacaatatagtcctggtgaa

如序列表中的SEQ ID NO.5所示：

rs2705455 atatgatattagataagtcacgtgtt[g/a]ccgtaatttagaatttttttacctg

如序列表中的SEQ ID NO.6所示：

rs1483041 TGTGCAGGCTGCTGTAGCAGATTGCT[A/G]TGCATAAAGGCCATTAGCTTCTAGG

如序列表中的SEQ ID NO.7所示：

rs2200168 GAGCACAGGCAGGAAACTACGTAGCA[C/T]GTCAGGCTTTTGTTTATTTAACACC

如序列表中的SEQ ID NO.8所示：

rs716428 TTTACTTGCACCCTATTATACTCTTC[C/T]AGTTTGGTTGATAAGTTATGCAATT

如序列表中的SEQ ID NO.9所示：

rs990619 AAAGGACCGATATAGAGATCGAGGAA[G/C]TTATCACGAATCGTGTATCAACCGA

如序列表中的SEQ ID NO.10所示：

rs1842896 AGTATTATTTAAAATAGCACCAAAAT[G/T]CATTCCCTTAAAAGCACTAGTTATC

如序列表中的SEQ ID NO.11所示：

rs2625245 GAAAAATTTTATCTTTGTTCAAGAAA[A/G]TTACTGAGGGATAAATATAGTGTAA

如序列表中的SEQ ID NO.12所示：

rs1123037 ATGGAGGAGAGAAGACTGGGGAAAGA[A/T]GTGACATTAAATTGGCCATGAAGTT

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之 内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。