精制海狗油及其在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用

摘要

本发明公开了一种精制海狗油，其特征在于：该精制海狗油中ω-3多不饱和脂肪酸的重量百分比含量分别为：二十碳五烯酸（C20H30O2，EPA）：4.64%-5.03%；二十二碳五烯酸（C22H34O2，DPA）：3.86%-4.18%。二十二碳六烯酸（C22H32O2，DHA）：9.5%-10.29%；本发明也公开了该精制海狗油在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。本发明的精制海狗油可以治疗非酒精性脂肪肝，也可以有效地降低血清中总胆固醇和甘油三酯。

说明书

技术领域

本发明涉及一种精制海狗油及其在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。本 发明也涉及该精制海狗油在制备降低血清中总胆固醇或甘油三酯的药物中的应用。

背景技术

海狗油（harp seal oil）俗称海豹油，是从深海高寒（-50℃）水域中的哺乳动物 海狗的脂肪层提炼加工的油。海狗是以名贵鳕鱼，三文鱼等为食，体内富集厚厚的 脂肪层，海狗油中富含ω-3多不饱和脂肪酸（EPA、DPA、DHA），加之北极无污 染洁净的自然生态环境，海狗油成为大自然中最理想的ω-3不饱和脂肪酸的重要来 源。其具有保护肝脏、调节血脂等作用在一些文献中已有报道，引起了国内外医药 领域的高度重视。

不饱和脂肪酸是一类极其重要的脂肪酸，它包括ω-3和ω-6系列，但人体不能 合成，必须通过生物途径摄取，前者来自海洋动物（鱼，海狗等），后者来自植物油 （如花生，豆油等）。经研究发现ω-3和ω-6系列必须保持合适的比例才能维持人 体正常的生理活动。WHO认为ω-3和ω-6的最佳比例为1：4，而现代饮食结构往 往导致人们的ω-3不饱和脂肪酸摄入不足，大量统计资料表明，目前人体内该比例 严重偏离至1:25，甚至1:30。据此，WHO和联合国粮农组织发表声明：鉴于产品 本身的重要性和人类普遍缺乏的现状，需要在世界范围推广ω-3系列不饱和脂肪酸。 由于海狗与人类同属哺乳动物，海狗提供的ω-3与人体的化学分子结构相同，可以 直接为人体吸收和利用，而鱼类是低级的冷血动物，它可提供的ω-3必须经过肝脏 转化后方可为人体吸收与利用。

脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变。脂肪性肝病正 严重威胁国人的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，已被公认为隐蔽性肝 硬化的常见原因。脂肪肝是一种常见的临床现象，而非一种独立的疾病。脂肪肝如 果不及时治疗，很有可能引起脂肪性肝炎、肝硬化，甚至肝癌。

目前脂肪肝的检测手段众多，但能够准确判断脂肪肝程度及逆转变化的，是 “肝/脾CT值”，属于“上腹部常规CT平扫”中的一项数据。数据显示：0.7<肝/ 脾CT值≤1则为轻度脂肪肝，0.5<肝/脾CT值≤0.7为中度脂肪肝，肝/脾CT值≤0.5 为重度脂肪肝肝/脾，CT值是目前最为准确检测脂肪肝的科学方法。

2006年4月12日授权公开的申请号为“01135517.4”的中国发明专利申请公开 了海狗油作为制备治疗脂肪肝药的应用，但是该海狗油所需要的剂量大，对于患者 来说该药物过于昂贵。

因此，尽快地开发出对于患者来说相对经济的具有有效地治疗脂肪肝，尤其是 非酒精性脂肪肝，特别是重度非酒精性脂肪肝的药物是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种较低ω-3不饱和脂肪酸含量的精制海狗油，其可以 以较低的剂量有效地治疗非酒精性脂肪肝，尤其是重度非酒精性脂肪肝。

为了达到上述目的，本发明提供了一种精制海狗油，其特征在于：该精制海 狗油中ω-3多不饱和脂肪酸的重量百分比含量分别为：

二十碳五烯酸（C₂₀H₃₀O₂，EPA）：4.64%-5.03%；

二十二碳五烯酸（C₂₂H₃₄O₂，DPA）：3.86%-4.18%；

二十二碳六烯酸（C₂₂H₃₂O₂，DHA）：9.5%-10.29%。

进一步地，本发明也提供了该精制海狗油在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中 的应用。

进一步地，本发明该精制海狗油在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用中 所述的非酒精性脂肪肝是轻度、中度或重度非酒精性脂肪肝，其中0.7<肝/脾CT值 ≤1为轻度非酒精性脂肪肝，0.5<肝/脾CT值≤0.7为中度非酒精性脂肪肝，肝/脾 CT值≤0.5为重度非酒精性脂肪肝。

进一步地，本发明该精制海狗油在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用中 所述的精制海狗油的日服用剂量为33mg/kg-111mg/kg。

进一步地，本发明该精制海狗油在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用中 所述的精制海狗油的日服用剂量为0.036ml/kg-0.121ml/kg。

本发明也提供了该精制海狗油在制备降低血清中总胆固醇或甘油三酯的药物中 的应用。

进一步地，该精制海狗油在制备降低血清中总胆固醇或甘油三酯的药物中的应 用中所述的精制海狗油的日服用剂量为33mg/kg-111mg/kg。

进一步地，该精制海狗油在制备降低血清中总胆固醇或甘油三酯的药物中的应 用中所述的精制海狗油的日服用剂量为0.036ml/kg-0.121ml/kg。

本发明的精制海狗油以较低的ω-3多不饱和脂肪酸含量和较低的日服用剂量就 可以达到治疗非酒精性脂肪肝，尤其是重度非酒精性脂肪肝的效果，也可以有效地 降低血清中总胆固醇和甘油三酯。对于企业来说对于原料的选择范围更广，可以减 少药物的生产成本，降低药物的价格，进而减轻患者的经济负担。

具体实施方式

本发明海狗油的制备方法参考本案申请人于2011年9月7日提交的申请号 201110263392.7号专利申请，该专利申请公布日是2012年2月8日。当然也可以应 用本领域已知的其它制备方法进行本发明海狗油的制备。

实施例1：精制海狗油的制备

设备：采用德国UIC公司制造的EA250/KD200单级短程分子蒸馏提取设备.

I.制备流程如下：

1.将100kg海狗动物脂肪切碎；

2.将切碎的海狗动物脂肪用40℃温度的温水清洗；

3.将切碎的海狗动物脂肪清洗后放入油水分离器中离心分离得到分离的水和脂肪 原料；

4.对步骤3中分离出的水进行过滤得到水和离心分离遗漏的脂肪原料，将离心分离 遗漏的脂肪原料加入脂肪原料中；

5.开启分子蒸馏器，当系统真空达到0.001mbar时，设定主加热器温度为310℃， 设定进料加热器温度为200℃，对脂肪原料进行脱气；

6.主加热器温度达到200℃，开始进料，进料速度80L/h；主加热器温度达到310 ℃，进料速度140L/h；

7.冷却收集蒸馏出来的精制海狗油成品。

II.二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十二碳五烯酸（DPA）含 量检测

1.检测原理

对于实施例1所制得的精制海豹油中的二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸 （DHA）和二十二碳五烯酸（DPA）含量测定，本公司采用HPLC外标测定法：将 样品中的不饱和脂肪酸进行甲酯化，成为二十碳五烯酸甲酯（EPAM）、二十二碳六 烯酸甲酯（DHAM）和二十二碳五烯酸甲酯（DPAM），采用HPLC外标测定法测 定三种不饱和脂肪酸甲酯的含量，换算出相应不饱和脂肪酸的含量。

2.色谱条件

仪器：安捷伦公司出厂的高效液相色谱仪：包括G1316A智能型柱温箱、G1314F 可变波长紫外检测器、G1311C1260四元泵（含内置脱气机）、G2170BA色谱工作 站、G1329B全自动进样器（600bar）；优谱超纯水制备机。

试剂：2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、金属钠、冰醋酸、异丙醇，均为国产分 析纯；甲醇、乙腈，均为国产色谱纯。EPA甲酯（EPAM）标准液（10mg/ml）、DHA 甲酯（DHAM）标准液（10mg/ml）、DPA甲酯（DPAM）标准液（10mg/ml），均为 Sigma公司旗下Supelco公司产品。

样品：实施例1所制得的精制海豹油。

色谱柱：Lichrospher RP-18，5um，4mm×250mm。

流动相：

乙腈：甲醇：水＝7：1：2

A泵：甲醇：水＝1：2（0.3ml/min）

B泵：乙腈（0.7ml/min）

等梯度洗脱：流速1.0ml/min

柱温：45℃

检测波长：210nm

进样量：20ul

理论塔板数：按EPAM峰计算应不低于5000

分离度：三个主成分峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.0

分析时间：45min

3.检测方法具体如下：

3.1样品衍生化：取样品精制海豹油约100mg（120ul），精密称定，置100ml 棕色容量瓶中，加入新制的0.5mol/l甲醇钠4ml，置于恒温振荡摇床30℃120r/min 不断振摇，反应约30分钟后，查看是否还有油滴，若仍存在，继续振摇，以小油 滴没有为准。向其中加入0.2ml冰醋酸终止反应，用含0.005%BHT的甲醇定容。4 ℃放置不得超过24小时。

3.2标准品溶液的制备：精密量取EPAM标准液0.1ml，DHAM标准液0.1ml、 DPAM标准液0.1ml，置于10ml棕色容量瓶中，异丙醇定容，作为混标溶液。

3.3进样：取步骤3.1制成的衍生化样品，用0.45um滤膜过滤，精密量取20ul 进样，记录色谱图；另取标准品溶液，同法测定。EPAM、DHAM、DPAM三种甲 酯的相对保留时间分别在21min、28min、38min左右。

4.结果计算

按照外标法以峰面积计算。

准确称取实施例1所制得的精制海豹油3份，分别记录称取质量m（每份约 100mg），按照上述方法进行操作，外标法以峰面积测定三种脂肪酸甲酯的含量，计 算公式如下：

上述公式对DHAM、DPAM亦适用。

对计算出的甲酯含量，尚需进行以下折算：

III.碘值

1.试验方法依据

GB/T5532-2008中华人民共和国国家标准《动植物油脂碘值的测定》。

2.试验方法

取实施例所制得的精制海豹油1.0g，置500ml干燥碘瓶中，加入环己烷和冰乙 酸等体积混合液20ml，溶解后，精密加入韦氏（Wijs）试剂25ml，密塞摇匀，在暗 处放置1个小时，加入碘化钾溶液20ml与水150ml，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液（0. 1mol/L）滴定剩余的碘，滴定时充分振摇，待混合液的棕色变为淡黄色时，加淀粉 指示液1ml，继续滴定至蓝色消失。同时做空白实验。以消耗硫代硫酸钠滴定液（0. 1mol/L）的体积（ml）为V₂，空白试验消耗的体积（ml）为V₁，样品重量（g）为 M，硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）的浓度为c（mol/l），照下式计算样品精制海豹 油的碘值：

3.测定结果的取值：

  碘值（g/100g）   结果取值到   ＜20   0.1   20-60   0.5   ＞60   1

4.相关试剂要求：

4.1碘化钾溶液（KI）：100g/L，不含碘酸盐或游离碘。

4.2淀粉溶液：将5g可溶性淀粉在30ml水中混合，加入1000ml沸水，并煮沸 3分钟，然后冷却。

4.3硫代硫酸钠标准溶液：c（Na₂S₂O₃·5H₂O）=0.1mol/L,标定后7天内使用。

4.4环己烷和冰乙酸等体积混合液。

4.5韦氏（Wijs）试剂：称取一氯化碘25g溶于1500ml冰乙酸中。配制韦氏（Wijs） 试剂的冰乙酸应不得含有还原物质，且该试剂还应做空白样的对照测定。

鉴定冰乙酸是否含有还原物质的方法：

取冰乙酸2ml，加10ml蒸馏水稀释，加入1mol/L高锰酸钾0.1ml，所呈现的颜 色应在2小时内保持不变。若红色褪去，说明有还原物质存在。

可采用市售韦氏（Wijs）试剂。

IV.酸值

1.试验方法依据

GB/T5530-2005中华人民共和国国家标准《动植物油脂酸值和酸度测定》中 热乙醇测定法。

2.试验方法

称取5.0g实施例1所制得的精制海豹油试样M（试样称重的精确度：0.02g）， 装入锥形瓶中。将含有0.5ml酚酞指示剂（10g/L，10g的酚酞溶解于1L的95%乙 醇溶液中）的50ml乙醇溶液置入锥形瓶中，加热至沸腾，当乙醇的温度高于70℃ 时，用0.1mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾溶液滴定至溶液变色，并保持溶液15s不褪 色，即为终点。

将中和后乙醇转移至装有测试样品的锥形瓶中，充分混合，煮沸。用氢氧化钠 或氢氧化钾标准溶液滴定，滴定过程要不断振摇，至溶液颜色发生变化，并且保持 15s不褪色，即为滴定终点。

3.结果计算

酸值（S）（mg/g）按下式计算：

$S=\frac{56.1\times V\times C}{M}$

式中：

V：所用氢氧化钾标准溶液的体积，ml；

C：所用氢氧化钾标准溶液的准确浓度，mol/L；

M：试样的质量，g。

Ⅴ.过氧化值

1.试验方法依据

GB/T5538-2005中华人民共和国国家标准《动植物油脂过氧化值测定》。

2.试验方法

用纯净干燥的二氧化碳或氮气冲洗碘量瓶，精密称取实施例1所制得的海豹油 样品（M）5.0g（称量精确度：±0.01g），置于上述碘量瓶中，加入50ml乙酸-异辛 烷溶液，盖上塞子摇动至样品溶解。加入0.5ml饱和碘化钾溶液，盖上塞子使其反 应，时间为1min±1s，在此期间摇动碘量瓶至少3次，然后立即加入30ml蒸馏水。 用硫代硫酸钠溶液（C:0.01mol/L）滴定上述溶液，直到黄色几乎消失，添加约0.5ml 淀粉溶液，继续滴定，至蓝色消失，即为终点。记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积V2。 同时做空白对照，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积V1。

当空白实验消耗硫代硫酸钠溶液（0.01mol/L）超过0.1ml，应更换硫代硫酸钠 溶液（0.01mol/L），重新对样品进行测定。

3.结果计算

过氧化值P按下式计算：

$P=\frac{1000(V2-V1)}{2M}$

V1：用于空白的硫代硫酸钠溶液消耗体积，ml；

V2：用于样品测定的硫代硫酸钠溶液消耗体积，ml；

C：硫代硫酸钠溶液的浓度，mol/L；

M：试样的质量，g；

P：过氧化值，以毫摩尔每千克表示，mmol/kg。

4.所需试剂要求

4.1冰乙酸与异辛烷混合液（6：4）：冰乙酸和异辛烷均用纯净、干燥的惰性气体（二 氧化碳或氮气）气流清除氧。

4.2碘化钾饱和溶液：新配制且不得含有游离碘和碘酸盐。确保溶液中有结晶存在， 存放于避光处。如果在30ml乙酸-异辛烷溶液中添加0.5ml碘化钾饱和溶液和2滴 淀粉溶液，出现蓝色，并需要硫代硫酸钠溶液（0.01mol/L）1滴以上才能消除，则 重新配制此溶液。

4.3硫代硫酸钠溶液（0.01mol/L）：先配制硫代硫酸钠溶液（0.1mol/L）。称取21.9g 五水硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）溶解于蒸馏水中，稀释至1L。临用前标定， 稀释10，制得硫代硫酸钠溶液（0.01mol/L）。

4.4淀粉溶液（5g/L）：将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合，在搅拌的情况下溶 于200ml沸水中，添加250ml水杨酸作为防腐剂并煮沸3min，立即从热源上取下并 冷却。此溶液在4℃冰箱可储藏2-3周，当滴定终点从蓝色到无色不明显时，需重 新配制。

灵敏度验证方法：将5ml淀粉溶液中加入100ml水中，添加0.05%碘化钾溶液和1 滴0.05%次氯酸钠溶液，当滴入硫代硫酸钠溶液（0.1mol/L）0.05ml以上时，深蓝 色消失，即表示灵敏度不够。

实施例1所制得的精制海狗油样品的检测结果是：

实施例2：精制海狗油的制备

设备：采用德国UIC公司制造的EA250/KD200单级短程分子蒸馏提取设备.

制备流程如下：

1.将100kg海狗动物脂肪切碎；

2.将切碎的海狗动物脂肪用45℃温度的温水清洗；

3.将切碎的海狗动物脂肪清洗后放入油水分离器中离心分离得到分离的水和脂肪 原料；

4.对步骤3中分离出的水进行过滤得到水和离心分离遗漏的脂肪原料，将离心分离 遗漏的脂肪原料加入脂肪原料中；

5.开启分子蒸馏器，当系统真空达到0.003mbar时，设定主加热器温度为320℃， 设定进料加热器温度为220℃，对脂肪原料进行脱气；

6.主加热器温度达到200℃，开始进料，进料速度90L/h；主加热器温度达到320 ℃，进料速度160L/h；

7.冷却收集蒸馏出来的精制海狗油成品。

如实施例1所述对实施例2所制得的精制海狗油样品进行含量检测、碘值和酸 值测定。

实施例2所制得的精制海狗油样品的检测结果是：

实施例3：精制海狗油的制备

设备：采用德国UIC公司制造的EA250/KD200单级短程分子蒸馏提取设备.

制备流程如下：

8.将100kg海狗动物脂肪切碎；

9.将切碎的海狗动物脂肪用45℃温度的温水清洗；

10.将切碎的海狗动物脂肪清洗后放入油水分离器中离心分离得到分离的水和脂肪 原料；

11.对步骤3中分离出的水进行过滤得到水和离心分离遗漏的脂肪原料，将离心分离 遗漏的脂肪原料加入脂肪原料中；

12.开启分子蒸馏器，当系统真空达到0.002mbar时，设定主加热器温度为315℃， 设定进料加热器温度为210℃，对脂肪原料进行脱气；

13.主加热器温度达到200℃，开始进料，进料速度85L/h；主加热器温度达到315 ℃，进料速度150L/h；

14.冷却收集蒸馏出来的精制海狗油成品。

如实施例1所述对实施例3所制得的精制海狗油样品进行含量检测、碘值和酸 值测定。

实施例3所制得的精制海狗油样品的检测结果是：

实验1：实施例1所制得的精制海狗油的临床试验如下：

1、试验目的

验证本发明治疗非酒精性脂肪肝的有效性。

2、试验设计

2.1试验总体设计及方案的描述

遵循GCP原则，采用随机、双盲、多中心、海狗油与安慰剂的平行对照研究。 研究对象为非酒精性脂肪肝患者，可评价病例总数为400例。受试者将按照3:1的 比例随机分到海狗油组和安慰剂组。

2.2试验设计及对照组选择的考虑

目前没有治疗脂肪肝的药物上市，因此采用安慰剂作对照。

2.3研究对象的选择

2.3.1诊断标准

参照2006年2月中华肝脏病学会脂肪肝和酒精性肝病学组修订的非酒精性脂肪 性肝病诊疗指南：

凡具备下列第1~5项和第6项或第7项中任何一项者即可诊断为非酒精性脂肪 肝。

1）无饮酒史或饮酒折合乙醇量男性每周<140g，女性每周<70g；

2）除外病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性等可导致脂肪 肝的特定疾病；

3）除原发疾病临床表现外，可有乏力、消化不良、肝区隐痛、肝脾肿大等非特 异性症状及体征；

4）可有体重超重和（或）内脏性肥胖、空腹血糖增高、血脂紊乱、高血压等代 谢综合征相关组分；

5）血清转氨酶和γ－谷氨酰转肽酶水平可有轻至中度增高（小于5倍正常值上 限），通常以丙氨酸氨基转移酶（ALT）增高为主；

6）肝脏影像学表现符合弥漫性脂肪肝的影像学诊断标准；

7）肝活体组织学改变符合脂肪肝病的病理学诊断标准。

2.3.2入选标准

1）签署知情同意书者；

2）年龄18~65岁的男性或女性；

3）临床诊断符合非酒精性脂肪性诊断标准；

4）肝/脾CT比值≤1；

5）TG＞正常上限；

6）近4周内未使用治疗脂肪肝的药物（包括保肝降酶或降脂作用的药物）；

7）育龄期妇女必须有有效的避孕措施。

2.3.3排除标准

1）糖尿病患者及空腹血糖大于7.0者；

2）病毒性肝炎、药物、酒精、自身免疫、Wilson病、全胃肠外营养等因素所 致肝病；

3）合并心、肾、肺、内分泌、血液、代谢及消化系严重原发病者，或精神病患 者；

4）谷丙转氨酶（ALT）≥10倍；

5）GGT＞5倍正常上限；

6）血清总胆红素（TBIL）＞1.5倍正常上限；

7）血清白蛋白（ALB）＜33g/L；

8）肌酐（Cr）＞130umol/L；

9）血小板计数（PLT）＜80109/L；

10）3个月内进行任何方式减肥者；

11）3个月内参加其它临床试验者；

12）孕妇，哺乳期妇女或应用雌激素避孕者；

13）酗酒者或药瘾者；

14）已知对试验药品过敏者。

2.3.4剔除标准

1）不符合入选、排除标准的病例；

2）受试者依从性差，未按方案要求服药者（大于120%或者小于80%）；

3）试验期间应用了可能影响本研究疗效评价的其他药物者。

2.4试验过程

2.4.1试验药

实施例1所制得的海狗油ω-3多不饱和脂肪酸，含18%的ω-3多不饱和脂肪酸。

2.4.2安慰剂

橄榄油，市购得到。含油酸53%，符合安慰剂制备要求。

2.4.3用药方法

每日两次，每次0.018ml/kg，饮食对试验药没有影响，故对服药的时间没有要 求。

3、疗效/效应的分析

3.1主要疗效指标

肝/脾CT比值：

FAS人群，试验组324例，对照组104例。试验组：基线期肝/脾CT比值中位数为 0.802(0.110~1.000)，平均值为0.748±0.194；治疗24周时肝/脾CT比值中位数为 0.832(0.016~1.287)，平均值为0.794±0.220；治疗前后变化值（后－前）平均值为0.046 ±0.167，95%CI为0.028~0.064。对照组：基线期肝/脾CT比值中位数为 0.795(0.162~0.985)，平均值为0.750±0.194；治疗24周时肝/脾CT比值中位数为 0.810(0.029~1.212)，平均值为0.772±0.237；治疗前后变化值（后－前）平均值为0.023 ±0.188，95%CI为-0.014~0.059。治疗后试验组肝/脾CT比值明显升高，具有非常显 著的统计学意义，P=0.0000（＜0.01，表2，且协方差分析95%可信区间为95%CI为 0.028～0.064（表1），不包含0，进一步提示服用本发明实施例1所制得的海狗油可以 升高肝/脾CT比值，且有95%的把握度提升幅度在0.028～0.064之间，具有临床实际意 义。说明服用本发明实施例1所制得的海狗油临床上可以明显升高肝/脾CT比值，减 轻肝脏脂肪沉积。对照组组内比较具有统计学意义，P=0.0399（＜0.05，表2），但 协方差分析95%CI为-0.014～0.059（表1），包含0，提示服用安慰剂95%的把握度肝 /脾CT比变化值会落在-0.014～0.059之间，在临床上对于提升肝/脾CT比值没有实际意 义。两组治疗前后肝/脾CT比值升高平均值试验组高于对照组，但组间比较P=0.9415 （表2），差异不具有统计学意义。

PPS人群，试验组294例，对照组92例。试验组基线期肝/脾CT比值中位数为 0.804(0.110~1.000)，平均值为0.749±0.193；治疗24周时肝/脾CT比值中位数为 0.835(0.016~1.287)，平均值为0.798±0.220；治疗前后变化值（后－前）平均值为0.049 ±0.171，95%CI为0.029~0.068。对照组基线期肝/脾CT比值中位数为 0.812(0.162~0.985)，平均值为0.757±0.194；治疗24周时肝/脾CT比值中位数为 0.816(0.029~1.212)，平均值为0.781±0.242；治疗前后变化值（后－前）平均值为0.024 ±0.200，95%CI为-0.017~0.066。治疗前后受试者肝/脾CT比值试验组有明显升高， 组内比较P＝0.0000（＜0.01，具有非常显著的统计学意义，且协方差分析95%可信区 间为95%CI为0.029～0.068，不包含0，进一步证实服用本发明实施例1所制得的海狗 油临床上可以明显升高肝/脾CT比值，减轻肝脏脂肪沉积。对照组升高不明显，组 内比较P＝0.0542，无统计学意义，且95%CI为-0.017～0.066，包含0，不具有临床意 义。两组比较，肝/脾CT比值升高值的平均值试验组略高于对照组，但P=0.9454，差 异不具有统计学意义。

亚组分析：

本研究对治疗前诊断为重度非酒精性脂肪肝的病例肝/脾CT比值进行了亚组分 析，FAS分析集中重度脂肪肝试验组42例，对照组15例。试验组基线期肝/脾CT比值 中位数为0.406(0.110~0.500)，平均值为0.376±0.111；治疗24周时肝/脾CT比值中位 数为0.475(0.016~1.283)，平均值为0.504±0.247；治疗前后变化值（后－前）平均值 为0.128±0.226，95%CI为0.058～0.199。对照组基线期肝/脾CT比值中位数为 0.406(0.162~0.498)，平均值为0.391±0.094；治疗24周时肝/脾CT比值中位数为 0.477(0.029~0.842)，平均值为0.474±0.231；治疗前后变化值（后－前）平均值为0.083 ±0.196，95%CI为-0.025~0.192。治疗后试验组明显升高，并具有非常显著的统计学 意义，p=0.0004（＜0.01，表4，且协方差分析95%可信区间为95%CI为0.058～0.199 （表3），不包含0，进一步表明该升高具有临床意义，提示服用本发明实施例1所制 得的海狗油临床上可以明显升高重度非酒精性脂肪肝患者的肝/脾CT比值，减轻肝 脏脂肪沉积。对照组治疗前后比较P=0.2439（表4），协方差分析95%CI为-0.025～0.192 （表3），包含0，提示服用安慰剂对于升高肝/脾CT比值既不具有统计学意义，也没 有临床实际意义。两组治疗前后肝/脾CT比值升高平均值试验组高于对照组，但组 间比较P=0.6562（表4），差异不具有统计学意义。PPS分析与FAS分析一致。

表1治疗前后受试者肝/脾CT比值的变化情况

表2治疗前后受试者肝/脾CT比值变化情况的比较

变化值的组内比较采用符合秩和检验，统计量为S；组间比较用Wilcoxon秩和检验， 统计量为Z。

表3治疗前重度脂肪肝的病例治疗前后受试者肝/脾CT比值的变化情况

表4治疗前重度脂肪肝的病例治疗前后受试者肝/脾CT比值变化情况的比较

变化值的组内比较采用符合秩和检验，统计量为S；组间比较用Wilcoxon秩和检验， 统计量为Z。

4.血脂：

总胆固醇：

FAS分析集中，试验组：基线期TC含量中位数为5.35(2.70~11.07)mmol/L，平 均为5.40±1.12mmol/L。治疗后第12周TC含量中位数为5.10(2.45~12.50)mmol/L， 平均为5.16±1.07mmol/L，差值（前－后）TC含量中位数为0.19(-2.46~4.80)mmol/L， 平均为0.22±0.97mmol/L，95%CI为0.110~0.333。治疗后第24周TC含量中位数 为5.20(2.40~12.15)mmol/L，平均为5.27±1.18mmol/L，差值（前－后）TC含量中 位数为0.03(-6.47~5.58)mmol/L，平均为0.13±1.11mmol/L，95%CI为0.002~0.257。 参见表5.。

对照组：基线期TC含量中位数为5.33(2.84～11.49)mmol/L，平均为5.35±1.09 mmol/L。治疗后第12周TC含量中位数为5.00(2.91~7.90)mmol/L，平均为5.16± 1.12mmol/L，差值（前－后）TC含量中位数为0.20(-2.41~4.02)mmol/L，平均为0.20 ±0.98mmol/L，95%CI为-0.006～0.409。治疗后第24周TC含量中位数为 5.20(2.99~8.03)mmol/L，平均为5.27±1.09mmol/L，差值（前－后）TC含量中位 数为-0.08(-1.62~3.76)mmol/L，平均为0.07±0.94mmol/L，95%CI为-0.126~0.268， 表5。

组内比较，试验组：治疗12周时TC含量较基线明显下降，且具有非常显著统 计学意义，P=0.0006（小于0.01），另外，12周时TC含量前后差值的95%CI为 0.110～0.333，不包含0，同样表明试验组TC出现具有临床意义的下降。治疗24周 时TC含量平均值与基线相比，仍有较大幅度下降，虽然未呈现统计学意义改变 （P=0.0515），但24周时TC含量前后差值的95%CI为0.002～0.257，不包含0，同 样表明试验组24周时TC出现具有临床意义的下降。对照组：治疗12周时TC含 量较基线有所下降，且具有统计学意义（P=0.0269），但12周时TC含量前后差值 的95%CI为-0.006～0.409，包含0，所以该下降并不具有临床意义。治疗24周时TC 含量平均值与基线相比无明显变化，且不具有统计学意义（P=0.8807），24周时TC 含量前后差值的95%CI为-0.126～0.268，包含0，同样也不具有临床意义。详见表7。

组间比较，治疗第12周和第24周，TC平均值下降幅度试验组均大于对照组， 但组间差异均未呈现出统计学意义。详见表7。

PPS分析集与FAS分析结果一致，详见表5和表6.。

甘油三酯TG：

FAS人群中，试验组：基线期TG含量中位数为2.50(0.86~28.54)mmol/L，平均 值为3.41±2.79mmol/L，治疗后第12周TG含量中位数为2.15(0.30~25.33)mmol/L， 平均值为2.81±2.40mmol/L，差值（前－后）中位数为0.40(-8.62~24.31)mmol/L， 平均值为0.60±2.49mmol/L，95%CI为0.317～0.890。治疗第24周TG含量中位数 为2.23(0.49~27.77)mmol/L，平均值为2.72±2.16mmol/L，差值（前-后）中位数 为0.34(-9.44~23.19)mmol/L，平均值为0.69±2.49mmol/L，95%CI为0.400～0.973 （表8）。

对照组：基线期TG含量中位数为2.53(1.64~25.37)mmol/L，平均值为3.26±2.89 mmol/L，治疗后第12周TG含量中位数为2.38(0.80～18.28)mmol/L，平均值为3.48 ±3.39mmol/L，差值（前－后）中位数为0.17(-16.54~8.43)mmol/L，平均值为-0.30 ±2.57mmol/L，95%CI为-0.840～0.242。治疗第24周TG含量中位数为 2.19(0.98~18.39)mmol/L，平均值为2.92±2.45mmol/L，差值（前－后）中位数为 0.19(-4.45~8.95)mmol/L，平均值为0.24±1.63mmol/L，95%CI为-0.105～0.577（表 8）。

组内比较，治疗12周和24周时试验组较治疗前TG含量均出现明显的降低， 并具有非常显著的统计学意义，P=0.0000（＜0.01，且12周时TG含量前后差值的 95%CI为0.317~0.890，24周时TG含量前后差值的95%CI为0.400~0.973，均不包 含0，说明服用海狗油后TG下降不但具有统计学意义，并且在临床上具有实际意 义；对照组治疗12周和24周时与治疗前相比，均没有明显变化，且不具有统计学 意义P＞0.05（表10），12周时TG含量前后差值的95%CI为-0.840~0.242，24周时 TG含量前后差值的95%CI为-0.105~0.577，均包含0，说明服用安慰剂后TG下降 在临床上不具有实际意义。（表10）

组间比较，治疗第12周时，试验组TG下降值明显高于对照组，且具有显著统 计学意义，P＝0.0081（＜0.01。治疗24周时，试验组TG下降值仍然高于对照组， 但并未呈现出具有统计学意义的差异，P＝0.0517（＞0.05）。（表10）

PPS分析结果与FAS一致，详见表8和表9。

表5各组治疗前后总胆固醇TC(mmol/L)的变化情况（FAS）

表6各组治疗前后总胆固醇TC(mmol/L)的变化情况（PPS）

表7各组治疗前后总胆固醇TC(mmol/L)变化情况的比较

差值的组内比较采用配对t检验，组间比较采用团体t检验，统计量均为t。

表8各组治疗前后甘油三酯TG(mmol/L)的变化情况（FAS）

表9各组治疗前后甘油三酯TG(mmol/L)的变化情况（PPS）

表10各组治疗前后甘油三酯TG(mmol/L)变化情况的比较

差值的组内比较采用配对t检验，组间比较采用团体t检验，统计量均为t。

5.临床实验的有效性小结

本研究FAS和PPS分析结果均一致。

肝/脾CT比值：FAS人群24周时，试验组和对照组肝/脾CT比值平均值分别为 0.794±0.220和0.750±0.194，治疗前后变化值（后－前）平均值分别为0.046±0.167 和0.023±0.188，试验组升高幅度大于安慰剂组。试验组治疗前后比较具有非常显著 的统计学意义，P=0.0000（＜0.01），且差值95%CI为0.028～0.064，不包含0，进一步 提示服用海狗油可以升高肝/脾CT比值，且有95%的把握度提升幅度在0.028～0.064 之间，具有临床实际意义。对照组治疗前后比较P=0.0399（＜0.05），具有统计学意 义，但95%CI为-0.014~0.059，包含0，提示服用安慰剂95%的把握度肝/脾CT比变化 值会落在-0.014~0.059之间，在临床上对于提升肝/脾CT比值没有实际意义。

重度脂肪肝亚组病例分析：FAS分析集中重度脂肪肝试验组42例，对照组15例。 治疗24周时试验组和对照组肝/脾CT比值平均值分别为0.504±0.247和0.474± 0.231，治疗前后差（后－前）平均值分别为0.128±0.226和0.083±0.196，试验组升 高幅度大于安慰剂组。试验组治疗前后比较P=0.0004（＜0.01），具有非常显著的统 计学意义，95%CI为0.058～0.199，不包含0，提示服用海狗油可以升高重度脂肪肝患 者肝/脾CT比值，且有95%的把握度提升幅度在0.058~0.199之间，具有临床实际意义。 对照组治疗前后较P=0.2439，不具有统计学意义，95%CI为-0.025～0.192，包含0， 提示服用安慰剂95%的把握度肝/脾CT比变化值会落在-0.025～0.192之间，在临床上 对于提升肝/脾CT比值没有实际意义。

总胆固醇含量：试验组治疗12周时TC含量较基线明显下降，且具有非常显著统 计学意义，P=0.0006（小于0.01），差值的95%CI为0.110～0.333，不包含0，同样表 明试验组TC出现具有临床意义的下降。24周时TC含量继续较大幅度下降，虽然未 呈现统计学意义改变（P=0.0515），但差值的95%CI为0.002～0.257，不包含0，同样 表明试验组24周时TC下降具有临床意义。对照组，12周TC含量前后差值的95%CI 为-0.006～0.409，包含0，变化不具有临床意义。24周95%CI为-0.126～0.268，包含0， 同样不具有临床意义。

甘油三酯含量：试验组TG治疗12周和24周时均出现明显的降低，P=0.0000 （＜0.01，且差值的95%CI分别为0.317～0.890和0.400~0.973，均不包含0，说明 服用海狗油后TG下降不但具有非常显著的统计学意义，并且在临床上具有实际意 义；对照组治疗12周和24周时TG均没有明显变化，P＞0.05，差值的95%CI分 别为-0.840～0.242和-0.105~0.577，均包含0，提示服用安慰剂TG下降即不具有统 计学意义，在临床上也不具有实际意义。组间比较，第12周时，TG下降值试验组 明显高于对照组，且具有非常显著统计学意义。

综上所述：

本发明对改善非酒精性脂肪肝的肝/脾CT比值及降低血脂具有显著的临床意义， 尤其对重症脂肪肝患者呈现出较好的临床疗效。

本发明对降低血清中总胆固醇和甘油三酯含量具有临床意义。

实验2：实施例1所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施2与实验1临床试验相同，不同的是下列一项： 2.4.3用药方法

每日两次，每次0.0605ml/kg，饮食对试验药没有影响，故对服药的时间没有要 求。

实验2所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验3：实施例1所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施3与实验1临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.3用药方法

每日两次，每次16.5mg/kg，饮食对试验药没有影响，故对服药的时间没有要 求。

实验3所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验4：实施例1所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施4与实验1临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.3用药方法

每日两次，每次55.5mg/kg，饮食对试验药没有影响，故对服药的时间没有要 求。

实验4所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验5：实施例2所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施5与实验1临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.1试验药

实施例2所制得的精制海狗油，含19.5%的ω-3多不饱和脂肪酸。

实验5所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验6：实施例2所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施6与实验2临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.1试验药

实施例2所制得的精制海狗油，含19.5%的ω-3多不饱和脂肪酸。

实验6所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验7：实施例2所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施7与实验3临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.1试验药

实施例2所制得的精制海狗油，含19.5%的ω-3多不饱和脂肪酸。

实验7所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验8：实施例2所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施8与实验4临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.1试验药

实施例2所制得的精制海狗油，含19.5%的ω-3多不饱和脂肪酸。

实验8所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验9：实施例3所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施9与实验1临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.1试验药

实施例3所制得的精制海狗油，含18.76%的ω-3多不饱和脂肪酸。

实验9所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验10：实施例3所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施10与实验2临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.1试验药

实施例3所制得的精制海狗油，含18.76%的ω-3多不饱和脂肪酸。

实验10所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验11：实施例3所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施11与实验3临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.1试验药

实施例3所制得的精制海狗油，含18.76%的ω-3多不饱和脂肪酸。

实验11所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。

实验12：实施例3所制得的精制海狗油的临床试验如下：

实施12与实验4临床试验相同，不同的是下列一项：

2.4.1试验药

实施例3所制得的精制海狗油，含18.76%的ω-3多不饱和脂肪酸。

实验12所获得的临床结果与实验1所获得的结果相似。