用于腹膜透析的支化的可溶性葡萄糖聚合物

摘要

本发明涉及支化的可溶性葡萄糖聚合物，这些聚合物是由以下淀粉制备，即：具有的直链淀粉含量为至少30wt％、优选为35wt％至80wt％，这些聚合物具有的α-1，6糖苷键含量为7％至10％、优选为8％至9％，并且Mw为50,000至150,000道尔顿，其特征在于所述聚合物对胰脏α淀粉酶具有抗性，该抗性根据测试“B”表达为：还原糖含量25％至35％，并且多种所释放产物的MW为6,000至12,000道尔顿。

说明书

技术领域

本发明涉及支化的可溶性葡萄糖聚合物，这些聚合物具有的α-1，6 糖苷键含量为介于7％与10％之间、优选介于8％与9％之间，窄重均 分子量(Mw)分布为介于50,000与150,000道尔顿之间。

这些支化的可溶性葡萄糖聚合物还对α淀粉酶具有某种抗性并且 具有小于100mOsm/kg的低重量克分子渗透浓度。

基于本发明的目的，表述“对α淀粉酶的某种抗性”旨在表示这些 支化的可溶性葡萄糖聚合物具有的能力，即：该聚合物是相对非血糖 的，并且能够延长在特别地含有α淀粉酶的介质中其渗透力的持续时 间(模拟腹膜内的产物水解)，从而允许这些聚合物特别地用在腹膜 透析应用中，以获得长效的治疗。

本发明还涉及可溶的支化葡萄糖聚合物，这些聚合物具有一个完 全特殊的支链长度分布特征。

基于本发明的目的，术语“支链长度分布特征”旨在表示通过α-1，6 支化点连接到其他α-1，4线性糖苷链上的α-1，4线性糖苷链的尺寸分 布，该尺寸分布被表达为聚合度(或DP)。

本发明还涉及包含这类支化的可溶性葡萄糖聚合物的组合物，这 些组合物可以用于许多工业应用，特别是用于制药工业，并且尤其是 腹膜透析中。

最后，本发明涉及一种用于生产所述支化的可溶性葡萄糖聚合物 的方法，并且还涉及一种用于纯化所述聚合物的方法，从而使这些聚 合物更加特别适合用于生产腹膜透析液。

背景技术

工业上常规生产的葡萄糖聚合物是通过天然或杂化淀粉及其衍生 物的水解而制备的。

因此，这些淀粉水解物是通过来自谷类或来自块茎类植物的淀粉 的酸水解或酶水解而产生。这些淀粉水解物实际上是葡萄糖与多种葡 萄糖聚合物的一种混合物，具有非常不同的分子量。

这些工业上生产的淀粉水解物(糊精类、麦芽糊精类等)具有某 种平均聚合度或DP，包含一个宽分布的糖类，这些糖类含有线性结 构(α-1，4糖苷键)以及支化结构(α-1，6糖苷键)两者。

这些淀粉水解物、尤其是麦芽糊精类，一般用作一种转运体或增 量剂、用作一种调质剂、用作一种喷雾干燥载体、用作一种脂肪替代 品、用作一种成膜剂、用作一种冻结调节剂、用作一种抗结晶剂，或 用作一种营养源。

本领域普通技术人员都知道，麦芽糊精类的糖类成分决定了其物 理特性和其生物特性。

因此，这些淀粉水解物的吸湿性、可发酵性、粘度、甜性、稳定 性、胶凝性、以及重量克分子渗透浓度是根据使用它们的不同领域在 常规上进行评定和选择的标准。

因此，对这些糖类的理化特性的基本认知引起将它们并入到例如 腹膜透析液中。

腹膜透析包括利用一个导液管将一种透析液引入腹膜腔内。

在一段时间后，在血液与该透析液之间发生溶质交换。

使用一种适当的渗透剂使之有可能将血液中多余的水分排到该透 析液中，并因此克服肾虚。

用以从身体中去除多余的水分(超滤作用)以及溶质的腹膜透析 的常规方法包括：通过添加葡萄糖作为一种渗透剂，向腹膜腔注射一 种透析液，该透析液相对血液来说是高渗的。

穿过一个理想的半透膜的流动主要由该溶液中存在的溶质颗粒的 总数(重量克分子渗透浓度)决定，而与这些溶质颗粒的大小无关。

另一方面，在一种生物膜如腹膜的情况下，该流动只取决于未穿 过或少量穿过该膜的溶质，并且因此和该溶液的总的重量克分子渗透 浓度没有必然联系。

此外，这些溶质穿过该膜的能力还取决于分子的形状、它们的离 子电荷以及它们的大小。

选择一种理想的渗透剂是困难的：所述试剂必须能够具有一个渗 透梯度，以便将血液中的水分以及有毒物质透过腹膜而移入该透析液 中。

该渗透剂还必须是无毒并且是生物惰性的，同时还可被身体代 谢，其一部分可在血液中被吸收。

该渗透剂不应过快地穿过腹膜，以此方式来维持一个长期的超滤 梯度，并且不会使不希望的非降解性物质在血液中堆积。

专利EP 207 676因此示教到：为了用于连续的流动式腹膜透析， 应优选使用在水中形成10％的澄清且无色溶液的淀粉水解物，这些淀 粉水解物具有从5,000至100,000道尔顿的Mw以及一个低多分散指 数或PI。

这导致形成多种组合物，这些组合物主要含有介于5,000和 50,000道尔顿之间的高分子量葡萄糖聚合物，这些聚合物不含有或含 有非常少的、DP小于或等于3的葡萄糖或低聚糖类；并且这些组合 物不含有或含有非常少的、Mw大于100,000道尔顿的葡萄糖聚合 物。

事实上，针对这一应用，快速穿过腹膜壁的低分子量单体类或聚 合物类对于创建一个长期的渗透压梯度毫无益处，此外，分子量非常 高(大于100,000道尔顿)并且毫无渗透力的聚合物类应当被避免、 甚至禁止，因为这些聚合物具有在身体中回生并沉淀的危险。

在专利EP667 356中，申请公司已经提出了一种从蜡质淀粉生产 淀粉水解物的方法，该淀粉水解物在水中完全可溶，并且具有的低多 分散指数小于2.8，具有的Mw介于8,000至22,500道尔顿之间。

该方法包括使仅由支链淀粉组成的一种淀粉乳进行酸水解，然后 利用使用细菌α淀粉酶的一个酶水解来使该酸水解物进一步水解，并 且在碱金属或碱土金属形式中的大孔强阳离子树脂上对该水解物进行 色谱分析。

这一特别的淀粉水解物，又称为艾考糊精，具有的Mw为从 21,000至22,000道尔顿，该Mw是通过光散射测定的，测定将在下文 中描述。

艾考糊精的葡萄糖分子中大多数是α-1，4连接的线性链(多于 90％)，而一小部分是α-1，6支化的α-1，4链(少于10％)。

艾考糊精已经使得对葡萄糖的日常吸收显著下降，该葡萄糖先前 在多种透析液中用作一种渗透剂。由此为治疗糖尿病和/或肥胖患者提 供了一个切实的优势，对这些患者来说卡路里含量是一个决定性的因 素。

含有艾考糊精作为渗透剂的腹膜透析液(尤其是百特医疗用品公 司(Baxter Healthcare Corp.)销售的商标为Extraneal的腹膜透析 液)一般被用于长期的日常交换(夜间用于流动式连续腹膜透析，日 间用于自动化腹膜透析)。

然而，如果存在一种渗透剂产生较少的血糖，并且该渗透剂的渗 透力持续时间较长，那么可以进一步改良该艾考糊精，从而使透析治 疗过程显著简化。

事实上，由于透析液的产率可以得到提高，透析袋的更换频率将 会降低，这将会明确地改善患者的生活质量。

因此，腹膜透析中的理想碳水化合物应该：

是可溶于水的，

具有一个低粘度，

不逆行，

诱导体循环中的低葡萄糖外观动力学，

被缓慢水解，但应在该水解结束时被体内的酶完全降解，

施加长期的渗透压。

事实上，关于后两点，在遭受肾衰竭的患者的腹膜腔内，在溶液 中施用渗透剂的效果由以下各项决定，即：这些渗透剂在腹膜液内的 稳定性、这些渗透剂被吸收进体循环的程度、以及这些渗透剂被淀粉 酶水解的速率。

与此同时，现有技术的渗透剂都有被快速水解的缺点。

综上所述，结果就是：因此对于以下葡萄糖聚合物存在一个需要 (该需要尚未得到满足)，即：这些葡萄糖聚合物展现出显著的性 质，尤其在稳定性和可溶性方面，并且它们同时赋予含有它们的产品 一个较长的使用寿命以及受控的消化率，这样使得有可能将这些葡萄 糖聚合物相当特别地用于腹膜透析领域中。

发明概述

申请公司确信已调和了所有这些目标(直到现在还认为这些目标 很难调和)，这种调和是通过以大量的研究为代价、想象和开发了新 颖的支化的可溶性葡萄糖聚合物而实现的，这些聚合物是由以下淀粉 制备，即：具有的直链淀粉含量为按重量计至少30％、优选按重量计 在35％与80％之间。

如下文将要示例的，本申请公司已经发现，只要使用富含直链淀 粉的淀粉作为起始底物，就可以实现如下的葡萄糖聚合物的生产，即 这些葡萄糖聚合物具有显著的特性，尤其在稳定性、较长的使用寿命 以及受控制的消化率方面。

本发明的支化葡萄糖聚合物在以下意义上构成了可溶性葡萄糖聚 合物的一个新的家族，即：该新的家族与现有技术的那些聚合物非常 不同，现有技术的那些聚合物包括本申请公司已在其自己的先前专利 申请中提出并描述的其他高度支化的可溶性葡萄糖聚合物。

因此，本申请公司已经克服了第一个技术偏见，根据该技术偏 见，如在国际专利申请WO 2004/022602中所宣称的，可用于腹膜透 析的淀粉基产品必须具有的α-1，6支化度优先介于11％与18％之间， 以及分子量介于10,000与200,000之间。

本申请公司还曾经认为，只有高度支化的可溶性聚合物(支化度 大于10％)才可以用于腹膜透析：

在该公司的专利EP 1 369 432中，聚合物是高度支化的可溶性 葡萄糖聚合物，这些聚合物具有的α-1，6键含量大于10％、优选介于 12％与30％之间，并且Mw为从30,000至200,000道尔顿。

在该公司的专利申请EP 1 548 033中，聚合物是高度支化的可 溶性葡萄糖聚合物，这些聚合物具有的α-1，6键含量为介于13％与 17％之间，并且Mw为从90,000至150,000道尔顿。

在该公司的专利申请EP 1 994 061中，聚合物是高度支化的可 溶性葡萄糖聚合物，这些聚合物具有的α-1，6键含量为介于20％与 30％之间，并且Mw为从20,000至30,000道尔顿。

与此同时，本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物是由以下淀粉制 备，即：具有的直链淀粉含量为按重量计至少30％、优选按重量计在 35％与80％之间，这些聚合物具有的α-1，6糖苷键含量为介于7％与 10％之间、优选介于8％与9％之间，并且Mw为介于50,000与 150,000道尔顿之间。

这些聚合物的特征在于，这些聚合物对α淀粉酶具有显著的抗 性，该抗性通过以下测试来测定，即：包括制备根据本发明的支化聚 合物的水溶液，使该溶液与源于胰脏的淀粉酶接触，从而模拟腹膜内 的产物水解。

本申请公司过去已经在其专利EP 1 177 216中描述了支化的可溶 性葡萄糖聚合物，这些聚合物具有的α-1，6糖苷键含量为介于2.5％与 10％之间，以及Mw为介于10,000与10⁸道尔顿之间。

如下文所例证，大多数由标准淀粉、尤其由蜡质玉米淀粉制备的 这些化合物中，没有一种对胰脏α淀粉酶展现出如此显著的抗性特 性。

最后，这些聚合物具有的根据测试“A”测定的重量克分子渗透浓度 的值为小于100mOsm/kg。

本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物具有的α-1，6糖苷键含量介于 7％与10％之间、优选介于8％与9％之间。

所述含量是通过质子核磁共振分析测定。

于是支化度被表示为一个百分比，该百分比对应于当所述可溶性 葡萄糖聚合物的葡萄糖残基上的所有C1携带的糖苷质子的所有信号 的值被给定为100时，一个脱水葡萄糖单位的C1所携带的质子信号 的量，该脱水葡萄糖单位通过一个α-1，6键与另一个脱水葡萄糖单位 连接。

在这些条件下，本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物具有的α-1，6 糖苷键含量介于7％与10％之间、优选介于8％与9％之间。

该α-1，6糖苷键含量在支化度方面赋予本发明的支化葡萄糖聚合物 一种特殊的结构，该特殊的结构是相对于衍生这些聚合物的淀粉而 言。

该α-1，6糖苷键含量使得根据本发明的支化葡萄糖聚合物难以消 化，这促使这些聚合物可以用于所有的需要一个缓慢消化的应用中。

根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的分子量通过测量重均 分子量(Mw)来测定。

该值通过在PSS SUPREMA 100以及PSS 5 SUPREMA 1000柱上 使用尺寸排阻色谱法来获得，这些柱是串联安装并且结合至一个光散 射检测器。

于是根据本发明的支化葡萄糖聚合物具有的Mw值为介于50,000 与150,000道尔顿之间。

根据本发明的聚合物的特征在于这些聚合物对α淀粉酶具有显著 的抗性，所述抗性根据本申请公司开发的一种测试来测定。

该测试，称为测试“B”，使之有可能评价这些聚合物对淀粉酶水解 的抗性，该抗性尤其是选择一种透析液的渗透剂的一个必要依据。

根据测试“B”，用于淀粉酶消化的操作条件如下：

精确称出0.6克测试产物，

添加150ml 0.1mol/l的马来酸钠缓冲液，pH为7，

搅拌直至该产物溶解，

将烧瓶放置在37℃下的一个恒温水浴中15分钟，以使溶液温 度为37℃，

在0分钟时取1.5ml的一个样品(样品SI)，

添加0.15克猪胰酶(来自动物的α-淀粉酶)，该胰酶具有的 活性相当于8USP，

在37℃下的该恒温浴中孵育，伴随搅拌(使用THP 15 Variomag搅拌器，以该搅拌器四分之三的搅拌力进行搅拌)，持续 300分钟，

在以下时间点取1.5ml的样品：15、30、45、60、90、120、 180、240、300分钟，

通过将样品放置在100℃下的一个干浴中10分钟来停止酶促 反应，

分析这些样品中的还原糖以研究水解率，

测定由此释放的淀粉酶水解产物的平均摩尔质量，

用来分析这些还原糖的方法是Somogyi-Nelson方法，该方法包 括：

将200微升样品引入到一个有塞试管中，并向所述样品中添加 200微升工作液(酒石酸钠和硫酸铜试剂)。

使其沸腾，并且待冷却后，添加砷钼酸盐试剂，然后添加水。

将获得的溶液积存在一个微板上，然后在520纳米的一个波长下 在一个微板读取器上读取吸光度。

用于根据测试“B”测定这些还原糖的参考值是在300分钟时测量的 值。

至于用来测定由此释放的淀粉酶水解产物的平均摩尔质量的方 法，该方法是在Shodex OH pak-SB802-SB803-SB805柱上进行的 一种HPSEC色谱法。

洗脱溶剂是0.1M的硝酸钠加上0.02％的叠氮化钠的溶液。流速 为0.5ml/min。这些柱的温度维持在30℃。

使用一种折射计作为检测模块，并且这些柱使用已知摩尔质量的 支链淀粉来定标。

用于根据测试“B”测定平均摩尔质量的参考值也是在300分钟时测 量的值。

于是本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物对胰脏α淀粉酶展现出 抗性，该抗性根据测试“B”表达为：

还原糖含量为介于25％与35％之间，以及

多种所释放产物的Mw为介于6,000与12,000道尔顿之间。

根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的第一个亚家族对胰脏 α淀粉酶展现出抗性，该抗性根据测试“B”表达为：

还原糖含量大于或等于25％并且小于30％，

多种所释放产物的Mw大于或等于9,500并且小于12,000道尔 顿，

根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的第二个亚家族对胰脏 α淀粉酶展现出抗性，该抗性根据测试“B”表达为：

还原糖含量大于或等于30％并且小于35％，

多种所释放产物的Mw大于或等于6,000道尔顿并且小于 9,500道尔顿。

根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物还具有特定的重量克分 子渗透浓度值。

一种溶液的重量克分子渗透浓度被定义为每千克水中溶解的一种 物质的摩尔数。

根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的重量克分子渗透浓度 根据测试“A”来测定，该测试“A”与专利申请EP 1 369 432中所描述的 相同，包括测定一种溶液的重量克分子渗透浓度，该溶液含有放置在 1kg水中的100g干的支化葡萄糖聚合物。

该溶液的重量克分子渗透浓度根据制造商的说明，使用Fiske TM  Associates公司的Mark 3渗透压计来测量，并且得到的重量克分子渗 透浓度值小于100mOsm/kg。

该值符合人们对用于腹膜透析的一种化合物的预期值(值过高意 味着所述化合物与水的强结合，这会损及该化合物穿过腹膜的半透膜 的通行)。

建议使用显著小于血液的重量克分子渗透浓度(300mOsm/kg) 的重量克分子渗透浓度值。

于是如上文所呈现的根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的 第一个亚家族具有一个特别低的重量克分子渗透浓度，该浓度介于10 与20mOsm/kg之间。

如上文所呈现的根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的第二 个亚家族对其部分而言具有的重量克分子渗透浓度介于50与100 mOsm/kg之间。

最后，根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的特征在于这些 聚合物的链长分布特征。

对根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物长度的测定分两个步 骤进行。

第一步包括使用一种细菌异淀粉酶对所述产物进行脱支(α-1，6键 的特定水解)，然后第二步，确定所释放的多种低聚糖的聚合度，此 步骤通过使用尺寸排阻色谱法(HPSEC)与已知尺寸的支链淀粉比较 来进行。

该技术包括称出50mg待分析的产物，并向该产物添加3.75ml 水。在搅拌该混合物后，添加0.5ml二甲基亚砜(DMSO)，并使该 混合物沸腾而伴随搅拌持续30分钟。

将温度降低到45℃，并添加0.25ml的1M醋酸钠缓冲液(事先 用醋酸使pH值达到3.5)。

随后，添加从异淀粉酶生产菌(Pseudomonas amyloderasoma)提 取的一种异淀粉酶，并让其在45℃下作用20分钟，该生产菌由林原 (Hayashibara)公司销售，比例为59,000U/mg。

重复该添加步骤20次，然后经由煮沸3分钟来停止反应。

然后使用分别由Fluka公司与Sigma公司出售的Amberlite 200与 Amberlite IRA-67树脂对该溶液进行去矿化。

然后，在将该溶液注射在HPSEC柱上之前，先将该溶液用孔径为 0.45μm的一个尼龙过滤器过滤。

用以下方式对HPSEC色谱法进行参数化(该方法在TSK出售的 PWXL寡柱以及Shodex出售的SB802+803+804+805柱上进 行)：

注射体积：200l

流速：0.5ml/min

柱温度：40℃

洗脱剂：0.2M硝酸钠+0.02％叠氮化钠

洗脱时间：180分钟。

所释放的多种低聚糖的尺寸借助这些低聚糖的洗脱时间来确定， 该洗脱时间与已知尺寸的支链淀粉的洗脱时间进行对比。

于是根据本发明的支化葡萄糖聚合物具有一种支链长度分布特 征，其特征在于：

25％至80％的DP＜10，

2％至10％的DP＞30，

而平均DP介于4与12之间。

如上文所呈现的根据本发明的支化葡萄糖聚合物的第一个家族具 有一种支链长度分布特征，其特征在于：

25％至40％的DP＜10，

5％至10％的DP＞30，

而平均DP介于10与12之间。

如上文所呈现的根据本发明的支化葡萄糖聚合物的第二个家族具 有一种支链长度分布特征，其特征在于：

65％至80％的DP＜10，

2％至5％的DP＞30，

而平均DP介于4与6之间。

比较而言，艾考糊精具有一种支链长度分布特征，其特征在于：

22％的DP＜10，

16％的DP＞30，

而平均DP为13。

因此，根据本发明的支化葡萄糖聚合物的特征在于，这些聚合物 具有一个截然不同的链长度分布(显著较高含量的DP＜10而较低含 量的DP＞30)，尤其是与艾考糊精相比较。

因此，该支链长度分布赋予根据本发明的支化葡萄糖聚合物一个 完全特殊的结构，该结构由多个支化的短链构成。

本发明还涉及一种腹膜透析液，其特征在于，该透析液包含作为 渗透剂的至少一种支化的可溶性葡萄糖聚合物，该聚合物是通过对淀 粉进行酶处理而获得，该聚合物所具有的

α-1，6糖苷键含量介于7％与10％之间、优选介于8％与9％之 间，

利用光散射测定的重均分子量(Mw)介于50,000与150,000 道尔顿之间。

根据本发明的腹膜透析液还可包含生理上可接受的电解质，具体 来说，如钠、钾、钙、镁或氯，从而避免从血清到腹膜的转移所导致 的电解质损失。

当通过将根据本发明的支化聚合物溶于水中来获得该溶液时，该 溶液应是澄清且无色的。

该溶液不含内毒素类、肽聚糖类以及β葡聚糖类，也不含源于原 料或源于用来生产该溶液的酶制剂的污染物类。

为了达到这个效果，所述溶液中使用的高度支化的聚合物优选将 要经过纯化，以便去除任何着色或任何不想要的污染物，如蛋白质 类、细菌类、细菌毒素类、纤维类、微量金属类等，这些将在下文说 明。

根据本发明的透析液也可包含多种缓冲剂(尤其是乳酸盐、醋酸 盐、葡糖酸盐)以及其他添加剂如氨基酸类、胰岛素、多元醇类如山 梨糖醇、赤藓糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇或木糖醇，或氢化的淀粉水 解物。

向该组合物添加多元醇类、优选为不含以上所述的杂质(尤其是 内毒素类以及其他细菌源性残基类)的无热源多元醇类，相比于添加 葡萄糖或麦芽糖，使之有可能更有利地增加该溶液的重量克分子渗透 浓度，这归因于这些多元醇较大的渗透力并且因为它们不是还原性 的。

最后，还有可能用葡萄糖、麦芽糖和/或葡萄糖聚合物类来完成含 有本发明的高度支化的可溶性葡萄糖聚合物的透析液。

氨基酸基腹膜透析液类在阻止和葡萄糖及其衍生物相关的腹膜加 速老化方面有一定的价值，即使这些氨基酸基腹膜透析液的成本以及 对酸中毒的错综复杂的调节的风险限制了其专用而连续的处方。

因此，有可能设想在相同的腹膜透析液中构成一种不同分子的混 合物，即：葡萄糖、根据本发明的高度支化的可溶性葡萄糖聚合物以 及氨基酸类。

因此，最好对这些不同的组分单独进行杀菌(使用隔离带)，从 而特别是避免葡萄糖降解产物(GDP)或通过葡萄糖与所述氨基酸类 结合所产生的产物(或AGE)的生成，这些产物的生成会对腹膜的稳 定性造成有害影响。

此外，与现有技术的产物相比，根据本发明的透析液更有优势， 因为该透析液所含有的渗透剂可以施加长期的渗透压并且诱导缓慢的 葡萄糖外观动力学，而同时不易回生，因此符合上文所定义的主要标 准。

为了制备根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物，可以进行一 种方法，该方法包括以下连续的步骤：

1)将一种淀粉乳爆裂和溶解，该淀粉乳具有的直链淀粉含量为按 重量计至少30％，优选按重量计在35％与80％之间，以及干物质含量 介于5％与25％之间，

2)持续添加从嗜热微生物提取的一种糖原分支酶，其活性介于 25,000U/ml与60,000U/ml之间，添加的剂量为介于800与2500U/g 干淀粉之间，温度介于60℃与80℃之间，持续时间从12至18小 时，

3)可任选地，用活性介于100与150KNU/ml之间的α淀粉酶类 型的一种淀粉液化酶进行处理，温度为95℃，pH介于5与8之间， 持续时间为30至60分钟、优选持续45分钟，

4)通过以下步骤纯化所生成的支化的可溶性葡萄糖聚合物：

至少一个用活性碳和/或用颗粒状碳黑进行处理的步骤，

至少一个杀菌过滤步骤，以及

可任选地，至少一个热处理步骤，

5)回收所生成的经过纯化的支化的可溶性葡萄糖聚合物。

使用分支酶修饰富含直链淀粉的淀粉的方法包括，首先，蒸煮该 淀粉以使其处于部分或完全凝胶化的形式。

根据本发明的方法的该第一个步骤对应于一种富含直链淀粉的淀 粉乳的爆裂和溶解，这种对淀粉的溶解旨在允许使用分支酶进行处 理。

基于本发明的目的，术语“富含直链淀粉的淀粉”旨在表示一种淀 粉，该淀粉具有的直链淀粉含量为按重量计至少30％，优选按重量计 在35％与80％之间。

在根据本发明的方法的一个实施方案中，准备一种干物质含量介 于5％与25％之间的豌豆淀粉乳，并使用本领域普通技术人员熟知的 任何技术进行加热，温度高于或等于该淀粉的凝胶化温度、优选介于 100℃与200℃之间、甚至更优选介于140℃与160℃之间，压力为 4巴至5巴，持续3至5分钟。

基于本发明的目的，术语“分支酶”旨在表示选自由多种糖原分支 酶组成的组的分支酶。

更具体地说，这些分支酶是从嗜热生物和/或微生物提取的。

在完全或部分溶解该淀粉这一步骤后，将分支酶持续引入反应介 质中，引入的条件限制分子间络合物的形成。

更具体地说，将分支酶引入反应介质的条件要根据时间和温度进 行调整，以便限制因该淀粉的回生造成的可溶性物质的形成，以及结 构化的直链淀粉-脂质结合体的形成。

因此，将由此被部分或完全凝胶化的淀粉糊冷却，以便达到选定 的分支酶的最佳温度。

例如，如果选择从芽孢杆菌属(嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)等)的嗜热微生 物提取的热稳定性糖原分支酶，则有必要使该淀粉糊的温度达到该酶 的最佳操作温度，即：介于60℃和80℃之间。

有利的选择为，经过不到15分钟的时间段，将该部分或完全凝胶 化的淀粉糊从介于140℃与160℃之间的起始温度快速冷却至从 60℃至80℃的温度，从而允许立即添加该分支酶以避免该淀粉的回 生或结构化的直链淀粉-脂质结合体的形成。

然后调整该溶液的pH以便使该pH值符合所述酶的操作模式。

如下文所示例，在将反应介质的温度快速降低至分支酶的最佳操 作温度后，选择使用所述分支酶，其活性介于25,000U/ml与60,000 U/ml之间，添加的剂量介于800与2500U/g干淀粉之间，温度介于 60℃与80℃之间，持续时间从12至18小时。

在反应结束时，该酶最终可以在从90℃至95℃的温度下被热灭 活。

由此，在一种水溶液中获得支化的可溶性葡萄糖聚合物。

根据本发明的方法的可任选的第三步包括使一种淀粉液化酶发挥 作用，如一种α淀粉酶。

反应条件(温度以及pH)如下：从0.10至0.30ml的α淀粉酶， 例如活性介于100与150KNU/ml之间的来自诺维信(Novozymes) 公司的Termamyl120L类型的α淀粉酶，温度为95℃，pH介于5与 8之间，持续时间为30至60分钟、优选持续45分钟。

然后，通过将pH降至3.5，例如通过使用10％HCl，将该α淀粉 酶灭活。

在该处理结束时，在一个水溶液中作为与它的酶降解产物的混合 物获得了根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物。

与上述的专利申请、尤其是EP 1 369 432与EP 1 548 033的传授 内容相比，使用一种技术(例如选自膜分离和色谱法的组)来回收高 分子量馏分并且排除低分子量馏分的一种分馏法，此处没有必要进 行。

因此，只使用分支酶进行处理的直接产物，以及使用分支酶然后 使用α淀粉酶进行处理的直接产物，构成了先前所描述的支化的可溶 性葡萄糖聚合物的两个家族。

第一个家族对应于只使用分支酶进行处理而获得的根据本发明 的葡萄糖聚合物；

第二个家族对应于使用分支酶以及α淀粉酶进行联合处理而获 得的根据本发明的葡萄糖聚合物。

因此，使用一种技术，该技术选自例如膜分离和色谱法的组，对 上文所述的第二个家族的产物进行分馏，将会产生根据本发明的支化 的可溶性葡萄糖聚合物的第三个家族。

根据本发明的方法的第四步包括通过以下步骤纯化所生成的支化 的可溶性葡萄糖聚合物：

至少一个用活性碳和/或用颗粒状碳黑进行处理的步骤，

至少一个杀菌过滤步骤，以及

可任选地，至少一个热处理步骤。

本申请公司，在一种特殊的安排中，将这些用活性碳和/或颗粒状 碳黑进行处理的步骤、过滤步骤，或甚至热处理步骤组合在一起，从 而非常成功地保证了“几乎不存在”污染物，尤其是内毒素类、β葡聚 糖类以及肽聚糖类。

因此，这一方法的安全性使之有可能将所述方法结束时的细菌控 制限制在检测肽葡聚糖类的单个测试(例如本申请公司开发并验证的 高敏感度测试，该测试将在下文描述)以及检测内毒素类的常规测试 (LAL测试＝检测细菌内毒素类的测试，这些细菌内毒素类是革兰氏 阴性菌的主要成分)。

基于本发明的目的，术语“几乎不存在”旨在表示一个阈值定量， 该定量远低于药典测试中所描述的定量，即：

对于内毒素类(以及β葡聚糖类)，通过LAL测试法(凝胶 终点法)，使用CR恩度斯弗公司(Charles River-Endosafe)生产的 多种试剂(敏感度为0.015E.U/ml的LAL裂解物对照OR15015，以 及每瓶500ng或10ng的CSE内毒素类对照E110或E120)：0.6 EU/g；

对于肽葡聚糖类(以及β葡聚糖类)，通过本申请公司开发的 一种高灵敏度测试：＜8ng/g的葡萄糖聚合物(因此，远低于专利 EP 1 720 999中针对肽葡聚糖类所描述的参考阈值)。

表述“本申请公司开发并验证的高灵敏度测试”旨在表示由本申请 公司开发并验证的一种测试，是通过调适由和光纯药工业公司 (Wako Pure Chemical Industries Ltd.)生产并销售的SLP-HS单套试 剂盒对照293-58301来开发并验证。

该测试包括添加“SLP-HS”(高灵敏度桑蚕幼虫血浆)试剂，所述 试剂是由桑蚕幼虫血浆制备，能够：

与葡萄糖聚合物溶液中含有的肽葡聚糖类以及β葡聚糖类反 应，该溶液是在水(例如，LAL测试的专用水)中以5％制备，

诱导一个丝氨酸-蛋白酶级联反应，并且

利用和光纯药工业公司制造并销售的一个内毒素检测仪试管读 取器，检测和/或定量所述肽葡聚糖类以及β葡聚糖类，在以下非常低 的阈值下进行，即：

检测限度(LD)，阈值大约为0.05ng/ml(即，1ng/g的葡萄 糖聚合物)以及

定量限度(LQ)，阈值大约为0.15ng/ml(即，3ng/g的葡萄 糖聚合物)

(LD以及LQ在所测试的葡萄糖聚合物产物中测定)。

更具体地说，该SLP-HP测试包括：

在合适质量的水(例如，LAL测试的专用水)中以5％制备在 溶液中的测试葡萄糖聚合物，

在从0.04至2.5ng/ml(目标值)的应用范围上，产生在水中 的肽葡聚糖类的一个定标范围，利用SLP-HS单套试剂盒的肽葡聚糖 类标准(从金黄色葡萄球菌提取的)，以用于建立一个直线的定标线 (对数刻度的线性回归Ta＝f(PG含量)，

在添加100μl稀释剂(在上述试剂盒中供应)进行重构后， 向HS-SLP试管中引入100μl所制备的测试溶液，

将SLP-HS试管引入到内毒素检测仪试管读取器(和光纯药公 司)的孵育孔中，该读取器恒温在30℃，并根据制造商建议的条件进 行了参数化。

该测试溶液的PG含量利用已建立的直线的定标线进行计算。

结果表达为ng/ml的5％的测试溶液，然后表达为ng/g的葡萄糖聚 合物。

值得注意的是，结束时，利用根据本发明的方法获得的葡萄糖聚 合物中的这些肽葡聚糖以及β葡聚糖的数量必定远低于8ng/g的葡萄 糖聚合物。

如上文已述，在纯化旨在用于腹膜透析的支化的可溶性葡萄糖聚 合物的方法中，该纯化方法的第一步包括在一个特殊的配置中使用活 性碳和/或颗粒状碳黑。

申请公司建议在以下三种变体的至少一个变体中来实施这一手 段。

在根据本发明的方法的第一个变体中：在使用颗粒状碳黑的情 况下，该配置是基于在逆流模式中的操作。

在柱中的停留时间大约为3小时。在约80℃的温度下，以约2 m/h的速度进行渗滤，以避免细菌污染。

根据本发明的待纯化的葡萄糖聚合物与颗粒状碳黑之间的接触在 以下意义上发生在逆流模式中：该葡萄糖聚合物溶液首先与饱和的颗 粒状碳黑在柱的底部进行接触。

因此，经过纯化的葡萄糖聚合物是在颗粒状碳黑的柱的顶部得以 回收，在该柱顶部，经过纯化的颗粒状碳黑在逆流模式中添加。

以此方式，在柱顶部的颗粒状碳黑的最后一层充当一个“安全屏 障”。

这一安排可以通过进行颗粒状碳黑“追加”操作来控制。使柱停 止，经底部取出饱和的颗粒状碳黑，并且经顶部用再生的颗粒状碳黑 予以替换。

饱和的颗粒状碳黑在再生之前，在一个平底炉中经过热处理而脱 糖。

在启动时，为了安全起见，将第一m³具有低的干物质含量的支化 的可溶性葡萄糖聚合物降低等级。

对污染物(内毒素类、肽葡聚糖类以及β葡聚糖类)水平下降的 监控可以通过从柱底部到柱顶部取一定数目的样品(例如五份)来加 以分析；

在根据本发明的方法的第二个变体中：在使用活性碳的情况 下，该配置是基于使用活性碳进行的一个“双重”处理。

将加入的支化的可溶性葡萄糖聚合物与活性碳(相对于待处理的 干物质，该活性碳介于0.5％与5％之间、优选介于0.5％与1.5％之 间)混合，温度介于70℃与75℃之间，持续时间为1小时。

然后，过滤并分析这些葡萄糖聚合物。

然后，使这些葡萄糖聚合物经受相同性质的一个处理。这第二次 处理是“安全”处理。

本申请公司建议在这两个阶段中使用孔隙度不同的活性碳，以便 将污染物大小的变化性考虑在内。

在根据本发明的方法的第三个变体中：选择将一个颗粒状碳黑 阶段以及一个活性碳阶段相组合。

于是本申请公司建议将颗粒状碳黑柱放置在这一组合的始端。

实施这两个阶段的条件与上文所述的条件相一致。

为纯化葡萄糖聚合物而实施的这三种手段中的第二个包括使用一 个杀菌过滤步骤，这些葡萄糖聚合物旨在用于生产根据本发明的腹膜 透析液。

此杀菌过滤步骤主要由以下各项组成：一个膜过滤，其中孔径为 0.1μm；在此之前，适当时先进行一个膜超滤，其中孔径为0.22 μm；在该超滤之前，先进行一个膜过滤，其中孔径为0.45μm。

该步骤有可能保留多种微生物、并且尤其是酸热脂环酸芽孢杆菌 (Alicyclobacillus acidocaldarius)类型的嗜酸热性细菌引起的任何污 染，这些微生物的尺寸比这些过滤孔径大。

使用几个筒式过滤器进行该过滤，这些过滤器被插入一个垂直壳 体中，糖浆被朝向该垂直壳体引导。

这些筒式过滤器例如由Pall公司或Millipore公司供应。这些筒的 尺寸可以是10英寸、20英寸或30英寸，并且所安装的筒的个数使得 有可能获得一个过滤表面积，该表面积足以使介于1和20l/分钟/m²之间的一个产物流速通过。

这些筒式过滤器具有多种抵抗能力，这些能力用于在约75℃的高 温下持续工作，并用于在超过700h的时间段内使上述的流速通过。

在高于75℃的温度下工作可以限制任何微生物生长，尤其是嗜热 菌群的生长。

这些筒的耐温性还使得可以在它们投入使用前进行一个杀菌步 骤。该杀菌步骤包括使处于2巴下的蒸汽通过该壳体，持续20分 钟。在该杀菌步骤后，用纯化水(药典的含义之内的纯化水)冲洗5 分钟。

这些过滤器还具有忍受某些用于设备清洗操作的化学产品、尤其 是浓度为5‰的过氧乙酸的能力。

可以对这些筒进行一个完整性测试，使用来自例如Millipore公司 的一个完整性测试。当安装这些筒以验证其装配时，进行该完整性测 试。然后，在每次清洗设备之前以及最后在拆卸之前进行该测试，以 验证所述筒在生产阶段的正确运行。

这些过滤器的工作压力差(ΔP)不得超过2巴，以保证它们的完 整性。如果这种情况发生，这些过滤器必须更换成新的。

为纯化旨在用于生产根据本发明的腹膜透析液的支化的可溶性葡 萄糖聚合物而实施的第三个和最后一个手段可以包括使用一个特殊的 热处理步骤，该热处理步骤最好在这些纯化步骤结束时实施。

本申请公司已经注意到此处理在保证对通过根据本发明的方法提 供的葡萄糖聚合物的高纯化水平方面无关紧要，但考虑到安全性可以 实施。

更具体地说，该热处理包括调节时间/温度对，以消除嗜热微生物 的残余生物负载，这些微生物仍能够污染所述葡萄糖聚合物。

该热处理步骤然后包括加热，加热温度介于100℃与130℃之 间、优选为120℃，持续时间1至5分钟，优选持续2分钟。

该热处理利用一个管式换热器来进行，在该换热器中葡萄糖聚合 物溶液进行循环，所述管式换热器被一个压延机包围，该压延机中被 送入处于2巴下的蒸汽，以调节该压延机中约120℃的温度。

这种管式换热器，例如由Actini公司制造，由以下几个部分组 成：

用于回收能量的一个区段，该能量是在该区的进口和出口之间 产生，

用处于2巴下的蒸汽加热的区段，

被整合的一个支撑区段，该支撑区段可以根据所需的停留时间 进行调制。

计算该换热器的长度，以便根据进料流速来保证所需的停留时 间。例如，针对约100至130升的一个支撑区段，进料流速可以介于 3000和4000升/小时之间。

为了说明针对根据本发明的葡萄糖聚合物的这一纯化处理，其中 一个优选的方法包括，在对步骤2)结束时所规定的分支酶进行灭活步 骤后，或在可任选的步骤3)结束时所建议的α淀粉酶进行抑制步骤 后，进行以下连续步骤：

i)使含有支化的可溶性葡萄糖聚合物的水溶液的pH值达到4与 5之间的值、优选为4.5的值，

ii)对所生成的溶液进行两个用活性碳和/或用颗粒状碳黑处理的 连续步骤，

iii)在孔径为10μm的一个过滤器上、并且然后在孔径为1μm的 一个过滤器上进行过滤，

iv)对支化的可溶性葡萄糖聚合物的溶液进行蒸发、浓缩和去矿 化，

v)进行用活性碳和/或用颗粒状碳黑进行处理的一个第三步骤，

vi)在孔径为10μm的一个过滤器上、并且然后在孔径为1.2μm 的一个过滤器上进行过滤，

vii)实施杀菌过滤，该杀菌过滤由两个膜过滤组成，其中其孔 径为0.45μm然后是0.22μm。

本申请公司建议，在步骤2)的水平上，在用活性碳和/或颗粒状碳 黑进行处理的两个连续步骤之间，去除第一个处理步骤产生的溶液的 颗粒以及杂质(例如，污染性碳或颗粒状碳黑的颗粒)，以避免随后 使用的活性碳和/或颗粒状碳黑柱的阻塞。

对这种无机的、或甚至有机的填充物的去除可以在无菌条件下， 通过本领域普通技术人员所熟知的任何手段来进行。

例如，该去除可以使用以下各项来进行，即：使用一个无菌盘式 离心分离器，如由阿法拉伐(Alfa Laval)公司销售的一种无菌盘式 离心分离器(BTUX型)；使用一个微滤模块，如由颇尔(Pall)公 司销售并装配有多个Membralox陶瓷膜的一种微滤模块；或使用一个 伊顿(Eaton)袋式过滤器，该过滤器具有的连续孔径为50μm、25 μm以及10μm，这些将在下文中示例。

因此，这些连续的步骤使之有可能逐步地增加葡萄糖聚合物生产 的安全性，这些葡萄糖聚合物旨在用于制备腹膜透析液。

完全有利的是，这些支化的可溶性葡萄糖聚合物，即使在副产物 存在下，也完全适合用于旨在使用它们的腹膜透析应用中。

具体实施方式

本发明的其他特征以及优势，在阅读了下文所述的非限制性实例 后，将会变得明显。

实例1.仅利用分支酶制备本发明的支化的可溶性葡萄糖聚合物(根据 本发明的第一个家族的聚合物)

一种含有11％的干物质的淀粉溶液由以下豌豆淀粉制备，即：富 含的淀粉含量大于95％，并且具有的直链淀粉含量为36.7％。

为此，在环境温度下并且伴随搅拌，将110g干的豌豆淀粉重悬 在890ml的水中。

用4％NaOH将pH调节到7.0。

在一个喷射式蒸煮锅中进行该淀粉的完全溶解，温度为150℃， 持续时间为4分钟，气压为4-5巴，随后通过在一个换热器中再循环 而常压快速冷却至70℃。

持续添加从嗜热脂肪芽孢杆菌纯化的糖原分支酶，添加比例为每 100g干底物，3ml处于45000U/ml的酶溶液。

进行酶促反应，持续时间为15小时，温度为70℃，并且pH为 6.8，然后经由在90℃下加热1小时来停止反应。

然后使反应介质回到温度70℃，以及pH 4.5。

然后，将该反应介质在1％d/d Norit SX+活性碳上进行处理，持续 时间为1小时，并且在连续孔径为50μm、25μm以及10μm的伊顿 袋式过滤器上进行过滤。

所生成的溶液经历一个进一步的处理，该处理使用按重量计1％干 /干(d/d)的Norit SX+活性碳，持续时间为1小时，温度为70℃， 然后在一个孔径为11μm的Cricket过滤器上、并且然后在一个1μm 伊顿过滤器上进行过滤。

将所生成的产物在一个尼鲁(Niro)降膜蒸发器上浓缩至干物质 含量为约30％。

通过穿过一个混合床进行去矿化，温度为小于40℃，并且流速为 3V/V/h。

将经过去矿化的溶液加热至70℃，并经历使用1％d/d Norit SX+ 活性碳的一个第三处理步骤，持续时间为1小时，然后在一个孔径为 11μm的Cricket过滤器上、并且然后在孔径为1.2μm的Millipore筒 上进行过滤，随后在孔径为0.45μm然后0.22μm的膜上进行杀菌过 滤。

然后将该溶液进行喷雾干燥。

由此纯化的葡萄糖聚合物具有的内毒素含量小于0.3EU/g，并且 肽葡聚糖含量小于20ng/g，并且每克中也不存在好氧微生物(酵母 菌、霉菌和嗜热嗜酸菌)。

以下表I呈现了由此获得的根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚 合物与艾考糊精对比的理化特征的结果。

表I

与艾考糊精产生的血糖以及渗透力相比，根据本发明的葡萄糖聚 合物展现出显著的血糖以及渗透力。

在相等的重量克分子渗透浓度下，根据本发明的聚合物实际上表 达出的淀粉酶抗性比艾考糊精的淀粉酶抗性大。

应注意的是，本发明的支化的葡萄糖聚合物与根据专利EP 1 177 216(本申请公司是该专利的所有人)的传授内容所制备的那些聚合 物也有所不同。

该专利EP 1 177 216传授了优先用分支酶对一种蜡质(富含支链 淀粉的)淀粉衍生物或淀粉进行处理，该处理分批进行并且温度为 37℃。

本申请公司由此发现，根据这一专利EP 1 177 216获得的葡萄糖 聚合物就淀粉酶抗性测试来说展现出一种不太有利的性能，这尤其反 映为：多种所释放产物具有的Mw小于6000道尔顿、优选介于5000 与6000道尔顿之间，即该值是根据此表1产生的产物所释放的产物 的Mw值的一半大小。

因此，这些支化的可溶性葡萄糖聚合物构成了在分子量、支化结 构以及关于其淀粉酶抗性的性能方面的最佳折衷方案，这使得这些聚 合物能够更特别地用于腹膜透析中。

实例2.结合使用分支酶与一种α淀粉酶来制备根据本发明的支化 的可溶性葡萄糖聚合物(本发明的第二个家族的聚合物)

一种含有11％干物质的淀粉溶液由以下豌豆淀粉制备，即：富含 的淀粉含量大于95％，并且具有的直链淀粉含量为36.7％。

为此，在环境温度下并且伴随搅拌，将110g干的豌豆淀粉重悬 在890ml的水中。

用4％NaOH将pH调节到7.0。

在一个喷射式蒸煮锅中进行该淀粉的完全溶解，温度为150℃， 持续时间为4分钟，气压为4-5巴，随后通过在一个换热器中再循环 而常压快速冷却至70℃。

持续添加从嗜热脂肪芽孢杆菌纯化的糖原分支酶，添加比例为每 100g干底物，2ml处于45000U/ml的酶溶液。

进行酶促反应，持续时间为15小时，温度为70℃，并且pH为 6.8。

在以下条件下，用α淀粉酶进行一个补充处理：

以CaCl₂的形式添加70ppm干/干钙离子。

将该混合物加热至95℃。

添加120L浓度为120KNU/g的0.15％V/干Termamyl。

进行45分钟的孵育，然后通过使用10％HCl将pH降至3.5来停 止反应，并且然后将该溶液维持在pH 3.25以及温度95℃持续15分 钟。

然后使反应介质回到温度70℃以及pH 4.5，然后，在1％d/d Norit SX+活性碳上进行处理，持续时间为1小时，并且然后在连续 孔径为50μm、25μm以及10μm的伊顿袋式过滤器上进行过滤。所 生成的溶液经历一个进一步的处理，该处理用1％d/d Norit SX+活性 碳，持续时间为1小时，温度为70℃，然后在一个孔径为11μm的 Cricket过滤器上、并且然后在一个1μm伊顿过滤器上进行过滤。

将所生成的产物在一个尼鲁降膜蒸发器上浓缩至干物质含量为约 30％。

通过穿过一个混合床进行去矿化，温度为小于40℃并且流速为3 V/V/h。

将经过去矿化的溶液加热至70℃并经历使用1％d/d Norit SX+ 活性碳的一个第三处理步骤，持续时间为1小时，然后在一个孔径为 11μm的Cricket过滤器上、并且然后在孔径为1.2μm的Millipore筒 上进行过滤，随后在孔径为0.45μm然后0.22μm的膜上进行杀菌过 滤。

然后将该溶液进行喷雾干燥。

由此纯化的葡萄糖聚合物具有的内毒素含量小于0.3EU/g，并且 肽葡聚糖含量小于20ng/g，并且每克中也不存在好氧微生物：酵母 菌、霉菌以及嗜热嗜酸菌。

以下表II呈现了由此获得的根据本发明的支化的可溶性葡萄糖聚 合物与艾考糊精对比的理化特征的结果。

表II

利用根据本发明的方法的这一变体获得的葡萄糖聚合物本身，从 α淀粉酶抗性测试的观点来看，尤其是在所释放产物的Mw方面，也 展现出完全显著的性能。