针对转铁蛋白受体的抗体以及其用于依赖于铁的肿瘤的免疫疗法的用途

摘要

本发明的目标在分子构建物，其特征在于，所述分子构建物包含至少一个选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，所述氨基酸序列相应于靶向人转铁蛋白受体（TfR）的抗体的重链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域（“CDR”，互补决定区）（CDR-H）或轻链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域（CDR-L）。本发明的目标还在于药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种在本申请中所定义的分子构建物，以及与之相联合的药学上可接受的载体。

说明书

本发明的目标在于新的针对转铁蛋白受体的抗体（抗转铁蛋白受 体的抗体）家族，所述抗体是完全人的且具有细胞毒性，并且所述抗 体诱导人造血癌细胞的死亡。

转铁蛋白（Tf）为80kDa的血清蛋白质，其作用是固定可溶性铁。 在其与转铁蛋白受体（TfR）结合后，它被内吞入细胞中。内体的酸化 引起构象改变，所述构象改变使铁在胞质溶胶中发生盐析。然后， Tf/TfR复合物被重新输出至膜，在那里回复至生理pH而引起Tf/TfR 复合物的解离。

人转铁蛋白受体（TfR）（细胞增殖的标志物）在铁的细胞吸收中 和在细胞生长的调节中发挥着主要作用。长时间以来已经将其考虑作 为对于各种不同病理学状态[其中包括，癌症（因为它在许多强烈增殖 的细胞上过表达）和脑疾病（因为它在血脑屏障上表达）]来说令人感 兴趣的靶标，以用于治疗性或诊断性的方法。

因此，在最近25年中，已经借助于杂交瘤技术制作了一定数目的 抗转铁蛋白受体（抗-TfR）的鼠类单克隆抗体（mAb），并且已就其在 体外和有时在体内在癌症的鼠类模型上的抑制效应（Daniels等人, The transferrin receptor part I or part II,Clin Immunol.,2006） 或者作为用于靶向脑的载体（Pardridge,Drug targeting to the  brain,Pharm res 24:1733,2007）来对它们进行了测试。

在理论上，细胞毒性的抗转铁蛋白受体的单克隆抗体（抗-TfR  mAb）用于癌症免疫疗法的应用不得不受限于在依赖于铁的细胞（例如 强烈增殖的造血谱系）上所诱导的不希望的效应。

然而，用诱导铁耗竭的mAb 42/6来进行的I期试验表现得令人鼓 舞，因为在施用所述抗体期间未观察到在患者上的任何副作用（Brooks 等人,Clin Cancer Res 1:1259,1995）。

但是，用抗体42/6在患者中未观察到对癌症的任何应答。很可能 的是，该临床试验的失败归因于人抗小鼠抗体（HAMA）的对外（鼠类） 状态（其在患者中引发免疫应答），和归因于在反复注射后随之而来 的该抗体的快速降解。

鼠类抗体A24（其为抑制生长的抗-TfR mAb）在体外对于成人中 急性和慢性形式的T细胞白血病/淋巴瘤的样品（Moura等人,Blood 103:1838,2004；Callens等人,Leukemia 22:42,2008）以及对 于小鼠中套细胞淋巴瘤的建立（Lepelletier等人,Cancer Res 67: 1145,2007）是有活性的。mAb A24干扰TfR的天然配体，带电荷的 二铁转铁蛋白或全转铁蛋白（全-Tf）。A24减少全-Tf的内吞和因此 减少铁进入细胞。此外，mAb A24通过干扰TfR再循环到细胞表面上 而减少了TfR的表达。

在文献中被描述为细胞毒性的抗-TfR mAb单克隆抗体之中，它们 都不抑制转铁蛋白与TfR的结合。它们的抗增殖或细胞毒性作用要么 由于数个受体之间的桥联（其引起TfR降解）而产生，要么由于ADCC （依赖抗体的细胞毒性）与CDC（依赖补体的细胞毒性）的联合而产 生（Daniels等人,The transferrin receptor part I or part II, Clin Immunol.,2006）。由于知道TfR表达在某些静止细胞（红细胞 谱系的细胞、脑血管内皮细胞、肝细胞、肾小管细胞）的表面上，因 而这些抗体的作用方式可能呈现出一定的对于这些细胞类型的细胞毒 性。

迄今存在的所有抗-TfR抗体都是产生自动物的免疫接种的抗体。 因此，作为治疗性试剂，它们具有不可忽略的潜在的免疫原性，这限 制了它们的应用。

目前，市场上还不存在有抗-TfR单克隆抗体。但是，存在有正在 进行中的临床前研究，用于由MAT Biopharma公司开发的抗-TfR嵌合 抗体（其应用于转移性黑素瘤）的发展。然而，该抗体的抗肿瘤活性 通过ADCC（依赖抗体的细胞毒性）和CDC（依赖补体的细胞毒性）的 募召来表现出来。

因此，迄今在恶性血液病中所采用的治疗部分地基于化学疗法和 针对某些受体的酪氨酸激酶活性的药理学抑制剂的使用。根据病理学 状态以及肿瘤的阶段和等级来调整化学疗法。副作用是重大的，并且 与所述治疗的特异性缺乏有关。药理学抑制剂经证实是更特异性的， 但还是具有由于其与数个具有酶促活性的受体或细胞内信号传导分子 的家族结合而引起的毒性。此外，在某些患者中看到了与突变的获得 相关联的在治疗过程中的抗性出现。

出版物D1（“J.Mol.Biol.(2000),301,1149-1161”）探讨 了人单体scFv形式的抗体，其来自噬菌体文库，能够被内化到乳腺肿 瘤细胞SKBR-3中而不被内化到具有相同细胞特异性的正常细胞中。在 D1中所描述的抗体H7，即更具体地片段scFv H7（scFv：“单链可变 区片段形式”），能够抑制转铁蛋白与转铁蛋白受体的结合，以及乳 腺肿瘤细胞SKBR-3的生长。片段scFv H7与全转铁蛋白就其与癌细胞 SKBR-3的结合而言竞争性地反应。

出版物D2（“Molecular Immunology 44(2007),3377-3788”） 提及了在本申请中特别地例示的六种抗体，在体外通过噬菌体展示以 scFv形式的它们的获得，以及就其特异性地内化到乳腺肿瘤细胞 SKBR-3之内的能力来对它们进行的选择。

就其与转铁蛋白受体的特异性结合来描述了这六种抗体（参见上 面所提及的D1的结果），并且假设了这六种抗体在抑制乳腺肿瘤细胞 SKBR-3的细胞增殖中的效力。

然而，该假设在出版物D3（“Cancer Research,Vo l.70,No.13, 2010年7月）中将会被证明是无效的，在该出版物中表明，最后所述 抗体不抑制这些细胞的增殖（第5500页，左栏的最后一段）。

因此，抗体的确定仅是在寻找用于病理学状态例如癌症的治疗的 解决方案中的第一步。这是因为，然后必须能够确定在哪些肿瘤细胞 系上，和因此对于哪些治疗应用来说，所获得的抗体将能够是具有活 性的，这常常经证明是困难的，因为一方面细胞系的巨大数目和另一 方面难以预见的其行为。

现在，发明人已经令人惊讶地发现，作为本发明目标的抗体对于 淋巴瘤或白血病类型的癌症的治疗来说以及作为用于自身免疫性疾病 或预防移植物排斥反应的免疫抑制剂，具有高的潜力。

因此，本发明的目的之一为提供新型的治疗性抗体，其靶向人转 铁蛋白受体（TfR）并且对于癌症（特别是淋巴瘤或白血病类型的癌症） 的治疗来说具有高的潜力。

本发明的另一个目的为提供新型的治疗性抗体，其靶向人转铁蛋 白受体并且可以用于治疗自身免疫性疾病或预防移植物排斥反应。

本发明的另一个目的为提供新型的抗体，其靶向人转铁蛋白受体 并且可以用于将生物学活性分子（更特别地，细胞毒性试剂）定向运 载到过表达TfR的肿瘤细胞之内。

本发明的另一个目的为提供新型的抗体，其靶向人转铁蛋白受体 并且可以用于定向运载诊断性分子，更特别地用于脑成像。

由于下面所阐述的原因，作为本发明目标的新型抗体经证实是具 有高治疗潜力的分子，并且达到了上面提及的所有目的。

这是因为，本发明的发明人调制出了特异于转铁蛋白受体（TfR） 的、完全人的且细胞毒性的新型单克隆抗体，其抑制转铁蛋白（Tf） 与转铁蛋白受体（TfR）的结合，并因此使细胞丧失铁。更特别地，本 发明的抗体诱导细胞的铁耗竭（细胞内铁浓度的下降），其结果为细 胞表面上铁受体（TfR）的增加。

特别有利地，作为本发明目标的人抗体在体外以及在体内对于造 血系统来源的癌细胞具有抗增殖和细胞毒性活性。

更特别地，本发明的目标在于新型分子构建物，其特征在于，所 述分子构建物包含至少一个选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID  NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、 SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、 SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，所述氨基酸序列相应于靶向人转铁 蛋白受体（TfR）的抗体的重链可变结构域的决定与抗原的互补性的区 域（“CDR”：互补决定区）（CDR-H）或轻链可变结构域的决定与抗 原的互补性的区域（CDR-L）。

“分子构建物”是指任何构建物（例如，分子、抗体或抗体片段 等等），其可以由本领域技术人员制备并且包含本申请中所定义的氨 基酸序列SEQ ID NO:1至36中的任何一个。

更具体地，本发明的分子构建物由选自下列的氨基酸序列中的至 少一个构成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID  NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO: 36。

更具体地，如此定义的序列相应于位于在靶向人转铁蛋白受体 （TfR）的抗体的每条重链中编号为3的位置处（CDR3-H）或在靶向人 转铁蛋白受体（TfR）的抗体的每条轻链中编号为3的位置处（CDR3-L） 的CDR。

更具体地，序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:33相应于“CDR3-H”， 和序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:36相应于“CDR3-L”。

根据本发明，所述分子构建物的序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 36中的至少一个包含在选自下列的氨基酸序列之一中：SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、 SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48，

所述序列SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:48中的每一个相应于靶 向人转铁蛋白受体（TfR）的抗体的重链可变结构域（VH）或轻链可变 结构域（VL），

所述序列SEQ ID NO:37包含序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:3，

所述序列SEQ ID NO:38包含序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:6，

所述序列SEQ ID NO:39包含序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和SEQ ID NO:9，

所述序列SEQ ID NO:40包含序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11 和SEQ ID NO:12，

所述序列SEQ ID NO:41包含序列SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14 和SEQ ID NO:15，

所述序列SEQ ID NO:42包含序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17 和SEQ ID NO:18，

所述序列SEQ ID NO:43包含序列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20 和SEQ ID NO:21，

所述序列SEQ ID NO:44包含序列SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23 和SEQ ID NO:24，

所述序列SEQ ID NO:45包含序列SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26 和SEQ ID NO:27，

所述序列SEQ ID NO:46包含序列SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29 和SEQ ID NO:30，

所述序列SEQ ID NO:47包含序列SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32 和SEQ ID NO:33，

所述序列SEQ ID NO:48包含序列SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35 和SEQ ID NO:36。

同样地，根据本发明，序列SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:48中 的至少一个包含在选自下列的氨基酸序列之一中：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ  ID NO:54，

所述序列SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:54中的每一个包含靶向 人转铁蛋白受体（TfR）的抗体的重链可变结构域（VH）和轻链可变结 构域（VL），

所述序列SEQ ID NO:49包含通过具有氨基酸序列SEQ ID NO:109 的连接肽彼此相连接的序列SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，

所述序列SEQ ID NO:50包含通过连接肽SEQ ID NO:109彼此相 连接的序列SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40，

所述序列SEQ ID NO:51包含通过连接肽SEQ ID NO:109彼此相 连接的序列SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42，

所述序列SEQ ID NO:52包含通过连接肽SEQ ID NO:109彼此相 连接的序列SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44，

所述序列SEQ ID NO:53包含通过连接肽SEQ ID NO:109彼此相 连接的序列SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46，

所述序列SEQ ID NO:54包含通过连接肽SEQ ID NO:109彼此相 连接的序列SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48。

上面提及的不同序列SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:48也可以通 过具有不同于SEQ ID NO:109的序列的肽彼此相连接。

如果例如减小连接肽的大小，则可获得“双抗体”类型的分子， 然而，也可以考虑增加连接肽的大小。

序列SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:54中的每一个包含靶向人转 铁蛋白受体（TfR）的抗体的整个重链可变结构域和整个轻链可变结构 域。

序列SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47中的每一个定义靶向人转铁蛋 白受体（TfR）的抗体的整个重链可变结构域（VH）。

序列SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:48中的每一个定义靶向人转铁蛋 白受体（TfR）的抗体的整个轻链可变结构域（VL）。

SEQ ID NO:1-3、7-9、13-15、19-21、25-27和31-33中的每一 个定义靶向人转铁蛋白受体（TfR）的抗体的重链可变结构域的决定与 抗原的互补性的区域（CDR-H）。

SEQ ID NO:4-6、10-12、16-18、22-24、28-30和34-36中的每 一个定义靶向人转铁蛋白受体（TfR）的抗体的轻链可变结构域的决定 与抗原的互补性的区域（CDR-L）。

因此，序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:54涉及靶向人转铁蛋白 受体（TfR）的抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的整体或 仅一部分。

根据本发明的一个有利的实施方案，如上面所定义的分子构建物 以单体的形式存在。

根据本发明的另一个有利的实施方案，如上面所定义的分子构建 物以二聚体的形式存在。

根据本发明的另外一个有利的实施方案，如上面所定义的分子构 建物还包含Fc片段。

优选地，根据本发明，如上面所定义的分子构建物更特别地为抗 体或抗体片段。

更准确地，本申请中所定义的序列SEQ ID NO:49至SEQ ID NO: 54定义抗体片段而非“完整的”抗体，因为这些序列不包含在天然抗 体（免疫球蛋白）中发现的恒定结构域。

一般地，一种抗体以其重链可变结构域（VH）和轻链可变结构域 （VL）的一级序列而区别于另一种抗体。对于给定类或亚类的抗体， 恒定结构域的序列是相同的。

因此，为了完全准确，用于定义本发明目标的在上面和下面所使 用的术语“抗体”应当更特别地理解为“抗体片段”。

本发明的抗体或抗体片段全都特异于TfR，但不具有相同的一级 序列（参见SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:54）。所述抗体通过其互 补位（即抗原（在该情况下，TfR）上的表位的接触区域）而相区别。

本发明的目标还在于核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列 分别编码如在上面所定义的氨基酸序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:36， 并且所述核苷酸序列分别由序列SEQ ID NO:55至SEQ ID NO:90来 表示。

因此，SEQ ID NO:55表示编码氨基酸序列SEQ ID NO:1的核苷 酸序列，依此类推（SEQ ID NO:56编码SEQ ID NO:2，SEQ ID NO: 57编码SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:58编码SEQ ID NO:4，SEQ ID NO: 59编码SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:60编码SEQ ID NO:6，SEQ ID NO: 61编码SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:62编码SEQ ID NO:8，SEQ ID NO: 63编码SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:64编码SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:65编码SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:66编码SEQ ID NO:12， SEQ ID NO:67编码SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:68编码SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO:69编码SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:70编码SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:71编码SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:72编码 SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:73编码SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:74 编码SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:75编码SEQ ID NO:21，SEQ ID NO: 76编码SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:77编码SEQ ID NO:23，SEQ ID  NO:78编码SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:79编码SEQ ID NO:25， SEQ ID NO:80编码SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:81编码SEQ ID NO: 27，SEQ ID NO:82编码SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:83编码SEQ ID  NO:29，SEQ ID NO:30编码SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:31编码 SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:32编码SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:33 编码SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:34编码SEQ ID NO:88，SEQ ID NO: 35编码SEQ ID NO:89，和SEQ ID NO:36编码SEQ ID NO:90）。

本发明的目标还在于核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列 分别编码如在上面所定义的氨基酸序列SEQ ID NO:37至SEQ ID NO: 48，并且所述核苷酸序列分别由序列SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:102 来表示。

因此，SEQ ID NO:91表示编码氨基酸序列SEQ ID NO:37的核 苷酸序列，依此类推（SEQ ID NO:92编码SEQ ID NO:38，SEQ ID NO: 93编码SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:94编码SEQ ID NO:40，SEQ ID  NO:95编码SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:96编码SEQ ID NO:42， SEQ ID NO:97编码SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:98编码SEQ ID NO: 44，SEQ ID NO:99编码SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:100编码SEQ ID  NO:46，SEQ ID NO:101编码SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:102编码 SEQ  ID NO:48）。

本发明还涉及核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列分别编 码如在上面所定义的氨基酸序列SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:54， 并且所述核苷酸序列分别由序列SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:108 来表示，

所述SEQ ID NO:103包含通过具有核苷酸序列SEQ ID NO:110 的连接肽彼此相连接的序列SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92，

所述SEQ ID NO:104包含通过SEQ ID NO:110彼此相连接的序 列SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94，

所述SEQ ID NO:105包含通过SEQ ID NO:110彼此相连接的序 列SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96，

所述SEQ ID NO:106包含通过SEQ ID NO:110彼此相连接的序 列SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98，

所述SEQ ID NO:107包含通过SEQ ID NO:110彼此相连接的序 列SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100，

所述SEQ ID NO:108包含通过SEQ ID NO:110彼此相连接的序 列SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102，

SEQ ID NO:103表示编码氨基酸序列SEQ ID NO:49的核苷酸序 列，依此类推（SEQ ID NO:104编码SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:105 编码SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:106编码SEQ ID NO:52，SEQ ID NO: 107编码SEQ ID NO:53，和SEQ ID NO:108编码SEQ ID NO:54）。

本发明还涉及分离的核酸分子，其包含如在上面所定义的核苷酸 序列SEQ ID NO:55至SEQ ID NO:108中的至少一个。

同样地，本发明的目标还在于：

-表达载体，其包含如在上面所定义的核酸分子，

-宿主细胞或生物，其包含如在上面所定义的表达载体。

本发明的另一个目标在于药物组合物，其包含治疗有效量的至少 一种如在上面所定义的分子构建物，以及与之相联合的药学上可接受 的载体。

如上面所描述的，所述分子构建物优选地为抗体或抗体片段。

根据一个有利的实施方案，在所述药物组合物中，所述分子构建 物用于定向运载一个（或多个）生物学活性分子。

本发明的抗体具有内化特性（参见实施例I），该内化特性使得 它们成为对于发挥用于将所述生物活性分子递送至过表达TfR的癌细 胞内的载体的作用来说令人感兴趣的工具。

根据另一个有利的实施方案，在所述药物组合物中，所述分子构 建物用于装载有一个（或多个）细胞毒性试剂和/或一个（或多个）具 有诊断目的的试剂的脂质体（形成“免疫脂质体”）或纳米颗粒的靶 向。

本发明还涉及如在上面所定义的药物组合物，其用于在呈现出 TfR过表达的病理学状态的治疗中作为药物的应用。

作为呈现出TfR过表达的病理学状态的例子，可以提及癌症，特 别是淋巴瘤或白血病类型的癌症。

根据本发明的一个有利的实施方案，针对癌症的治疗更特别地如 此来进行：

-通过本发明的抗体在体外和/或在体内对于癌细胞的抗增殖和 细胞毒性作用，

和/或

-通过本发明的抗体对于癌细胞死亡的诱导（经由使它们丧失 铁）。

本发明的目标还在于，用于抑制癌细胞的细胞增殖和/或诱导所述 细胞的死亡的方法，其特征在于，所述方法包括向患者施用至少选自 下列的物质：

-如在上面所定义的分子构建物，

-如在上面所定义的药物组合物，

以便使所述物质结合至所述癌细胞，并因此造成增殖的抑制和/ 或诱导癌细胞的死亡。

本发明的另一个目标在于治疗癌症的方法，其特征在于，所述方 法包括向患者施用至少选自下列的物质：

-如在上面所定义的分子构建物，

-如在上面所定义的药物组合物，

以便使所述物质结合至癌细胞的转铁蛋白受体，并因此造成增殖 的抑制和/或诱导癌细胞的死亡。

作为癌细胞的例子，可以提及造血系统来源的细胞。

呈现出TfR过表达的病理学状态的另一个例子为自身免疫性病理 学状态的例子。

这是因为，在该特定情况下，正是细胞效应子呈现出TfR过表达。

图1显示了命名为“scFv-3TF12”的本发明的单价片段的重链可 变结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）的氨基酸序列（SEQ ID NO:49） 和核苷酸序列（SEQ ID NO:103），其中重链和轻链通过连接肽彼此 相连接。

每个在上面的行表示SEQ ID NO:49，和每个在下面的行表示SEQ  ID NO:103。

序列SEQ ID NO:49的重链的3个“CDR”区（CDR1-H至CDR3-H： SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3）和轻链的3个“CDR”区（CDR1-L至 CDR3-L：SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6）加了框并以粗体表示。

重链（VH）包括第1位氨基酸至第119位氨基酸（SEQ ID NO:37）。

轻链（VL）包括第135位氨基酸至第245位氨基酸（SEQ ID NO:38）。

连接肽（SEQ ID NO:109）包括第120-134位的15个氨基酸，其 被表示为斜体并加有下划线（S G G G G S G G G G S G G G G）。

编码SEQ ID NO:109的核苷酸序列SEQ ID NO:110是斜体的， 加有下划线，并且为小写字母。

图2显示了命名为“scFv-3TF2”的本发明的单价片段的重链可变 结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）的氨基酸序列（SEQ ID NO:50） 和核苷酸序列（SEQ ID NO:104），其中重链和轻链通过连接肽彼此 相连接。

每个在上面的行表示SEQ ID NO:50，和每个在下面的行表示SEQ  ID NO:104。

序列SEQ ID NO:50的重链的3个“CDR”区（CDR1-H至CDR3-H： SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:9）和轻链的3个“CDR”区（CDR1-L至 CDR 3-L：SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:12）加了框并以粗体表示。

重链（VH）包括第1位氨基酸至第118位氨基酸（SEQ ID NO:39）。

轻链（VL）包括第134位氨基酸至第243位氨基酸（SEQ ID NO:40）。

连接肽（SEQ ID NO:109）如图1中所定义：它包括从第119至 133位氨基酸的15个氨基酸。

图3显示了命名为“scFv-3GH9”的本发明的单价片段的重链可变 结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）的氨基酸序列（SEQ ID NO:51） 和核苷酸序列（SEQ ID NO:105），其中重链和轻链通过连接肽彼此 相连接。

每个在上面的行表示SEQ ID NO:51，和每个在下面的行表示SEQ  ID NO:105。

序列SEQ ID NO:51的重链的3个“CDR”区（CDR1-H至CDR3-H： SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:15）和轻链的3个“CDR”区（CDR1-L 至CDR 3-L：SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:18）加了框并以粗体表示。

重链（VH）包括第1位氨基酸至第118位氨基酸（SEQ ID NO:41）。

轻链（VL）包括第134位氨基酸至第242位氨基酸（SEQ ID NO:42）。

连接肽（SEQ ID NO:109）如图1中所定义：它包括从第119至 133位氨基酸的十五个氨基酸。

图4显示了命名为“scFv-C 3.2”的本发明的单价片段的重链可变 结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）的氨基酸序列（SEQ ID NO:52） 和核苷酸序列（SEQ ID NO:106），其中重链和轻链通过连接肽彼此 相连接。

每个在上面的行表示SEQ ID NO:52，和每个在下面的行表示SEQ  ID NO:106。

序列SEQ ID NO:52的重链的3个“CDR”区（CDR1-H至CDR3-H： SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21）和轻链的3个“CDR”区（CDR1-L 至CDR3-L：SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:24）加了框并以粗体表示。

重链（VH）包括第1位氨基酸至第118位氨基酸（SEQ ID NO:43）。

轻链（VL）包括第134位氨基酸至第243位氨基酸（SEQ ID NO:44）。

连接肽（SEQ ID NO:109）如图1中所定义：它包括从第119至 133位氨基酸的15个氨基酸。

图5显示了命名为“scFv-3TG9”的本发明的单价片段的重链可变 结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）的氨基酸序列（SEQ ID NO:53） 和核苷酸序列（SEQ ID NO:107），其中重链和轻链通过连接肽彼此 相连接。

每个在上面的行表示SEQ ID NO:53，和每个在下面的行表示SEQ  ID NO:107。

序列SEQ ID NO:53的重链的3个“CDR”区（CDR1-H至CDR3-H： SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:27）和轻链的3个“CDR”区（CDR1-L 至CDR3-L：SEQ ID NO:28至SEQ ID NO:30）加了框并以粗体表示。

重链（VH）包括第1位氨基酸至第117位氨基酸（SEQ ID NO:45）。

轻链（VL）包括第133位氨基酸至第241位氨基酸（SEQ ID NO:46）。

连接肽（SEQ ID NO:109）如图1中所定义：它包括第118至132 位氨基酸。

图6显示了命名为“scFv-3GH7”的本发明的单价片段的重链可变 结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）的氨基酸序列（SEQ ID NO:54） 和核苷酸序列（SEQ ID NO:108），其中重链和轻链通过连接肽彼此 相连接。

每个在上面的行表示SEQ ID NO:54，和每个在下面的行表示SEQ ID NO:108。

序列SEQ ID NO:54的重链的3个“CDR”区（CDR1-H至CDR3-H： SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:33）和轻链的3个“CDR”区（CDR1-L 至CDR3-L：SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:36）加了框并以粗体表示。

重链（VH）包括第1位氨基酸至第119位氨基酸（SEQ ID NO:47）。

轻链（VL）包括第135位氨基酸至第243位氨基酸（SEQ ID NO:48）。

连接肽（SEQ ID NO:109）如图1中所定义：它包括从第120至 134位氨基酸的15个氨基酸。

图7图解说明了序列SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:54的本发明 的六种抗体（如前面所定义并且在前面的图1至6中所描述的）对于 TfR的特异性。

将LS-174T细胞与不同浓度的全转铁蛋白（Sigma）以所示浓度于 4℃温育一小时。

抗-TfR scFv噬菌体或特异于受体ErBb2（其存在于LS-174T细胞 上）的对照scFv-F5噬菌体的结合，借助于针对噬菌体衣壳的蛋白p8 的小鼠抗体（抗-M13,GE healthcare）来定量，然后借助于识别小鼠 免疫球蛋白的荧光抗体通过FACS来测量。

MFI（%）信号表示相对于在竞争者转铁蛋白不存在下所获得的MFI 而言的平均荧光强度（MFI）。

图8显示了序列SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:54的本发明的六 种抗-TfR抗体（抗-TfR scFv）的表位的表位图谱绘制。

将过表达TfR的肿瘤细胞LS-174T在10μg/ml的可溶性抗-TfR 抗体或针对肉毒杆菌毒素的对照抗体（Bot）存在下于4℃温育一小时。 然后，向所述细胞添加10¹¹ cfu/ml的抗体噬菌体（scFv噬菌体）并 且于4℃保持一小时。

抗-TfR scFv噬菌体或特异于受体ErBb2的对照scFv-F5噬菌体 的结合，以与在图7中所描述的同样的方式来进行定量。

MFI（%）信号表示相对于在竞争者抗体不存在下所获得的MFI而 言的平均荧光强度（MFI）。

图9图解说明了本发明的六种抗体“抗-TfR scFv”对于Tf/TfR 结合的抑制。

在浓度为20μg/ml的抗-TfR scFv抗体存在下，将LS-174T细胞 于4℃温育一小时。备选地，使用非特异于TfR的scFv抗体（Bot）， 或者在仅PBS中进行温育。然后，添加500nM的荧光全转铁蛋白 （Tf-FITC）并且于4℃保持一小时。在洗涤后，通过FACS来测量与 所述细胞结合的Tf-FITC。信号被表示为相对于在没有抗体（PBS）时 进行温育的细胞的MFI而言的MF I的百分比。

图10图解说明了在本发明的六种抗体“抗-TfR scFv”存在下， 在3天期间在Jurkat系（来自于人T淋巴瘤）上的增殖测试。

图11图解说明了在抗-TfR scFv（即3TF12和3GH7）存在下，在 数种造血癌性系上的生存力测试。

图10和11：在包含10μg/ml的可溶性抗体的RPMI培养基/SVF 10% 中，以六次重复，用5000个Jurkat细胞/孔接种96孔平板。将所述 细胞于37℃在具有5%CO₂的潮湿的室中温育3天。借助于MTT测试 （CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）来定量活细胞的数目。

图12（参见图12-a、12-b、12-c和12-d）图解说明了在所述抗 体的单价形式3TF12和3GH7转变成二价形式F12CH和H7CH的过程中 获得的结果。

图12-a和12-b：从由Bin Liu（UCSF）提供的细菌表达载体 pSYN-HIS-CYS开始产生二价scFvCH抗体（即F12CH和H7CH）。更具 体地，图12-a显示了Superdex 75 FPLC色谱图，其显示了通过Ni-NTA 亲和层析进行纯化的抗体的凝胶过滤洗脱谱线。图12-b显示了在凝胶 过滤后分离出的二聚体抗体级分（在位于1500秒的峰处的大约55kDa 的级分）的在SDS-PAGE凝胶上的分析，在还原（+DTT）或非还原（-DTT） 条件下。

图12-c和12-d：用于抑制全-Tf与Raji细胞的结合的所述抗体 的二聚体形式或单体形式的比较。将Raji细胞与单价（图12-c）或 二价（图12-d）抗体以所示浓度于4℃温育一小时。然后，向所述细 胞添加500nM的全-Tf-FITC并且于4℃保持一小时。在洗涤后，通过 FACS来测量荧光。

图13图解说明了二价形式的抗增殖效应。

图13-a：在10μg/ml的二价可溶性抗体存在下，使数种造血系 统来源的细胞系温育数天。借助于MTT测试（CellTiter 96 Aqueous One  Solution Cell Proliferation Assay,Promega）（OD 490nm）来定 量细胞生存力。

图13-b：将ERY-1细胞与单价的（左边）或二价的（右边）可溶 性抗-TfR抗体以所示浓度温育三天。通过MTT测试来定量生存力。

图14图解说明了抗-TfR F12CH和H7CH对于Raji和ERY-1系的 细胞死亡的诱导。

更具体地，图14-a图解说明了磷脂酰丝氨酸易位的标记。将Raji 系（上方的图）和ERY-1系（下方的图）用10μg/ml的抗体F12CH、 H7CH和阴性对照Bot分别处理4天和2天。将细胞进行洗涤，然后用 碘化丙锭（PI）和膜联蛋白-V-FITC进行标记。阴性PI且阳性膜联蛋 白-V标记相应于凋亡的细胞，而阳性PI且阳性膜联蛋白-V标记相应 于坏死的细胞。

图14-b图解说明了线粒体膜去极化的标记。将Raji细胞系（上 方的图）和ERY-1细胞系（下方的图）以与14-a中相同的方式进行处 理。在洗涤后，将所述细胞用3,3'-二己基氧杂羰花青（DIOC6）进行 标记。荧光强度的下降与线粒体电位的下降相关。

图15图解说明了抗-TfR F12CH和H7CH的作用机制。

在图15-a的左图中，在500nM的Tf-FITC存在下，将经固定的 或未固定的Raji细胞于37℃或4℃温育三小时。在洗涤后，通过FACS 来测量荧光。

图15-a的右图：将Raji细胞与抗体以所示浓度于37℃温育一小 时，在这之后在500nM的Tf-FITC存在下温育3小时。在洗涤后，通 过FACS来测量荧光。

图15-b的左图：将Raji细胞与浓度为10μg/ml的抗体温育4 天。然后，在甘氨酸缓冲液（甘氨酸50mM,NaCl 500mM,pH 2.8） 中洗涤所述细胞，在这之后进行固定并且用Tf-FITC（500nM）进行 标记，于37℃3小时。

图15-b的右图：将Raji细胞与10μg/ml的抗体温育4天。然 后，借助于裂解缓冲液（Tris-HCl pH 7.550mM,NaCl 250mM,EDTA pH 8 10mM,DTT 1mM,NP401%,蛋白酶抑制剂（Roche））来获得 蛋白质提取物。在SDS-PAGE上进行迁移后，将蛋白质转移到硝酸纤维 素膜上。借助于抗-TfR的小鼠抗体（Zymed）和抗-α-肌动蛋白的山 羊抗体（Santa-Cruz）来定量TfR和肌动蛋白（后者充当凝胶载荷对 照）的表达。用两种与酶HRP相偶联的抗体（其识别对于TfR的小鼠 免疫球蛋白和对于肌动蛋白的山羊免疫球蛋白）来进行检测。

图15-c的左图：在所示浓度的柠檬酸铁铵（FAC）存在下，将Raji 细胞用10μg/ml的抗体F12CH或Bot处理4天。然后，洗涤所述细 胞，并且以与前面相同的方式来获得蛋白质提取物。在SDS-PAGE凝胶 上进行迁移并转移到膜上后，借助于抗-TfR的小鼠抗体（Zymed）来 定量TfR，和借助于抗-α-微管蛋白的小鼠抗体（Santa-Cruz）来定 量α-微管蛋白（凝胶载荷对照）。

图15-c的右图：在25μM的柠檬酸铁铵（FAC）或硫酸锌（ZnSO4） 存在下，用5μg/ml的抗体处理ERY-1细胞。借助于MTT测试 （CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）来定量细胞生存力。

图16图解说明了抗体F12CH的体内研究。

图16-a：以4Gy对无胸腺裸鼠进行辐射，在这之后向每只动物 皮下注射2百万个ERY-1细胞。一旦肿瘤达到200mm³的平均体积， 就将这些小鼠分配在三只笼中，每只笼包含五只小鼠。然后，在与在 J₀时肿瘤的定位位点相对的一侧向每只小鼠通过腹膜内途径每周两次 注射200μl体积的PBS或包含200μg抗体的PBS。借助于游标卡尺 根据下式来测量肿瘤生长：体积=(π/6)x(长+宽)³。在J₂₅时处死小 鼠。用Mann-Whitney检验来分析组之间的平均值的差异（*表明 p<0.01，**表明p<0.005）。

图16-b：在取出后，将肿瘤固定，然后用苏木精-伊红-藏红花色 素（HES）进行标记。

图16-c：将FMA3、P815（源自鼠类肥大细胞瘤的P815和FMA3 系）和ERY-1细胞与生物素化的小鼠全转铁蛋白（Tfm）（Rockland） 以所示浓度于4℃温育一小时。借助于与藻红蛋白相偶联的链霉抗生 物素蛋白（BD Pharmingen）来检测Tfm与细胞的结合。在洗涤后，通 过FACS来测量荧光。

图16-d的左图：将FMA3细胞与浓度为50μg/ml的抗体3TF12 （单体的）或抗体Bot于4℃温育一小时。所述抗体与细胞的结合借 助于针对抗体3TF12和Bot的myc标签的二抗（抗c-myc，Sigma）， 然后借助于与藻红蛋白相偶联的抗小鼠免疫球蛋白的抗体（BD  Pharmingen）来进行测量。在洗涤后，通过FACS来测量荧光。实心的 灰色曲线相应于Bot标记的荧光，而透明的曲线相应于3TF12标记的 荧光。

图16-d的右图：将FMA 3细胞与浓度为50μg/ml的抗体F12CH （二聚体的）或抗体Bot于4℃温育一小时。所述抗体与细胞的结合 借助于针对抗体F12CH和Bot的组氨酸标签的二抗（五-His抗体， Qiagen），然后借助于与藻红蛋白相偶联的抗小鼠免疫球蛋白的抗体 （BD Pharmingen）来进行测量。在洗涤后，通过FACS来测量荧光。 实心的灰色曲线相应于Bot标记的荧光，而透明的曲线相应于F12CH 标记的荧光。

图17显示了在用F12CH处理的人血单核细胞（PBMC）上的增殖测 试。将所述细胞以2×10⁴个细胞/孔接种在补充有IL2（50ng/ml）的 RPMI培养基,10%SVF中。所述细胞用抗体Bot或F12CH（在细菌中 产生的二聚体形式）以所示浓度处理3天。借助于MTT测试（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay,Promega） 来测量生存力（OD 490nm）。

图18显示了抗体Bot-Fc和F12-Fc的scFv-Fc形式的研究。

图18(a)：在还原和非还原条件下，关于抗体Bot-Fc和F12-Fc 的纯化的在SDS-PAGE凝胶上的分析。每个凝胶孔中放置1μg的抗体。

图18(b)：通过抗体Bot-Fc（灰色）和F12-Fc（黑色）来进行 的人HMC1.2细胞（左边）和鼠类Ba/F 3细胞（右边）的膜标记。将所 述细胞与10μg/ml的所述抗体于4℃温育1小时。借助于针对人Fc 片段并且与藻红蛋白相偶联的二抗（Rockland）来检测所述scFv-Fc 与细胞的结合。

图18(c)：两种形式的scFv抗体相比于scFv-Fc抗体的对于 HMC1.2系的增殖的效应的测试。将HMC1.2细胞（104/孔，以六次重复） 接种在具有10μg/ml的所述抗体（要么以scFv形式，要么以scFv-Fc 形式）的RPMI培养基,10%SVF中。在6天（scFv，左图）和4天（右 图）结束时通过MTT 测试（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell  Proliferation Assay,Promega）来测量细胞生存力（OD 490nm）。

图19显示了ERY-1细胞对于抗体F12的scFv-Fc二价形式的敏感 性的评价。在包含0.001、0.01、0.1、1或10μg/ml的可溶性抗体 的RPMI培养基/SVF 10%中，以六次重复用4000个细胞/孔对96孔平 板进行接种。将所述细胞于37℃在具有5%CO₂的潮湿的室中温育4天。 借助于MTT测试（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell  Proliferation Assay,Promega）来定量活细胞的数目。将结果表示 为相对于没有抗体的对照而言的生存力的%。

图20显示了在抗体3TF12存在下UT-7系的增殖的抑制。在包含 0、1或10μg/ml的可溶性抗体的IMDM培养基/SVF 10%/2U/mL促 红细胞生成素中，以六次重复用4000个细胞/孔对96孔平板进行接种。 将所述细胞于37℃在具有5%CO₂的潮湿的室中温育4天。借助于MTT 测试（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）来定量活细胞的数目。结果代表了依照所应用的抗体浓度而 变化的在490nm处的吸光度值。

下面的实施例举例说明了本发明，它们无论如何不是要限制本发 明。

实施例I：产生自功能选择的六种不同的抗-TfR抗体

在体外通过噬菌体展示以scFv形式（单链可变区片段形式）获得 了抗-TfR抗体，并且就其被特异性地内吞（内化）到乳腺肿瘤细胞 （SKBR3）内的能力进行了选择。

该选择使得能够获得各具有28kDa的分子量的6种抗体，分别命 名为3TF12（SEQ ID NO:49）、3TF2（SEQ ID NO:50）、3GH9（SEQ  ID NO:51）、C3.2（SEQ ID NO:52）、3TG9（SEQ ID NO:53）和 3GH7（SEQ ID NO:54）。

这些单链可变区片段（scFv）也称为单价片段，并且表示单体形 式。

本发明的抗体特异于TfR：通过全转铁蛋白的存在，以剂量依赖 性方式抑制了每种抗-TfR scFv噬菌体的结合（图7）。它们识别邻近 的或共同的表位：通过可溶性抗-TfR scFv的存在，抑制了每种抗-TfR  scFv噬菌体的结合（图8）。它们叠盖住全转铁蛋白（全-Tf）与TfR 的结合位点：每种抗-TfR scFv或多或少显著地抑制全-Tf与TfR的结 合，其中对于3TF12和3GH7出现最大抑制（图9）。

实施例II：所述抗-TfR抗体的抗增殖效应和其作用机制的研究

造血系统来源的癌细胞具有高的对铁的需求。在六种抗-TfR scFv 存在下，在3天期间，在从T急性淋巴细胞白血病发展出的Jurkat 系上进行增殖测试。

仅抗体3TF12和3GH7对于Jurkat系具有弱的但可重现的抗增殖 活性（图10）。

对于Jurkat系具有抗增殖效应的抗体，即3TF12和3GH7，也是 最好地抑制Tf与TfR的结合的那些抗体。

为了确定该抗增殖效应是所述抗体所特有的，还是所使用的细胞 系的来源所特有的，在10μg/ml的抗体3TF12或3GH7存在下，在数 天期间测试了五种其他造血系统来源的癌系的生存力（图11）。

依赖于所测试的细胞类型，观察到明显的抗增殖效应（对于Raji 系和ERY-1系，直至80%的抑制）。

单体形式的所述抗体变为二聚体形式（F12CH，对于3TF12；和 H7CH，对于3GH7）使得能够增加所述抗体对于TfR的亲和力：所述抗 体的二价形式改善了对于Tf结合到TfR上的抑制（图12-a至12-d）。 改善了抗增殖效应。

二聚体或二价的可变区片段的分子量为大约55kDa。

这种形式改变使得能够增强单价scFv对于所有所测试的系的抗 增殖效应（图13），以及降低关于每种抗体的IC₅₀（表1）。

表1：通过于在抗体（以单体或二聚体形式）存在下温育三天的ERY-1 系之上的增殖测试，对于每种抗体所获得的IC₅₀的比较。

抗体的二价形式改善了抗-TfR 3GH7和3TF12的抗增殖效应。在 所有所测试的系上都观察到了该效应（图13）。

此外，抗-TfR F12CH和H7CH诱导通过凋亡的（对于ERY-1系)或 通过自噬的（对于Raji系）细胞死亡（图14）。

这是因为，对于ERY-1系，所述抗-TfR引起通过线粒体途径的凋 亡类型的细胞死亡的触发。至于Raji系，在处理后观察到磷脂酰丝氨 酸易位，而没有线粒体电位的下降。此外，经处理的细胞的粒性增加 （图14-a，上方），这意味着，对于该系来说，该细胞死亡现象与自 噬过程相关。

然后，本发明的发明人发现了负责这些抗体的细胞毒性的作用机 制。

由于知道所述抗体在4℃下抑制Tf与TfR的结合，因而发明人希 望确定该抑制在37℃下是否得到保持。以这种方式，可能知晓在动力 学情形下全-Tf的内化是否被二价的抗-TfR所阻断。

首先,在37℃下温育三小时后定量与细胞相关联的Tf-FITC（图 15-a的左图）。为了区别关于经内化的Tf-FITC的信号与简单地结合 在表面上的Tf-FITC的信号，对于预先在固定溶液（即时制备的4%低 聚甲醛或商购的固定溶液，BD）中进行温育的细胞重做相同的实验。 当细胞被固定时，观察到相对于未固定的细胞而言50%的信号减少。 因此，与细胞相关联的荧光的一部分相应于细胞内定位。当将细胞预 先与各种不同浓度（0.2至20μg/ml）的F12CH或H7CH进行温育时， 观察到信号的剂量依赖性抑制。

该结果使得能够作出结论：抗体F12CH和H7CH有效地阻断全-Tf 内化到细胞中。

然后，发明人希望确定抗体F12CH和H7CH固着在癌细胞上是否导 致TfR表达水平的改变。

为此，将Raji细胞与10μg/ml的抗-TfR F12CH或H7CH温育4 天。然后，在甘氨酸缓冲液（pH 2）中洗涤所述细胞以去除结合至细 胞表面的scFv抗体，随后与Tf-FITC进行温育以定量在细胞表面上 TfR的膜表达（图15-b的左图）。

看到经处理的细胞过表达TfR。当从相同的细胞开始来获得蛋白 质提取物并且通过Western印迹来分析TfR的表达时（图15-b的右 图），相比于对照提取物而言，在经处理的提取物中也发现了该过表 达。因此，存在TfR表达的总体增加。

TfR的表达由存在于TfR的mRNA上的IRE（铁离子应答元件）基 序的存在来进行调控，所述I RE基序在细胞中的铁浓度低时使所述TfR 的mRNA稳定。相反地，在铁过量的情况下，TfR的mRNA被降解，并 且不再合成TfR（Daniels等人,The transferrin receptor part I  or part II,Clin Immunol.,2006）。

由于该原因，发明人希望确定，在抗体F12CH或H7CH作用后所观 察到的TfR过表达是与由所述抗体诱导的铁耗竭有关，还是与其他机 制相关。

为此，在培养基中各种不同浓度的可溶性铁（FAC，柠檬酸铁铵） 存在下，将Raji细胞用对照抗体Bot和抗体F12CH处理4天（图15-c 的左图）。

看到在所述两种情况（Bot和F12CH）下，铁的存在均抑制TfR 的表达，这证明对于F12CH所观察到的TfR过表达的确与通过阻断转 铁蛋白的内吞而诱导的铁耗竭有关。

最后，发明人希望确定所述抗体的细胞毒性是否与它们所诱导的 铁耗竭有关。将最敏感的细胞系（ERY-1）在补充有金属阳离子（铁或 锌，后者用作阴性对照）的抗体的存在下处理3天，并借助于MTT测 试来定量细胞生存力（图15-c的右图）。看到外源提供可溶性铁解除 了所述抗体的细胞毒性。

总之，在F12CH作用后所观察到的由细胞进行的TfR过表达的确 与由F12CH诱导的铁耗竭有关。

相比于先前所描述的其他抗-TfR的小鼠抗体的作用方式而言，该 机制特性是独特的。这是因为，与本发明的抗体相反，这些其他抗-TfR 的小鼠抗体需要多价形式以发挥其细胞毒性作用，这种细胞毒性作用 与在膜范围内TfR的表达减少相关（IgG A24（Lepelletier等人, Cancer Res 67:1145,2007；Moura等人,Blood 103:1838,2004）， IgA 42/6（Taetle等人,Cancer Res 46,1759-63,1986）,“融合 有抗生物素蛋白的IgG3”（Ng等人,Blood 108,2745-54,2006）， IgM R17208（Lesley和Schutle,Mol Cell Biol 5,1814-21,1985））。

因此，发明人已经可以确定，本发明的抗体诱导细胞的铁耗竭， 其结果是细胞表面上的铁受体（TfR）增加。

然而，该信息本身不足以确定本发明的抗体对于哪些细胞系将会 是有活性的，因为不可能确定细胞系是否对铁丧失敏感。这是因为， 不知道或强或弱的对于铁丧失的敏感性的原因，并且它们特别地不依 赖于在表面上的受体水平（参见前面提及的文献D3的图2C）。

实施例III：异种移植的人肿瘤的鼠类模型的研究

在前面的实施例中已显示，抗体F12CH和H7CH在体外对于数种造 血系统来源的细胞系具有显著的抗癌活性。

为了确定抗体F12CH的该抗癌活性在体内肿瘤环境中是否得到保 持，从ERY-1细胞系开始在裸鼠中形成了皮下异种移植物模型。一旦 实现了移植物的获得（200mm³的平均肿瘤体积），就每周两次给每只 动物注射200μg的抗体F12CH或Bot。

在25天期间测量肿瘤生长，并将其显示在图16-a中。

看到相比于对照载体（注射仅PBS缓冲液）和同种型对照（注射 在相同条件下产生的非特异性抗体）而言，抗体F12CH减缓了肿瘤生 长。

在经治疗的小鼠的肿瘤切片中（图16-b），可以注意到纤维化和 坏死前细胞的存在。

所观察到的效应在生理学上是更加适切的，因为已证明，以10mM 左右的浓度存在于宿主中的鼠类全-Tf对于人TfR具有交叉反应性（图 16-c），并且抗体F12CH具有与存在于某些宿主细胞上的小鼠TfR的 交叉反应性（图16-d）。

因此，用于测试这些抗体的动物模型反映了一部分可能的相互作 用，其在人中施用抗体F12CH期间可能会发生。

重要的是注意，以所使用的形式，抗体F12CH没有Fc片段，并因 此不能募召免疫系统的效应子以引起ADCC（依赖抗体的细胞毒性）或 CDC（依赖补体的细胞毒性）类型的抗肿瘤应答，这表明所观察到的效 应是所述抗体的作用方式所特有的。

因此，其特殊的细胞毒性方式（即不依赖于ADCC或CDC类型的抗 体的天然效应子功能并且与靶细胞表面上TfR的增加相关的细胞毒 性）使得本发明的抗体作为用于治疗癌症的具有高潜力的治疗性抗体 是特别有利的。

实施例IV：所述抗体对于激活的血单核细胞的增殖的效应

对于自身免疫性疾病或者对于移植（作为针对移植物排斥的预防 性疗法），测试了以二价形式的抗体3TF12和3GH7。

TfR/CD71在T细胞表面上的表达在T淋巴细胞的激活和增殖维持 中起着必不可少的作用。在自身免疫性疾病中或者在移植物排斥或移 植物抗宿主反应的预防中，可以使用抗-TfR的抑制性抗体作为免疫抑 制剂。

对于通过细胞因子IL-2激活的人血单核细胞（PBMC）的增殖，测 试了以scFvCH形式（二价的，50kD，在细菌中产生）的抗体3TF12 和3GH7的效应。

测试了抗体3TF12（抗-TfR）（F12CH）和Bot（非特异性的）的 在相同条件下获得的制备物（参见图17）。

在抗-TfR抗体F12存在下，观察到激活的PBMC的增殖的剂量依 赖性抑制。

应当注意，所述抗体在细菌中生产，并且在该纯化中的痕量的脂 多糖（LPS）可以解释在非特异性抗体Bot存在下PBMC的增殖的刺激。

因此，以二聚体形式scFvCH存在的抗体F12抑制外周淋巴细胞的 依赖于IL-2的增殖（50%的抑制，在10μg/mL的浓度下）并因而可 用作免疫抑制剂。

实施例V：以scFv-Fc形式的抗体的产生和对于各种不同细胞系的效 应

由发明人所使用的二价形式（scFv-CH）使得能够显著地改善起初 以单价形式3TF12和3GH7存在的所述抗体的抗增殖效应。然而，即使 该新的形式具有比标准形式scFv更高的分子量（55对28kD，大于肾 滤过的极限），但其在血清中的半寿期仅为几个小时，这远远小于IgG 同种型的完整抗体的半寿期（对于同种型IgG1、2和3，在人中的半 寿期为21至24天）。与不存在Fc片段相关的该低分子量可能大大地 限制所述抗体的血清稳定性和在体内的效力（即使观察到对于在小鼠 中的异种移植物模型的效应）。此外，除了与TfR的结合外，Fc片段 的存在还允许一方面募召补体级联的第一组分C1q并起始补体级联， 和另一方面与“天然杀伤”（NK）细胞和巨噬细胞上的Fc受体结合以 介导ADCC效应子功能。通过不依赖于铁耗竭的机制，这可以增加所述 抗体对于在其表面上表达高水平的TfR的细胞的细胞毒性活性。

以110kD scFv-Fc形式来制备抗体H7和F12，这意味着将scFv 片段与人IgG1的恒定结构域CH2和CH3的C-末端相融合。这样的蛋 白质自然地同源二聚体化从而形成大约110kDa（2×55kDa）的二价 分子。

为了获得以scFv-Fc形式的抗体，将scFv Bot、3TF12和3GH7 的VH和VL序列亚克隆到载体pFuse-hG1（描述于Moutel,S.等人, 2009.A multi-Fc-species system for recombinant antibody  production.BMC.Biotechnol.9,14）中，从而使得能够获得构建 物pFuse-hG1-Bot-Fc、pFuse-hG1-F12-Fc和pFuse-hG1-H7-Fc。该抗 体形式的表达通过转染CHO细胞来进行。因而，所述细胞将会在3天 期间将所述scFv-Fc分泌到培养基中。然后，将所述抗体通过A蛋白- 琼脂糖树脂来进行纯化，随后浓缩。

图18(a)图解说明了以scFv-Fc形式的抗体F12和Bot的产生。 在非还原条件下，检测到大约110kD的所述抗体的二聚体形式。通过 添加DTT，二硫桥被还原，并且单体形式迁移至55kD处，如所预期 的那样。

图18(b)显示，以scFv-Fc形式的抗体F12结合在HMC1.2细胞 （人肥大细胞瘤系）上并且与鼠类BaF/3细胞（鼠类pro-B造血谱系） 结合。作为对照，显示，针对肉毒杆菌毒素的抗体（Bot）与HMC1.2 细胞没有结合。

图18(c)显示，HMC1.2细胞的增殖被抗体scFv-F12-Fc以比相同 浓度的scFv-F12形式更高的强度所抑制。非特异性抗体（Bot）的两 种形式不具有任何效应。

用抗体H7获得了相同的生长抑制结果（在此未显示）。

图19显示，在ERY-1细胞上，IC₅₀小于0.1μg/mL的抗体F12。 因此，scFv-Fc形式与scFvCH二价形式（图13-b）一样有效（甚至更 有效）。

在UT-7系（一种人红白血病系）上测试了以scFv-Fc二价形式的 抗体F12。在10μg/mL的浓度下观察到抗体F12的强的抑制效应（70% 的抑制）（图20）。

总体结论

通过在噬菌体表面上展示抗体，就其通过由受体介导的内吞作用 被活癌细胞内吞的能力而选择出了六种不同的特异于转铁蛋白受体的 抗体，其识别TfR上的邻近表位并能够抑制TfR的天然配体（全转铁 蛋白）。该功能选择使得能够获得六种人的抗-TfR的单价抗体片段（抗 -TfR scFv），即分子量为大约28kD的单链可变区片段（scFv）。

在该选择中获得的六种功能性配体类型的抗体片段“抗-TfR  scFv”全都干扰与TfR结合的天然配体“全转铁蛋白（全-Tf）”，并 因此全都扰乱全-Tf与TfR的结合。

具有最大的对于TfR的亲和力的抗-TfR scFv片段，即3TF12（SEQ  ID NO:49）和3GH7（SEQ ID NO:54），抑制各种不同的造血癌细胞 系的增殖，并且具有特别令人感兴趣的抗癌特性。

通过制造具有经改善的亲和力的55kD的二价抗体形式（即F12CH 和H7CH），由于所述二价而改善了抗体3TF12和3GH7的细胞增殖抑 制潜力。

该形式改变（从单价的到二价的）使得能够改善关于每种抗体的 IC₅₀。

这些具有高亲和力的可内吞的抗体的细胞毒性机制不同于以前在 文献中所描述的抑制生长的鼠类抗-TfR单克隆抗体的细胞毒性机制。

这是因为，F12CH和H7CH诱导细胞表面范围内TfR的数目增加（而 不是通过增加其降解来降低之），同时大大地抑制全-Tf的细胞吸收 和诱导通过凋亡和/或自噬的细胞死亡。

这些特性使得能够定义一个完全人的抗-TfR的抗体片段的新家 族，其适合于依赖铁以持久地增殖并且表达大量TfR的肿瘤的免疫疗 法。

本发明的抗体产生自人抗体文库这一事实是非常有利的，因为它 们因此不需要人源化步骤以便将其向临床前开发转移。

本发明的六种抗体（无论以其单价还是二价形式）能够靶向略微 不同的表位（每个表位与天然配体Tf的结合位点共享基序）并且具有 不同的对于其靶标的亲和力。

可以证明在临床中这些抗体之一的交替使用是特别有利的，因为 这使得能够避免由治疗所引起的抗性现象。

本发明的抗体根据迄今从未描述过的独特机制起作用。它们通过 使癌细胞丧失铁来诱导癌细胞的细胞死亡，而不需要多价形式（其在 细胞表面上凝集TfR）。

另外，在所述抗体存在下在体外数天的温育导致细胞表面上的 TfR增加。如果该观察结果在体内重现，那么该独特的特性将会增加 待靶向的细胞的“可见度”。

在体内所使用的抗体形式为大约55kDa的二价的二聚体scFv的 形式。

为了增加本发明的抗体（不论以其单价还是二价形式）的抗肿瘤 特性，可以考虑通过添加Fc片段以获得完整抗体或者通过PEG化来对 所述抗体形式进行修饰，这使得能够增加所述抗体的半寿期时间。对 于scFv抗体F12和H7，已产生了scFv-Fc形式（110kDa），其中将 scFv与IgG1类型的人免疫球蛋白的Fc区相融合。该形式重现了在体 外以scFvCH形式的所述抗体的细胞毒性效应。此外，Fc区的存在还 可以使得能够募召免疫系统的效应子，并且可以增加所述抗体的抗肿 瘤效应。

因此，由于它们对于TfR的特异性、它们特殊的细胞毒性方式和 它们与其人来源相关的低免疫原性，本发明的抗体（不论以其单价还 是二价形式）经证明是用于治疗癌症的具有高潜力的治疗性分子。