黄蜀葵花提取物及其化学成分的新用途

摘要

本发明涉及黄蜀葵花提取物及其化学成分的新用途。具体地，本发明涉及式I化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、酯、前药，以及包含式I化合物的提取物，它们的组合物以及它们的用途。本发明化合物或提取物可用作抗氧化损伤剂，并可用于治疗或预防与氧化损伤有关的疾病或病症。

说明书

技术领域

本发明涉及中药化学领域，涉及一种从黄蜀葵花提取得到的黄酮类化合物，还涉及该黄酮化合物和包含该黄酮化合物的黄蜀葵花提取物的新用途，特别是用作抗氧化损伤剂的用途以及用于治疗或预防与氧化损伤有关的疾病或病症的用途。 

背景技术

氧化损伤是导致许多慢性病，如心血管病、癌症、肝病、糖尿病及衰老发生的重要因素。氧在生物体内通过单电子还原反应产生化学性质活泼的活性氧，参与机体的生理过程，对生物体的代谢和能量产生起着重要的作用。当活性氧存在时，超氧化物歧化酶会将其转化为氧，有效防止氧化损伤。但是由于过度活性氧存在，或机体自身消除活性氧能力不足，造成体内活性氧含量超过正常标准，引起蛋白质、核酸、脂质等过氧化，并造成生物体机能损伤，最总导致疾病的发生和不可逆的发展。 

尽管活性氧的半衰期很短，但由于其化学性质活泼，在短时期内可以与DNA反应，造成DNA核酸链断裂和氧化损伤，形成DNA交联。与蛋白质反应会使蛋白质变性，影响蛋白质的正常生理功能。与脂质反应造成生物膜损伤，形成生物膜功能性破坏，从而引起心血管病、癌症、肝病、糖尿病及衰老等慢性疾病。因此，控制体内过量活性氧形成与消除是现代生命科学领域的一项重要研究内容。 

氧化损伤导致的许多慢性疾病例如心血管病、癌症、肝病、糖尿病及衰老等是众所周知的。例如，廖端芳等(绞股蓝皂甙的抗氧化损伤作用I、对自由基损伤心血管功能的影响，廖端芳，等，衡阳医学院学报，1993年01期)公开了用离体豚鼠心乳头肌和离体兔主动脉自由基损伤模型，探讨了绞股蓝总皂甙对自由基损伤心血管功能的保护作用。结果发现绞股蓝皂甙(50mg/L)能对抗自由基所致的心肌收缩力降低、不应期缩短和自律性增加；并能降低心肌组织MDA含量，保护SOD活动和血管内皮释放EDRF的能力。 

陈吉海等(2型糖尿病微血管并发症与DNA氧化损伤的关系，陈吉海等，江苏医药，2009年03期)探讨了2型糖尿病(T2DM)合并微血管并发症患者的DNA氧化损伤。其方法是将87例T2DM患者分为糖尿病微血管并发症(A)组(n＝56)和T2DM无微血管并发症(B)组(n＝31)，另选65例正常体检者为正常对照(C)组。用ELISA方法测定血液单核细胞DNA氧化损伤指标-8羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)水平。结果A、B组血液8-OHdG水平均较C组显著升高；A组病程、24h尿白蛋白、血液8-OHdG水平也较B组显著升高，表明T2DM合并微血管并发症患者的DNA氧化损伤较正常对照及无并发症糖尿病患者 明显，对糖尿病合并微血管并发症者施行抗氧化治疗是合理的。此外，杨前勇等(糖尿病并发症治疗新策略：防护线粒体氧化损伤，杨前勇等，医学综述，2007年24期)综述了活性氧(ROS)引起的氧化损伤在糖尿病并发症的发病机制中起重要作用。线粒体ROS增加可能是糖尿病并发症发病的共同机制。因此，减少线粒体ROS生成及其引起的氧化损伤，为糖尿病并发症的防治提供了新策略。这一新策略有望通过设计线粒体靶向性抗氧化剂及减少线粒体膜电位的药物来实现。 

寻找具有抗氧化损伤能力的物质以用于治疗或预防例如心血管病、癌症、肝病、糖尿病及其并发症以及衰老等慢性病是本领域技术人员所期待的。 

发明内容

本发明的目的在于寻找具有抗氧化损伤能力的物质以用于治疗或预防例如心血管病、癌症、肝病、糖尿病及其并发症以及衰老等慢性病。本发明人发现从黄蜀葵花提取得到的单体化合物黄蜀葵花苷C以及包含该化合物的提取物具有明显的抗氧化损伤能力。本发明基于此发现而得以完成。 

为此，本发明第一方面提供了以下式I化合物： 

或其药学可接受的盐、溶剂合物、酯、前药。 

根据本发明第一方面的化合物，其为3，3′，4′，5，5′，7，8-七羟基黄酮-8-O-β-D-葡萄糖醛酸(即，3，3′，4′，5，5′，7，8-hepthydroxyl flavone-8-O-β-D-glucuronopyranoside)或其药学可接受的盐、溶剂合物、酯、前药。在一个实施方案中，所述化合物的药学可接受的盐是碱金属盐或碱土金属盐，例如钾盐、钠盐、镁盐等。 

本发明第二方面提供了一种黄蜀葵花提取物，其中包含本发明第一方面所述的化合物。 

根据本发明第二方面的提取物，其是黄蜀葵花用浓度大于50％(优选大于60％，优选大于70％，例如70-99％，例如80-98％，例如90-98％，例如约95％)的乙醇溶液提取得到的。 

根据本发明第二方面的提取物，其是黄蜀葵花用浓度大于50％(优选大于60％，优选大于70％，例如70-99％，例如80-98％，例如90-98％，例如约95％)的乙醇溶液，经加热(例如回流)提取，提取液经回收溶剂后得到的。 

根据本发明第二方面的提取物，其是黄蜀葵花用浓度大于50％的乙醇溶液，经加热提取，提取液经回收溶剂后，在大孔吸附树脂(例如D101树脂)柱上洗脱得到的。在一个实施方案中，所述洗脱处理是依次用以下溶剂洗脱：(a)水或浓度低于40％的乙醇、(b)40-85％乙醇(例如60-80％乙醇，例如约70％乙醇)、(c)85-99％乙醇，其中(b)洗脱级分经干燥后得到的本发明提取物。 

根据本发明第二方面的提取物，其中含有大于0.01％(例如0.01-30％，例如0.01-20％，例如0.01-10％，例如0.05-10％，例如0.1-10％)的本发明第一方面所述的化合物。 

本发明第三方面提供了制备本发明第二方面所述提取物的方法，其包括以下步骤： 

(i)使黄蜀葵花用浓度大于50％(优选大于60％，优选大于70％，例如70-99％，例如80-98％，例如90-98％，例如约95％)的乙醇溶液，提取液除溶剂，干燥，即得提取物；以及，任选进一步地 

(ii)使步骤(i)所得产物在大孔吸附树脂(例如D101树脂)柱上依次用以下溶剂洗脱：(a)水或浓度低于40％的乙醇、(b)40-85％乙醇(例如60-80％乙醇，例如约70％乙醇)、(c)85-99％乙醇，其中(b)洗脱级分经干燥后，得到提取物。 

根据本发明第三方面的方法，其中使用浓度大于50％(优选大于60％，优选大于70％，例如70-99％，例如80-98％，例如90-98％，例如约95％)的乙醇溶液提取黄蜀葵花，得到提取物。 

根据本发明第三方面的方法，其中使用浓度大于50％(优选大于60％，优选大于70％，例如70-99％，例如80-98％，例如90-98％，例如约95％)的乙醇溶液，经加热(例如回流)提取黄蜀葵花，提取液经回收溶剂后得到提取物。 

根据本发明第三方面的方法，其中使用浓度大于50％(优选大于60％，优选大于70％，例如70-99％，例如80-98％，例如90-98％，例如约95％)的乙醇溶液，经加热(例如回流)提取黄蜀葵花，提取液经回收溶剂后，在大孔吸附树脂(例如D101树脂)柱上洗脱得到的。 在一个实施方案中，所述洗脱处理是依次用以下溶剂洗脱：(a)水或浓度低于40％的乙醇、(b)40-85％乙醇(例如60-80％乙醇，例如约70％乙醇)、(c)85-99％乙醇，其中(b)洗脱级分经干燥后得到的本发明提取物。 

根据本发明第三方面的方法，其得到的提取物中含有大于0.01％(例如0.01-30％，例如0.01-20％，例如0.01-10％，例如0.05-10％，例如0.1-10％)的本发明第一方面所述的化合物。 

本发明第四方面提供了一种组合物，其包含本发明第一方面所述化合物或者本发明第二方面所述提取物，以及任选的生理学可接受的载体。 

根据本发明第四方面的组合物，其选自：药物组合物、保健品组合物、保健食品组合物。 

根据本发明第四方面的组合物，其可用作抗氧化损伤剂。 

根据本发明第四方面的组合物，其可用于治疗或预防与氧化损伤有关的疾病或病症。 

根据本发明第四方面的组合物，其可用于治疗或预防包括但不限于下列的慢性病：心血管病、癌症、肝病、糖尿病及其并发症，以及衰老。 

本发明第五方面提供了本发明第一方面所述化合物或者本发明第二方面所述提取物在制备抗氧化损伤剂的产品中的用途。 

本发明第五方面还提供了本发明第一方面所述化合物或者本发明第二方面所述提取物在制备用于治疗或预防与氧化损伤有关的疾病或病症的产品中的用途。 

本发明第五方面还提供了本发明第一方面所述化合物或者本发明第二方面所述提取物在制备用于治疗或预防包括但不限于下列的慢性病：心血管病、癌症、肝病、糖尿病及其并发症，以及衰老的产品中的用途。 

根据本发明第五方面的用途，其中所述的产品是药品、保健品、保健食品。 

本发明第六方面提供了在有需要的受试者中抗氧化损伤的方法，其包括给所述受试者施用抗氧化损伤有效量的本发明第一方面所述化合物或者本发明第二方面所述提取物。 

本发明第六方面还提供了在有需要的受试者中治疗或预防与氧化损伤有关的疾病或病症的方法，其包括给所述受试者施用治疗或预防有效量的本发明第一方面所述化合物或者本发明第二方面所述提取物。 

本发明第六方面还提供了在有需要的受试者中治疗或预防包括但不限于下列的慢性病：心血管病、癌症、肝病、糖尿病及其并发症，以及衰老的方法，其包括给所述受试者施用治疗或预防有效量的本发明第一方面所述化合物或者本发明第二方面所述提取物。 

本发明任一方面的任一实施方案所具有的特征同样适用于该方面的其它任一实施方案，本发明任一方面或其任一实施方案所具有的特征同样适用于其它任一方面或该其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾；当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。 

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。 

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。 

在本发明中，任一数值范围均包括该数值范围的任一子范围或该数值范围内的任一具体数值。例如在提及本发明提取物含有0.01-30％的本发明第一方面所述的化合物时，所述0.01-30％包括该数值范围内的任一子集或任一具体数值，例如0.01-30％包括但不限于：0.01-20％、0.01-10％、0.05-10％、0.1-10％，等等。 

由于本发明已经用单体化合物验证了其对本发明所述具有如下作用：(1)抗氧化损伤，(2)治疗或预防与氧化损伤有关的疾病或病症，(3)治疗或预防包括但不限于下列的慢性病：心血管病、癌症、肝病、糖尿病及其并发症以及衰老，因此本发明化合物可以是任何来源的，例如它们可以各自独立地是化学合成的(包括全合成或半合成)或者是通过从植物中提取得到的，由此包括该化合物的提取物预期同样具有相应的药理学作用。。 

在本发明的任一方面，所述的化合物或提取物或组合物用于发挥治疗和/或预防本发明所述疾病或病症的目的时，无论如何其是以治疗和/或预防有效量的剂量使用或配制的。例如对于本发明的药物组合物，其中的有效剂量可以根据本领域技术人员公知的医药情境作适当处理，例如对于单位剂量的药剂，对于每个单位剂量药剂中活性成分较少时，可以通过使用多个单位剂量药剂而得到期望的效果；又如在本发明提及的“有效量”，该有效量是这些化合物、提取物或组合物以足以产生期待效果的量提供给所述哺乳动物。在本发明的一个实施方案中，达到有效的治疗和/或预防的剂量，不论给予的是单一化合物、提取物或药物组合物，此剂量折算成黄蜀葵花药材，相当于药材0.001-50g/kg体重/ 天，优选0.01-25g/kg体重/天，更优选0.1-10g/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中，为达到有效的治疗和/或预防的剂量，当以本发明所述化学单体计时，其可以是0.001-100mg/kg体重/天，优选0.01-100mg/kg体重/天，或者优选0.1-100mg/kg体重/天，或者优选0.001-10mg/kg体重/天，或者优选0.001-1mg/kg体重/天，或者优选0.01-10mg/kg体重/天，或者优选0.1-1mg/kg体重/天，或者优选1-10mg/kg体重/天。此外，临床医生会根据诸多因素来确定具体的使用剂量，这些因素例如年龄、性别、一般健康状况、疾病的种类和严重程度等。无论如何，本领域技术人员根据本发明公开可以容易地确定具体情况下的使用剂量。 

本文中使用的术语“提取物”，是指由植物药材黄蜀葵花经提取而得到的提取物，其中至少包含本发明所述式I化合物，例如黄蜀葵花苷C。需要说明的是，该提取物中还可以包含黄蜀葵花中原本存在的其它物质，这些其它物质是本领域已知的。 

本领域技术人员已知，测定药材或提取物中的式I化合物的含量，这些测定方法是容易获得的，例如可以参考现有技术文献报道的方法或者适当作些调整。在本发明中，可以采用以下条件的HPLC法来测定本发明提取物或组合物中的式I化合物的量：色谱柱：Hypersil-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙睛/水＝45/55；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：10μL；柱温30℃。在本发明中，当需要定性或定量表征本发明式I化合物时，或者需要以制备型HPLC法进行单体化合物的制备时，如未另有说明，均是采用该HPLC方法。 

如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。 

如本文所述的，术语“药物组合物”，是指可用于在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病、病症、症状的物质。在特别的实施方案中，该“药物组合物”可以与“组合物”互换使用。 

如本文所述的，术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物和提取物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病、病症、症状的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。 

如本文所述的，术语“疾病或症状”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病或症状有关。 

如本文所述的，“％”，如未特别指明，对于总物料是固体时一般是指重量/重量的百分比，对于总物料是液体时一般是指重量/体积的百分比。当然，对于总物料是液体并且 溶质是液体时，表征该液态溶质的百分比一般是指体积/体积的百分比。 

本发明药物组合物中使用的“药学可接受的载体”可以是药物制剂领域中任何常规的载体。特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。 

本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、注射乳剂(注射用无菌粉针)等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。 

实施例1：本发明提取物和式I化合物的制备 

步骤1：取黄蜀葵花的干燥花(2.8kg)，用10、8、8倍量的95％EtOH溶液依次加热回流提取3、2、2h，合并滤液，减压回收溶剂，于50℃下真空干燥，得95％乙醇提取物(648g，23.14％)，此提取物可用作下文试验例中的试药。 

步骤2：取上述步骤1所得95％乙醇提取物500g，经D101大孔吸附树脂处理(水→70％EtOH→95％EtOH)，分别得到水洗脱物(220g，10.2％)、70％乙醇洗脱物(120g，5.55％)和95％乙醇洗脱物(22g，1.02％)。其中各洗脱物可用作下文试验例中的试药，特别是70％乙醇洗脱物可用作下文试验例中的试药。 

步骤3：上述步骤2所得70％乙醇洗脱物(96g)经硅胶柱层析[CHCl₃-MeOH(100∶3→10∶1，v/v)→CHCl₃-MeOH-H₂O(7∶3∶1→6∶4∶1，v/v/v，下层)→MeOH]洗脱，共得到9个洗脱组分[9个洗脱组分依次为：Fr.1(1.0g)、Fr.2(2.5g)、Fr.3(4.2g)、Fr.4(4.7g)、Fr.5(16.0g)、Fr.6(22.0g)、Fr.7(23.2g)、Fr.8(12.2g)、Fr.9(6.2g)]。其中各洗脱物可用作下文试验例中的试药。特别是洗脱组分Fr.9可用作下文试验例中的试药。 

步骤4：上述步骤3所得Fr.9经Sephadex LH-20柱层析[MeOH-H₂O(1∶1，v/v)]，得到12个组分[Fr.9-1～9-12]。其中Fr.9-6经制备型高效液相色谱分离制备[MeOH-H₂O(35∶65，v/v)+1％HAC]，得到了黄蜀葵花苷C为200mg。使用常规盐化方法，使得到的黄蜀葵花苷C用氢氧化钠盐化得到其钠盐。 

实施例2：黄蜀葵花苷C的结构鉴定和理化性质 

实施例1步骤4得到的黄蜀葵花苷C：无定形黄色粉末。254nm紫外灯下为一黄色暗斑，10%硫酸乙醇液显色呈棕黄色，推测可能为黄酮类化合物。其比旋光度为负值([α]_D²⁵：+49.0°，MeOH)。高分辨Q-TOF-ESI-MS给出其准分子离子峰m/z 509.0554[M-H]^-，确定其分子式为C₂₁H₁₈O₁₅。红外光谱所提供的信息显示结构中存在羟基(3342cm^-1)、不饱和酮基(1652cm^-1)、芳香环(1607、1511、1418cm^-1)。紫外光谱进一步提示黄酮醇骨架的存在(305，255nm)。在¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)谱中低场区δ12.44(1H，br.s)提示结构中5位存在1个酚羟基；由芳香区δ7.44(2H，s)为一尖锐单峰可推测B环为1,3,4,5-或1,2,4,6对称四取代自旋耦合系统；δ6.25(1H，s)为一尖锐单峰，推测其可能为A环6位质子信号。另外，高场区糖端基信号δ4.71(1H，d，J=7.6Hz)及糖上其它质子信号δ3.58(1H，d，J=9.2Hz)、3.44(1H，m)、3.40(1H，m)、3.32(1H，m)与¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)中一组相关碳信号(δ_C：71.6、73.9、75.5、75.9、106.0、171.3)推测结构中连有1个β-D-葡萄糖醛酸片段。此外，在HMBC谱中可以观测到H-6[δ_H6.25(1H，s)]与C-10(δ_C102.7)、C-8(δ_C125.0)、C-5(δ_C156.3)及C-7(δ_C156.2)、H-2′,6′[δ_H7.44(2H，s)]与C-1′(δ_C120.4)、C-4′(δ_C135.9)、C-3′,5′(δ_C145.5)及C-2(δ_C147.9)、H-1″[δ_H4.71(1H，d，J=7.6Hz)]与C-8(δ_C125.0)、5-OH质子[δ_H11.92(1H，s)]与C-6(δ_C98.2)、C-10(δ_C102.7)、C-5(δ_C156.3)之间的远程相关。该化合物经5%H₂SO₄水溶液-1,4-二氧六环(1:1，v/v)酸水解，水解后的糖产物经CMEH处理后BSTFA衍生化，再通过GC对其噻唑烷衍生物进行分析，确定了结构中连接糖为D-葡萄糖醛酸。综上所述，确定黄蜀葵花苷C的结构为3,3′,4′,5,5′,7,8-七羟基黄酮-8-O-β-D-葡萄糖醛酸(3,3′,4′,5,5′,7,8-hepthydroxyl flavone-8-O-β-D-glucuronopyranoside)。其中黄蜀葵花苷C的 ¹H-¹H COSY以及HMBC相关结构示意如下： 

黄蜀葵花苷C的理化性质： 

黄色粉末。[α]_D²⁵+49.0°(浓度0.31，MeOH)。 

IRλ_max(KBr)cm^-1：3342、2911、1721、1652、1607、1568、1511、1418、1329、1252、1202、1174、1072、1023、979、839、794。 

UVν_max(MeOH)nm(logε)：305(3.79)、255(4.14)。 

HR-ESI-TOF-MS：负离子模式m/z 509.0554[M-H]^-(计算值，C₂₁H₁₇O₁₅，509.0552)、545.0342[M+Cl]⁺(计算值，C₂₁H₁₈O₁₅Cl：545.0340)。 

¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)：δ3.44(1H，m，重叠，H-2″)、3.58(1H，d，J＝9.2Hz，H-5″)、3.33(1H，m，重叠，H-3″)、3.38(1H，m，重叠，H-4″)、4.71(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)、6.25(1H，s，H-6)、7.44(2H，s，H-2′，6′)、12.44(1H，br.s，5-OH)。 

¹³C-NMR(DMSO-d₆，100MHz)：δ_C：147.9(C-2)、135.5(C-3)、175.6(C-4)、156.3(C-5)、98.2(C-6)、156.2(C-7)、125.0(C-8)、148.2(C-9)、102.7(C-10)、120.4(C-1′)、107.7(C-2′)、145.5(C-3′)、135.9(C-4′)、145.5(C-5′)、107.7(C-6′)、106.0(C-1″)、73.9(C-2″)、75.5(C-3″)、71.6(C-4″)、75.9(C-5″)、171.3(C-6″)。 

试验例1：黄蜀葵花95％乙醇提取物及化学成分抗氧化作用研究 

HepG2细胞为人肝癌细胞，因其保存了很多正常人肝细胞的代谢特点，包括合成和分泌血浆蛋白，而被广泛用作研究药物作用机制、毒性/细胞保护、遗传毒性/抗遗传毒性 等肝保护实验的体外模型。叔丁基过氧化氢(tert-butylhydroperoxide，t-BHP)可以被细胞色素P450等代谢为活性自由基，后者可以进一步产生活性氧自由基，从而引起脂质过氧化反应，造成细胞损伤。 

试验方法：将细胞接种于96孔板，1×10⁴细胞/孔，每组5个复孔，培养24h，加入实施例1步骤1所得黄蜀葵花95％乙醇提取物和黄蜀葵花苷C。另设正常对照组(即未用t-BHP处理亦未给药的试验组)、模型组(即用t-BHP处理但未给药的试验组)。加样20h后，除正常对照组外，其余各组加入t-BHP至浓度为0.5mmol/L，损伤7小时后，MTT法测定各组细胞的存活率。 

将细胞接种于96孔板，3×10⁴细胞/孔，每组5个复孔，培养24h，加入实施例1步骤1所得黄蜀葵花95％乙醇提取物和黄蜀葵花苷C。另设正常对照组、模型组。加样20h后，除正常对照组外，其余各组加入t-BHP至浓度为0.5mmol/L，损伤5小时后，小心吸掉细胞上清液，加入新鲜培养液培养12h，吸除上清液，超声破碎细胞，测定细胞内GSH含量。 

将细胞接种于24孔板，2.5×10⁵细胞/孔，每组4个复孔，培养24h，加入实施例1步骤1所得黄蜀葵花95％乙醇提取物和黄蜀葵花苷C。另设正常对照组、模型组。加样20h后，除正常对照组外，其余各组加入t-BHP至浓度为0.5mmol/L，损伤5小时后，小心吸掉细胞上清液，加入新鲜培养液培养12h，取上清液200μl测定MDA含量，400μlPBS超声破碎细胞，取200μl测定CAT活力，50μl测定SOD活力。 

试验数据以均数±标准差 表示，采用SPSS11.5软件包进行统计学处理，显著性水平以0.05为标准。试验结果见表1。 

表1： 

^＊＊＊P＜0.001，^＊＊P＜0.01，^＊P＜0.05，与t-BHP处理的模型组比较。 

t-BHP可使HepG2细胞活力下降，细胞内SOD、CAT活力和GSH含量明显下降，细胞内MDA含量上升。黄蜀葵花95％醇提取物(经测定，该试药中含有0.05％的黄蜀葵 花苷C)、黄蜀葵花苷C可抑制t-BHP所致细胞活力的下降，可不同程度的抑制t-BHP所致GSH的降低，抑制受损的HepG2细胞上清液中MDA的升高、提高细胞内GSH含量和CAT、SOD活力、具有很强的抗氧化活性。 

另外，发明人在与上述实验例1相同方法的另外试验中，分别使用了实施例1步骤2所得70％乙醇洗脱物(经测定，该试药中含有0.21％的黄蜀葵花苷C)、步骤3所得洗脱组分Fr.9(经测定，该试药中含有3.2％的黄蜀葵花苷C)二者作为试药进行测试，两种试药的剂量以所含黄蜀葵花苷C计，与表1中95％乙醇提取物试验组具有等当剂量的黄蜀葵花苷C。结果两种试药的4个测试参数(细胞存活率、细胞内GSH、MDA、CAT)的结果与t-BHP处理的模型组比较均为^＊＊P＜0.01，而SOD值与t-BHP处理的模型组比较均为^＊P＜0.05。